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摘要：马铃薯病毒通过造成显着的产量损失而成为限制豆类生产的主要因素。在布基纳法索调查了感染班巴拉花生 ( Vigna subterranea ) 的马铃薯病毒。从三个农业气候区收集的叶片样品进行 RT-PCR 和序列分析。在总共135个样本中，36个（26.67%）在使用马铃薯病毒通用引物的RT-PCR检测中呈阳性。对来自 24 个分离株的完整外壳蛋白 (cp) 序列的分析揭示了三组感染班巴拉花生的马铃薯病毒的发生。第 1 组的病毒分离株与 CABMV 具有94.5 % - 100% 的核苷酸 ( nt ) 同一性，而第 2 组和第 3 组中的分离株是远缘豆常见坏死病毒 （BCMNV）和西番莲病毒乌干达，它们是它们各自最接近的马铃薯病毒。第2组与 BCMNV共享 77.1% nt和 78.8 % - 79.9% aa 同一性，第 3 组与乌干达西番莲病毒共享 77.3 % - 78.3% nt和 80.7 % - 81.5% aa 同一性。所有三组均通过系统发育分析得到证实。考虑到马铃薯病毒分界标准，第 1 组分离株属于 CABMV 物种。第 2 组和第 3 组被分配到一种潜在的新马铃薯病毒物种，并命名为班巴拉花生马铃薯病毒1 (BGPV1) 和班巴拉花生马铃薯病毒 2 (BGPV2)。

 

关键词

 

.班巴拉 花生,马铃薯 病毒,表征,外壳 蛋白 序列,多样性;

 

 

一、简介

 

班巴拉花生是布基纳法索最经济的重要豆类作物之一。除了是农民的收入来源外，它还是一种重要的能量来源（387 kcal/100g），有助于对抗营养不良和营养不良 [ 1 ]。其蛋白质含量高，超过 19% [ 2] 使其成为可以在贫困人口中替代动物蛋白的食品。然而，它的生产面临着巨大的限制，其中病毒性疾病是最重要的疾病之一。全球报告的有关植物的主要病毒包括豇豆轻度斑驳病毒（CPPMV，carlavirus），Voandzeia 花叶坏死病毒（VMNV，tymovirus），豇豆斑驳病毒（CPMoV，carmovirus），南方豆花叶病毒（SBMV，sobemovirus），黄瓜花叶病毒病毒（CuMV，cucumovirus）以及多种马铃薯病毒，即豇豆蚜虫传播的花叶病毒（CABMV）、豆类常见花叶病毒黑眼病毒株（BCMV-BlCM）、Voandzeia扭曲花叶病毒（VDMV）、花生斑驳花叶病毒（ PnMV) [ 3 ] [ 4]。Potyvirus 属病毒是导致豇豆产量损失在 13% 和 100% 之间，从而导致班巴拉花生产量减少的主要因素 [ 5 ] [ 6 ]。马铃薯病毒主要通过蚜虫载体和病毒污染的种子传播，这使其难以控制。在布基纳法索，一些关于 CABMV 和 BCMV-BlCM 表征的研究是在 Bambara 花生中进行的 [ 4 ] [ 7 ]。然而，这些研究中只包括很少的病毒分离株，这对评估马铃薯病毒多样性的帮助有限。本研究的目的是在布基纳法索鉴定 Bambara 花生感染马铃薯病毒，并根据完整外壳蛋白 (cp) 序列的分析来表征它们的分子多样性。

 

二、材料与方法

 

2.1。样品收集

 

从 2016 年到 2018 年以及 8 月到 10 月的生长季节，从布基纳法索三个农业气候区的农民田间采集了 135 个有症状的班巴拉花生叶样本。农业气候区包括年降雨量900-1100毫米的苏丹区、苏丹-萨赫勒区（600-900毫米）和萨赫勒区（小于600毫米）。为了覆盖病毒的多样性，采样点至少相隔 3 公里。在苏丹地区和苏丹-萨赫勒地区收集了 100 个样本（每个地区 50 个样本），而 35 个样本来自萨赫勒地区。叶样品在被转移到实验室之前被保存在冰上，在分子分析之前它们被储存在-80˚C。

