摘要：属于“ Ebenaceae ”的Diospyros malabarica （Deshi Gab）在孟加拉国潮湿的热带气候中生长良好。为了定性和定量地研究植物成分，使用两种极性溶剂（即水和 70% 乙醇）和一种非极性溶剂（即己烷）制备D. malabarica的种子和果肉提取物。水和乙醇种子提取物获得了最大产量，表明存在于D. malabarica果实中的大多数植物成分是极性的。提取物的定性植物化学分析表明存在多种提取物中植物成分的含量。另一方面，对酚、单宁、黄酮、生物碱、皂苷、蛋白质、还原糖和维生素 C 的定量植物化学分析表明，最大量的酚、单宁、黄酮和还原糖存在于种子水提取物中。然而，在乙醇种子提取物中发现了最大量的总蛋白质和维生素 C。D. malabarica种子粉末中的生物碱含量（即13.6%）高于肉（即3.4%）。然而，与种子提取物（0.42%）相比，果肉提取物（0.74%）中皂苷的含量更高。体外还通过DPPH自由基清除试验、FRAP试验和还原能力试验研究了提取物的抗氧化特性。种子水提取物的抗氧化活性最高，其次是乙醇种子、乙醇果肉和果肉水提取物。己烷肉提取物的抗氧化活性最低。此外，分别获得了种子水和己烷果肉提取物的最低（即44.70 μg/ml）和最高（2359.66 μg/ml）IC 50值。
关键词
.黑柿,植物 化学,总 酚 含量,总 单宁 含量,总 黄酮 含量,抗氧化 活性;
一、简介
药用植物因含有萜类、黄酮类、皂苷、酚类、甾体、树脂等多种生物活性分子而具有极好的治疗效果[ 1 ][ 2 ][ 3 ]。据报道，这些植物成分提供了对抗细菌、真菌、变形虫和昆虫的防御机制。它们还充当许多生理功能的效应分子，并为许多慢性疾病提供治疗益处 [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]。在代谢过程中，自由基（即具有不成对电子的原子或分子）、活性氧（ROS）（即氧衍生的自由基，尤其是超氧阴离子） ○-2)、羟基、过氧基和烷氧基)和非自由基(即过氧化氢、次氯酸、臭氧和单线态氧)是通过各种内源性过程(即呼吸、多形核白细胞和巨噬细胞的刺激)和外源性因素(即电离辐射、吸烟、污染物、杀虫剂和有机溶剂）[ 7 ][ 8 ][ 9 ]。自由基对蛋白质、脂质和 DNA [ 10 ] 具有高度反应性，并导致各种慢性疾病和生理异常，包括炎症和自身免疫性疾病 [ 11 ]、衰老、致突变性、致癌性、改变细胞信号通路和调节基因表达 [ 12 ] [13 ]。
为了解决各种自由基和活性氧的威胁，有必要通过提供氧化还原氢来清除自由基的潜在抗氧化剂 [ 9 ]。虽然自由基可以被天然（植物来源）和合成（化学合成）抗氧化剂清除，但天然抗氧化剂越来越受到青睐，因为它们确实清除自由基而没有任何副作用 [ 14 ]。几项研究报告说，合成抗氧化剂如丁基化羟基甲苯 (BHT) 和丁基化羟基苯甲醚 (BHA) 通过 DNA 损伤和其他毒性作用显示出对人体的毒性 [ 15 ] [ 16 ]]。这些化学合成的抗氧化剂的毒性使得寻找新的天然抗氧化剂成为必要。先前发表的报告表明，已知植物来源的抗氧化剂可以通过抑制自由基反应的传播来保护人类免受多种慢性疾病的侵害，例如炎症、自身免疫性疾病、癌症和肿瘤形成 [ 17 ]。因此，本研究旨在调查柿果不同部位中天然抗氧化剂的存在。