 

2.2. 总 RNA 提取

 

135 个样品的总 RNA 根据 [ 8]。在提取之前，研钵首先在 180°C 下灭菌 2 小时，然后在 -80°C 下保存直至使用。简而言之，按照以下步骤进行 RNA 提取：首先，将粉碎的叶子转移到 2 ml Eppendorf 管中，加入 1 ml Trizol 以释放细胞内容物；其次，加入 200 µl 氯仿。将试管置于冰上 5 分钟，然后在 4°C 下以 14,000 rpm 的转速离心 15 分钟。通过添加 550 μl 冷异丙醇并将管在 -20°C 下保持 30 分钟来沉淀 RNA。最后，将试管以 12,000 rpm 的转速离心 10 分钟，并用 75% 乙醇洗涤沉淀。总 RNA 悬浮在 30 µl 无菌水中。在-20˚C 储存前，检查 RNA 质量并通过 nanodrop 测量浓度。

 

2.3. 通过 RT-PCR 检测马铃薯病毒

 

使用通用马铃薯病毒引物 P077-F：ATGGTHTGGTGYATHGARAAYGG 和 P078-R：CARATGAARGCCMGCAGCA [ 9 ]，在 RT-PCR 测定中进行马铃薯病毒的检测。根据供应商的建议，使用反向 oligodT 引物和酶 M-MLV-RT (200 U) (Promega, USA) 从提取的 RNA 中获得病毒 cDNA。在 25 µl 的总体积中进行逆转录，其中包含 1 µl 总 RNA、1 µl 10 mM oligodT、5 µl M-MLV RT 5X Buffer、1 µl 10 mM dNTP、200 U M-MLV-RT 和无菌水。

 

根据供应商的说明，使用 Solis Biodis PCR 试剂盒进行 PCR 扩增。25 μl 反应体积，包含 2 μl cDNA、2.5 μl 10x PCR 缓冲液、0.5 μl 10 mM dNTP、2.5 μl 25 mM MgCl 2, 0.5 μl 每种引物 P077-F 和 P078-R (10 μM) 和 0.5 U 酶 FIREPol DNA 聚合酶，经受以下循环条件：95°C 5 分钟，然后 35 个循环 94°C 1 分钟, 55°C 30 秒，72°C 伸长 1 分钟，最后一个伸长步骤在 72°C 进行 10 分钟。通过在含有溴化乙锭的 1% (w/v) 琼脂糖凝胶上电泳分析扩增片段，并在 UV 下观察以验证扩增片段的大小。对预期大小的片段 (327 bp) 进行测序，并将序列与 GenBank (NCBI) 数据库进行对比。

 

2.4. 马铃薯病毒完整外壳蛋白基因测序

 

马铃薯病毒检测呈阳性的样品用于扩增完整的cp基因。因此，如[ 4 ]所述，使用引物组合P105-F/P078-R和P077-F/P106-R（表1 ）进行独立PCR。针对 GenBank NCBI 对预期大小的片段进行测序、组装和爆破。根据获得的序列并考虑 GenBank 数据库中密切相关的马铃薯病毒序列，设计了新的引物（表 1 ）。使用表1中所示的新设计的引物和条件，如上所述进行独立的PCR扩增。使用相应的引物对直接对预期大小的扩增子进行测序。

 

2.5. 序列分析

 

使用 DNAMAN 软件编辑和组装所有序列重叠群以

 

 

生成完整的 CP 序列。通过 Blastn NCBI (BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 将 cp 序列与 GenBank 数据库序列进行比较。使用 SDT v1 软件 [ 10 ]确定查询和检索序列之间的核苷酸和蛋白质序列同一性。使用 Seqinr [ 11 ]确定相对同义密码子使用 (RSCU) 。

 

使用 MEGA 6 软件 [ 12 ]从完整的 CP 序列重建系统发育树。在 Clustal 比对后，使用 TN93 + G + I 和蛋白质 JTT + G + I 核苷酸替换模型将最大似然 (ML) 方法应用于系统发育树重建，自举 1000 次重复。用Mega 6软件测定了本研究鉴定的不同马铃薯病毒组之间的氨基酸组成和核苷酸多样性。

 

3. 结果

 

3.1。班巴拉花生中的马铃薯病毒检测

 

如图 1所示，在使用马铃薯病毒通用引物检测班巴拉花生中马铃薯病毒的 RT-PCR 测试中获得了预期大小 (327 bp) 的扩增子。与blast NCBI [ 13 ] 分析相关的通用马铃薯病毒引物[ 9 ]在分析的135 个样本中的36 个分离株中有效检测马铃薯病毒，表明病毒流行率约为26.7%。其中 20 株（20/50 样本）来自苏丹地区（40% 流行），16 株（16/50 样本）来自苏丹-萨赫勒地区（30% 流行），而在萨赫勒地区未检测到阳性样本区。这种分布使苏丹地区成为该国受班巴拉花生病毒感染最严重的地区。

 

3.2. Potyviruses外壳蛋白序列中的核苷酸多样性

 

从 36 个阳性样品中的 24 个分离株获得完整的 CP 序列，用于马铃薯病毒检测。由于相应测序数据的质量不足，无法从剩余的分离株中获得完整的 CP 序列。将 24 个完整的 CP 序列提交到 Genbank 数据库（表 2）。

 

 

 

图 1。使用 1% 琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色对 RT-PCR 扩增的马铃薯病毒产物进行分级分离。EB：示例代码；M：100 bp DNA 大小标记；T+ 和 T-：分别为阳性和阴性对照。

 

 

外壳蛋白序列的核苷酸和氨基酸分析显示出高度的病毒多样性。如表3所示，三组称为第1组（7个分离株）、第2组（4个分离株）和第3组（13个分离株）的马铃薯病毒序列进行了区分。组内核苷酸同一性在组 1、组 2 和组 3 中分别为 94.6% - 100%、93.7% - 100% 和 94.2% - 100%。各组均出现较高的氨基酸同一性，第 1 组达到 97.8% - 100%、97.7% - 100%（第 2 组）和 97.8% - 100%（第 3 组）。组间核苷酸和氨基酸同一性的百分比显着降低。在核苷酸水平上，第 1 组中的分离株与第 2 组或第 3 组中的分离株具有大约 72% - 74% 的同一性。第 2 组和第 3 组之间的核苷酸同一性介于 75.8% 和 77.7% 之间。进一步的组间比较表明，核苷酸和氨基酸同一性都显示出相似的趋势。

 

当前研究中的分离株还与 Genbank 数据库中最接近的病毒分离株进行了比较。如表 3所示，第 1 组中的分离株仅在核苷酸 (94.6% - 100%) 和氨基酸 (97.8% - 100%) 水平上与 CABMV 分离株共享高序列同一性。与任何最接近的分离物的核苷酸或氨基酸同一性百分比低于 77%。第 2 组中的分离株仅显示 70.6% 至 77.7% 的 nt 同一性，与组外任何最接近的病毒分离株的 aa 同一性不到 80%。最高的核苷酸同一性（76.9% -

 

 

*CABMV：豇豆蚜传花叶病毒；BCMNV：豆类常见花叶坏死病毒；BCMV：豆类常见花叶病毒；UPV：乌干达西番莲病毒；PaChV：西番莲萎黄病病毒。第 1 组（MK987189；MK987190；MK987191；MK987192；MK987193；MK987194；MK987195）；第 2 组（MK987196；MK987197；MK987198；MK987199）；第 3 组（MK987200；MK987201；MK987202；MK987203；MK987204；MK987205；MK987206；MK987207；MK987208；MK987208；MK987209；MK987210；MK987211；MK987212）。

 

77.1%) 和氨基酸同一性 (78.4% - 79.9%) 与豆常见花叶坏死病毒 (BCMNV)。此外，第 2 组分离株具有与 BCMNV (786 bp) 相似的 780 bp 核苷酸序列。其他两组的分离株有 828 bp，相差 48 bp。在第 3 组分离株中，与乌干达西番莲病毒 [J896003] 的核苷酸同一性 (77.3% - 78.3%) 和氨基酸同一性 (80.7% - 81.5%) 最高。

 

3.3. 外壳蛋白特征和相对同义密码子使用

 