D. malabarica 属于“Ebenaceae”科，在孟加拉国潮湿的热带气候中生长良好。它被认为具有药用价值，因为它的不同部分，例如树皮，显示出抗糖尿病 [ 18 ]、抗腹泻 [ 19 ] 和抗炎活性 [ 2 ]。以前的研究还报告说，D. malabarica 传统上用于治疗溃疡、痢疾、间歇性发热和月经周期异常 [ 18 ] [ 20 ]]。此外，未成熟的果实通常被用作治疗腹泻和痢疾的传统药物，以及在船底上涂漆以在水中提供保护，从而起到防腐剂的作用。未成熟果实的浸泡液还可用于硬化绳索，使其在水中更耐用 [ 2]。由于尚未对 D. malabarica 果实的不同部位进行广泛研究，D. malabarica 果实的不同部位可能含有具有良好抗氧化倾向的药理活性植物成分。在此，我们使用水、70% 乙醇（即极性溶剂）和己烷（即非极性溶剂）制备了 D. malabarica 种子和果肉提取物，以提取极性和非极性植物化学物质。对提取物的植物成分进行定性和定量测定。通过DPPH自由基清除试验、FRAP试验和还原能力试验研究了提取物的抗氧化活性。
2。材料和方法
2.1。化学品和试剂
购买无水甲醇、乙醇、己烷、硝酸铋和 HNO 3、H 2 SO 4、HCl、NH 3、冰醋酸、Folin-Ciocalteu试剂、Na 2 SO 4、KOH、牛血清白蛋白和酒石酸钾钠来自德国默克。氯仿、没食子酸、儿茶素、NaNO 2和NaOH购自美国Ashland Inc.。硫脲和 2,4-二硝基苯肼购自印度 Titan Biotech Ltd.。NaCl、Na 2 CO 3、碘和Cu 2 SO 4 ·5H 2 O购自UNI-CHEM，中国。单宁酸、三氯乙酸 (TCA)、AlCl 3, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), KI, 铁氰化钾, 和钼酸砷酸盐显色试剂购自 SIGMA-ALDRICH,德国。葡萄糖（葡萄糖）、FeCl 3 ·6H 2 O、乙酸钠、抗坏血酸和NaHCO 3购自中国VEGA。KCl、Na 2 HPO 4和 KH 2 PO 4购自 Scharlab，西班牙。
2.2. 样品采集和制备
D. malabarica 的未成熟果实采自孟加拉国 Mymensingh 区当地市场（24.7471˚N，90.4203˚E）并带到实验室进行分析。用水适当清洗后，将收集的D. malabarica果实的果肉和种子部分仔细分离并切成小块。然后将果肉和种子在 60˚C 的热空气烘箱中干燥，以去除溶剂（即乙醇、己烷和水）并浓缩植物成分。此后，使用搅拌机将干燥的木片研磨成粗粉，并将粉末储存在密封容器中，以在无菌条件下储存提取物，并保护提取物免受空气、水分和污染物的影响，并在阴凉处进行必要的标记和干燥的地方。
2.3. 粗提物的制备和分馏
粗提物及其储备溶液的制备是根据我们先前建立的方案 [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] 制备的]。将约 5 g 种子和肉的粉末材料放入干净的锥形瓶中，并与 100 ml 各自的溶剂混合。使用了三种溶剂，即。蒸馏水、70% 乙醇（作为极性溶剂）和己烷（作为非极性溶剂）。在以 120 rpm 轻轻摇动后，将烧瓶保持在水浴中 72 小时。然后用 Whatman No.1 滤纸过滤粗混合物，并在 60°C 蒸发溶剂。当蒸发完成后，将提取物储存在干燥阴凉的地方以备进一步研究。最后，使用 0.9% NaCl 溶液制备 1% (10,000 µg/ml) 的提取原液。
2.4. 提取物植物成分的定性筛选
2.4.1。皂苷测试（泡沫测试）
将 2 ml 蒸馏水与 1 ml 提取物混合，然后涡旋几分钟。在 10 分钟内形成 1 厘米厚的泡沫层表明存在皂苷 [ 21 ]。
2.4.2. 测试单宁
将 1 ml 蒸馏水与 0.5 ml 提取物混合，然后加入 1-2 滴 FeCl 3溶液。没食子单宁呈蓝色，而儿茶酚单宁呈绿黑色 [ 21 ]。
2.4.3。还原糖或碳水化合物的测试（费林测试）
将等体积的 Fehling's A（35 g CuSO 4 ·5H 2 O，溶于 500 ml 蒸馏水中）和 Fehling's B（173 g Na-K 酒石酸钾和 50 g NaOH，溶于 500 ml 蒸馏水中）充分混合并在水浴（65 ˚C）一分钟。然后将等体积的各种溶剂提取物添加到试剂混合物中，并在 65°C 下煮沸 10 - 15 分钟。最初出现黄色，最后得到砖红色氧化亚铜沉淀，表明存在还原糖 [ 21 ]。
2.4.4。糖苷测试
将 1 ml 冰醋酸添加到 1 ml 样品提取物中，然后将几滴 FeCl 3溶液与之混合。顶部出现棕色环表明存在糖苷 [ 21 ]。
2.4.5。酚类测试（氯化铁测试）
将 1 ml 提取物、1 ml 乙醇和几滴 FeCl 3适当混合。含有酚类化合物的植物提取物呈红色、蓝色、绿色和紫色[ 21 ]。
2.4.6。生物碱试验（德拉根多夫试验）
将等体积的提取物和 Dragendorff 试剂（硝酸铋 + 浓 HCl + KI 在蒸馏水中）混合。橙红色沉淀的形成表明存在生物碱 [ 13 ]。
2.4.7。生物碱测试（瓦格纳测试）
将几滴瓦格纳试剂（1.27 g I 2 + 2 g KI 在 100 ml 蒸馏水中）加入到 500 ml 各种提取物中。将混合物在 60°C 加热 30 分钟。瓦格纳试剂出现红棕色沉淀表明存在生物碱 [ 21 ]。
2.4.8。黄酮类化合物测试（碱性试剂测试）
向 1 ml 提取物中加入几滴 10% NaOH。向溶液中加入 NaOH 开始形成强烈的黄色，然后在加入几滴稀释的 HCl 后溶液变为无色，这表明存在类黄酮 [ 21 ]。
2.4.9。测试氨基酸和蛋白质（黄蛋白测试）
将 2-6 滴浓 HNO 3添加到 1 ml 提取物中。然后加入浓NaOH溶液以中和溶液。黄色或橙色的出现表明样品提取物中存在蛋白质和氨基酸 [ 21 ]。
2.4.10。心脏活性糖苷测试（Keller-Killani 测试）
将含有一滴氯化铁 (FeCl 3 ) 溶液的 2 ml 冰醋酸添加到 5 ml 提取物中。然后向混合物中加入1ml浓硫酸。在界面处形成棕色环，表明存在卡烯内酯的脱氧糖。紫色环可能出现在棕色环下方，绿色环也可能在整个醋酸层中逐渐形成 [ 24 ]。
2.4.11。萜类化合物测试（Salkowski 测试）
将 5 ml 提取物与 2 ml 氯仿适当混合。然后将3ml浓硫酸也加入到溶液中。界面处出现红棕色表明存在萜类化合物 [ 13 ]。
2.4.12。测试黄蛋白
将几滴浓 HNO 3和 NH 3溶液分别与 1 ml 提取物混合。红橙色沉淀的形成表明存在黄蛋白 [ 25 ]。
2.4.13。测试醌
将 1 ml 氢氧化钾醇溶液分别与各 1 ml 提取物混合。从红色到蓝色的颜色形成证明了醌的存在 [ 26 ]。
2.5. 植物成分的定量估计
2.5.1。总酚含量 (TPC) 的测定
如 Polash 等人所述，通过 Folin Ciocalteu 试剂 (FCR) 方法测定 D. malabarica 种子和果肉提取物中总酚类化合物的含量。[ 22] 稍作修改。这里，没食子酸被用作标准。用盐水溶液 (0.9% NaCl) 将 D. malabarica 种子和果肉的水、乙醇和己烷提取物的储备溶液稀释至不同浓度。将 0.1 ml 不同浓度的标准品和样品提取物放入不同的 falcon 试管中。将 500 µl FCR (10% v/v) 和 400 µl 7.5% 碳酸钠添加到每个试管中。混合物在室温下孵育1.5小时。通过使用紫外-可见分光光度计（Optizen POP，韩国）对含有蒸馏水的空白在 765 nm 处测量混合物的吸光度。使用不同浓度的没食子酸制作标准校准曲线，用于确定提取物的 TPC 值。