在所有三组中都发现了 20 个氨基酸，但第 2 组分离物中的 CP 序列由 259 个氨基酸组成，比其他两组 (275 个氨基酸) 少 16 个氨基酸。所有 CP 氨基酸序列都显示出在大多数马铃薯病毒中保守的 N 末端 DAG 基序。

 

表 4总结了三个马铃薯病毒组的密码子利用偏差。马铃薯病毒组之间的密码子利用偏差在所有简并氨基酸中都很明显。三组马铃薯病毒在某些氨基酸中共享相同的首选密码子。然而，在某些情况下，额外的优选密码子区分了三组马铃薯病毒。例如，在亮氨酸中，三组具有不同的密码子偏好，组 1 更喜欢 CUU，组 2 更​​喜欢 UUG，组 3 更喜欢 CUG。然而，在大多数氨基酸中，组 2 和组 3 具有

 

 

aRSCU：班巴拉花生马铃薯病毒第 1 组 (G1)、第 2 组 (G2) 和第 3 组 (G3) 中的相对同义密码子使用情况。最优选的密码子以粗体显示。

 

相同的偏好。第 1 组马铃薯病毒也不同于第 2 组和第 3 组，甘氨酸优选使用 GGG 密码子，丝氨酸优选使用 UCU。马铃薯病毒组之间的另一个区别在天冬酰胺（第 1 组中的 AAC 与第 2 组和第 3 组中的 AAU）和组氨酸（第 1 组和第 2 组中的 CAC 相对于第 3 组中的 CAU）的首选密码子使用方面很明显。在不使用特定氨基酸密码子的组中观察到马铃薯病毒组之间最明显的差异。这以第 1 组中的密码子 UGU (Cys)、第 2 组中的密码子 UGC (Cys) 和 CGC (Arg) 以及第 3 组中的密码子 CGA (Arg) 和 UCC (Ser) 为例。

 

3.4. 班巴拉花生马铃薯病毒的系统发育多样性

 

对 24 个分离株的核苷酸和蛋白质序列以及从 GenBank 检索到的同源序列进行的系统发育分析清楚地区分了对应于前面描述的三组马铃薯病毒的进化枝（图 2）。在基于核苷酸和蛋白质的系统发育中

 

 

 

图 2。使用外壳蛋白的核苷酸和氨基酸序列重建系统发育树。根据核苷酸树 (A) 的 Tamura-Nei 模型和氨基酸树 (B) 的 Jones-Taylor-Thornton 模型应用最大似然法。本研究中表征的序列以彩色显示，Genbank 数据库中相应的登录号由字母 MK 后跟 6 位数字表示。PFWV：百香果木质病毒；BCMNV：豆类常见花叶坏死病毒；CABMV：豇豆。蚜虫传播的花叶病毒；PnMV：花生斑驳病毒；BlCMV：黑眼豇豆花叶病毒；BCMV，豆类常见花叶病毒；UPV：乌干达西番莲病毒；PaChV：西番莲萎黄病病毒。

 

树，第 1 组分离株仅与 CABMV 分离株聚集。值得注意的是，该 CABMV 组还包括最近从布基纳法索的班巴拉花生中鉴定出的两个分离株（MF277031 和 MF277034）[ 4 ]。第 2 组和第 3 组形成了两个新的集群，其中不包括任何已知的病毒分离物。因此，第 2 组和第 3 组分别被称为班巴拉花生马铃薯病毒 1 (BGPV1) 和班巴拉花生马铃薯病毒 2 (BGPV2)。

 

3.5. 班巴拉花生马铃薯病毒的地理分布

 

图 3显示了本研究中以班巴拉花生为特征的三组马铃薯病毒的地理分布。BGPV1 分离株仅在苏丹地区发现，而 CABMV 和 BGPV2 分离株均在苏丹和苏丹-萨赫勒地区发现。然而，在两个农业气候区之间观察到了差异。CABMV 分离株在苏丹萨赫勒地区（25% 的分离株）比苏丹地区（8.3%）最常见。相比之下，大多数 BGPV2 分离株（29.2%）是在苏丹地区发现的，而只有 4.2% 的分离株来自苏丹萨赫勒地区。总之，所有三个病毒组都在苏丹地区发现，该地区拥有 70% 的病毒分离株。