2.5.2. 估计总单宁含量 (TTC)
根据 Tambe 和 Bhambar [ 27 ] 描述的方案测定 D. malabarica 种子和果肉提取物的总单宁含量 (TTC)，几乎没有修改，单宁酸用作标准。用盐水溶液 (0.9% NaCl) 制备不同浓度的 D. malabarica 提取物。在本实验中，将 0.1 ml 不同浓度的标准品和样品提取物分别放入不同的 Falcon 试管中。然后向每个管中加入 7.5 ml 蒸馏水。将 0.5 ml 100% Folin-Ciocalteu 试剂添加到上述混合物中，然后添加 1 ml 35% Na 2 CO 3和 0.9 毫升蒸馏水。将混合物在室温下孵育30分钟。最后，通过紫外-可见分光光度计（Optizen POP，韩国）对含有蒸馏水的空白在 725 nm 处测量混合物的吸光度。提取物的 TTC 表示为每毫升单宁酸当量微克 (µg TAE/ml)。
2.5.3. 总黄酮含量 (TFC) 的估算
通过氯化铝 (AlCl 3 ) 比色法测定 D. malabarica 种子和果肉提取物中的总黄酮含量 (TFC) [ 12 ]。此处，类黄酮含量以儿茶素当量表示。将 1 ml 不同浓度的标准品和样品提取物放入不同的试管中。然后向每个管中加入 4 ml 蒸馏水，然后加入 0.3 ml 5% 亚硝酸钠 (NaNO 2 ) 并孵育 5 分钟。然后 0.3 ml 10% 的氯化铝（AlCl 3) 加入上述混合物中并在室温下孵育 6 分钟，然后加入 2 ml 1M 氢氧化钠 (NaOH)。立即向每支管中加入 2.4 ml 蒸馏水，使总体积达到 10 ml。将溶液充分混合，并通过紫外-可见分光光度计（Optizen POP，韩国）在 510 nm 处针对含有蒸馏水的空白测量混合物的吸光度。样品提取物的 TFC 表示为每毫升儿茶素当量微克 (µg CE/ml)。
2.5.4。总生物碱含量的测定
根据先前发表的报告中描述的方法，通过重量分析定量测定 D. malabarica 种子和果肉部分中的总生物碱含量，几乎没有修改 [ 14 ] [ 28 ]。简而言之，将种子和果肉粉末各取 5 g 放入不同的锥形瓶中。在每个烧瓶中加入 200 毫升 20% 的乙酸。然后将这些烧瓶适当地摇动以混合，用铝箔覆盖，然后在室温下孵育4小时。温育后，过滤混合物并通过蒸发将滤液的体积减少到其原始体积的四分之一。向该浓缩样品中加入 32% 氢氧化铵（NH 3)逐滴加入以沉淀生物碱。当沉淀完成时，使整个溶液沉降并使用预先称重的滤纸通过过滤收集沉淀物。总生物碱含量的百分比计算如下：
总生物碱百分比（%) =残渣重量取样重量× 100
D. malabarica 种子和果肉粉末中的生物碱含量以每 100 g 样品粉末中存在的生物碱毫克数表示。
2.5.5。总皂苷含量的测定
通过 Ezeabara 等人描述的双重提取重量法估计 D. malabarica 种子和果肉提取物的总皂苷含量。[ 29] 几乎没有修改。简而言之，将 5 g 粉末状水果部分与 50 ml 20% 乙醇水溶液混合，并将混合物在 55°C 的水浴中培养 90 分钟，并定期搅拌。温育后，过滤混合物。残余物也以相同方式萃取和过滤。然后将两种提取物混合在一起，并通过在 90°C 下蒸发将合并的提取物减少到 40 ml。将浓缩的萃取物转移到含有40ml二氯甲烷的分液漏斗中并剧烈振摇。当水层和有机层被分配时，水层被分离。如果水层不透明，应重新提取和分配。将萃取的水性部分转移到分液漏斗中，用60ml 100％乙醇洗涤。在那之后，向混合物中加入 50 ml 5% NaCl 溶液。分配后，将上层水层从漏斗中分离出来，并在预先称重的玻璃盘中于 60°C 下蒸发。完全蒸发后，将培养皿干燥并重新称重。皂苷含量由下式测定：
总皂苷百分比（%)=装有样品的盘子重量-盘子的重量采集的粗样品重量× 100
D. malabarica 果实提取物的总皂苷含量以百分比表示。
2.5.6。总蛋白质含量的估计
用 Lowry 方法 [ 30 ] [ 31 ]测定 D. malabarica 种子和果肉提取物的总蛋白质含量]。简而言之，使用牛血清白蛋白作为标准。将 2 ml 不同稀释度的标准溶液和样品溶液分别放入不同的试管或 Falcon 试管中。将 2 ml 碱性硫酸铜试剂（分析试剂）加入试管中并在室温下孵育 10 分钟。最后，将 0.2 ml Folin Ciocalteau 试剂添加到每个管中，并在室温下孵育 30 分钟，并在 660 nm 处用紫外-可见分光光度计（Optizen POP，韩国）针对含有试剂和蒸馏水的空白测量吸光度。不同稀释度的提取物的蛋白质含量表示为每毫升样品提取物对应的微克 BSA（微克 BSAE/毫升）。
2.5.7。总还原糖含量的估算
D. malabarica 种子和果肉提取物的总还原糖（碳水化合物）含量通过 Nelson-Somogyi 方法测定，几乎没有修改 [ 32 ]。在该方法中，使用葡萄糖作为标准。将 1 ml 不同稀释度的标准品和样品溶液与 1 ml 铜试剂适当混合。这些溶液在 90°C 下煮沸 15 分钟，然后冷却。冷却后，向混合物中加入 1 ml 砷钼酸盐显色剂，将溶液充分混合。用紫外-可见分光光度计（Optizen POP，韩国）在 520 nm 处针对含有试剂和蒸馏水的空白测量光密度。各种稀释的样品提取物的葡萄糖含量表示为每毫升样品提取物的微克葡萄糖当量（μg 葡萄糖/ml）。
2.5.8。维生素C的估计
根据 Kapur 等人的方案，用 2,4-二硝基苯肼法测定 D. malabarica 种子和果肉提取物的维生素 C 含量。[ 33] 使用 5% 三氯乙酸 (TCA) 制备的 800 µg/ml 抗坏血酸作为标准品，几乎没有修改。将 500 µl 不同稀释度的标准品和样品提取溶液与 100 µl 2, 4-二硝基苯肼-硫脲-铜 (DTC) 溶液适当混合，并在 37˚C 水浴中孵育 3 小时。孵育后，加入 750 µl 冰冷的 65% 硫酸并将溶液充分混合。然后将溶液在室温下保持30分钟。最后，使用紫外-可见分光光度计（Optizen POP，韩国）在 530 nm 处测量混合物的光密度，对照含有试剂和 5% TCA 的空白。各种稀释的样品提取物的抗坏血酸含量表示为每毫升样品提取物的抗坏血酸当量 (AAE) 微克 (µg AAE/ml)。
2.6. 抗氧化活性
2.6.1。DPPH 自由基清除活性测定
根据 Manzocco 等人描述的方法测定 D. malabarica 的水、乙醇和己烷提取物的 2,2-二苯基-1-苦基肼 (DPPH) 自由基清除活性。[ 34 ] 几乎没有修改。简而言之，使用甲醇制备的抗坏血酸作为标准品。将 200 µl 不同浓度的标准品和样品提取物与 800 µl DPPH 溶液（0.025% 的甲醇溶液）混合。将溶液充分混合，将试管在黑暗环境中孵育 30 分钟以完成反应。温育后，通过紫外-可见分光光度计在 517 nm 处测量混合物的吸光度，对照含有蒸馏水的空白。DPPH自由基清除活性的百分比由下式计算：
%清除活动=对照的吸光度-测试样品的吸光度对照品的吸光度× 100