 

4。讨论

 

使用广泛使用的马铃薯病毒通用引物 [ 4 ] [ 9 ] [ 14 ] [ 15 ]，通过 RT-PCR 从班巴拉花生的田间样品中清楚地检测到马铃薯病毒属病毒。此外，CP基因测序和序列分析证实病毒分离株属于马铃薯病毒属。此外，所有蛋白质序列都显示在它们的 N 末端，即已知在蚜虫可传播的马铃薯病毒中保守的 DAG 基序 [ 16 ] [ 17 ]。

 

 

 

图 3。布基纳法索班巴拉花生马铃薯病毒的地理分布。CABMV，豇豆蚜传花叶病毒；BGPV，班巴拉花生马铃薯病毒。

 

对完整 CP 序列的分析导致将病毒分离物分为三组，这通过系统发育和相对同义密码子使用 (RSCU) 分析得到证实。据报道，RSCU 是一种特定于物种的统计数据 [ 18 ]。因此，它可能对物种描述有用。根据国际病毒分类委员会马铃薯病毒划分标准，如果病毒在cp基因中的核苷酸同一性大于76% - 77%且CP蛋白同一性大于82%，则属于同一物种[ 19 ][ 20 ]]。因此，第 1 组分离株与具有核苷酸同一性的 CABMV 密切相关。基于这些标准，所有三个马铃薯病毒组都代表了不同的病毒种类。来自第 1 组的病毒分离物在核苷酸和氨基酸水平上与 CABMV 共享超过 94%。因此，它们被认为是 CABMV 分离株。CABMV 分离株的系统发育分析揭示了一些种内多样性，由此来自本研究的分离株分为两组。这与早期对 Bambara 花生 CABMV 分离株的研究一致 [ 4 ]。

 

与第 1 组不同，第 2 组和第 3 组中的分离株与任何特定的病毒种类没有密切关系。一方面，来自第 2 组的分离株与 BCMNV 或西番莲萎黄病毒具有 77% 的核苷酸同一性，但它们与这两种病毒的氨基酸同一性不超过 79%，明显低于 82% 的分界限制。另一方面，来自第 3 组的分离株与其最接近的病毒物种（西番莲病毒乌干达 [J896003]）的 nt 同一性不超过 78.3%，aa 同一性不超过 81.5%。总之，第 2 组和第 3 组中的 Bambara 花生马铃薯病毒以不同的马铃薯病毒首次出现。因此，分别提出了班巴拉花生马铃薯病毒 1 (BGPV1) 和班巴拉花生马铃薯病毒 2 (BGPV2) 的名称。

 

班巴拉花生马铃薯病毒在农业气候区的分布特点是在苏丹地区出现的病毒较多。这与在豇豆病毒中发现的结果一致 [ 15 ]。在这项研究中，如[ 4 ]先前报道的，在萨赫勒地区的班巴拉花生中没有发现马铃薯病毒。这可能是由于萨赫勒地区很少发生马铃薯病毒感染，那里的气候条件不利于蚜虫媒介种群的积累 [ 7 ]。此外，在更容易发生干旱的萨赫勒地区，班巴拉花生种植较少见。

 

5. 结论

 

在布基纳法索感染班巴拉花生的马铃薯病毒在分子水平上进行了表征。除 CABMV 外，还首次报道了 BGPV1 和 BGPV2 两种假定的新马铃薯病毒种。所有三种病毒都出现在较潮湿的苏丹地区，而在苏丹萨赫勒地区仅发现两种，在萨赫勒地区没有发现。为了更好地描述班巴拉花生马铃薯病毒，需要通过确定与确定关键生物学特性相关的完整基因组序列对 BGPV1 和 BGPV2 分离株进行进一步的分子表征。

 

致谢

 

这项研究得到了国际科学基金会 (IFS) 通过对 AE Zongo 的 C/5884-1 号奖学金的资助。我们非常感谢布基纳法索的 Labatoire Mixte International Patho Bios 提供了技术平台。

 

利益冲突

 

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

 

参考

 

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