将自由基清除活性的百分比与植物提取物的浓度作图。根据我们之前发表的论文 [ 21 ] [ 23 ] 确定了其抑制 50% 自由基形成的提取物浓度（即 IC 50值）。IC 50由以下等式计算：
是= a * X+ b
这个方程称为线性回归方程。这里，Y = 50%，X = 发生 50% 自由基形成抑制时的提取物浓度，a = 系数，b = 常数。将 IC 50值与提取物浓度作图并生成条形图。IC 50值最低的提取物具有最高的DPPH自由基清除活性。
2.6.2. 铁还原抗氧化能力 (FRAP) 测定
D. malabarica 种子和果实提取物的 FRAP 测定是根据 Benzie 和 Strain [ 35 ] [ 36 ] 建立的方法进行的，几乎没有修改。在此，抗氧化活性被测量为已知抗氧化剂（即抗坏血酸）的当量。对于 FRAP 试剂的制备，三种溶液（即用乙酸钠和冰醋酸制备的 300 mM 乙酸盐缓冲液、10 mM 2,4,6-三（2-吡啶基）-s-三嗪 (TPTZ) 的 40 mM HCl 溶液）和 20 mM FeCl 3 ∙6H 2蒸馏水溶液中的 O) 以 10:1:1 的比例新鲜混合，并在 37°C 下预热，然后再进行还原活性测定。然后将不同浓度的标准品和样品提取物（0.2 ml）放入不同的试管中。将 FRAP 试剂（1.5 ml，在 37°C 下预热）添加到每个试管中，并在 37°C 下孵育 4 分钟。最后，使用紫外-可见分光光度计（Optizen POP，韩国）对含有 FRAP 试剂和蒸馏水的空白在 593 nm 处测量混合物的吸光度。样品提取物的抗氧化活性以每毫升抗坏血酸 (AA) 微克 (µg AAE/ml) 表示。
2.6.3. 降低功率测定
D. malabarica 种子和果实提取物的抗氧化潜力也通过根据 Afsar 等人的铁还原能力测定进行。[ 37 ] 和 Bag 等人。[ 15] 稍作修改。在本实验中，没食子酸用作标准品。将 0.5 ml 不同浓度的标准品和样品提取物放入不同的试管中。然后将 0.5 ml 磷酸盐缓冲液 (0.2 M) 和 0.5 ml 铁氰化钾 (1%) 添加到每个试管中，并将溶液适当混合。将混合物在 50°C 下孵育 20 分钟。孵育后，将 0.5 ml 三氯乙酸 (10%) 添加到反应混合物中以停止反应并以 3000 rpm 离心 10 分钟。离心后，从上层吸出 0.5 ml 上清液并分装到单独的试管中，向试管中加入 0.1 ml 氯化铁（0.1%）和 0.5 ml 蒸馏水。使用紫外-可见分光光度计 (Optizen POP, 韩国）针对含有蒸馏水的空白。将标准品和样品提取物的吸光度与浓度作图，以绘制线图，从中可以确定 D. malabarica 种子和果实提取物的还原能力。反应混合物的吸光度增加表明还原能力增加。
2.7. 统计分析
统计分析采用GraphPad Prism 5.0，采用单因素方差分析（ANOVA）检验，均值差异的显着性采用Duncan's multiple range test at (P < 0.05)显着性水平。所有分析都进行了多次，结果以平均值±SEM表示。
3. 结果
3.1。产量系数
收率百分比表示通过提取程序获得的提取物的量，以每100克(g)粗粉获得的提取物的克数(g)表示，并列于表1中。
在水性种子提取物中获得最高产量（每 100 克粗粉 40.6 克），在己烷果肉提取物中获得最低产量（每 100 克粗粉 1.8 克）。水提取物和乙醇提取物中的较高产量表明存在于 D. malabarica 果实中的大多数植物成分是极性的。结果，植物成分很容易被极性溶剂（即水和乙醇）提取。己烷提取物的低产率表明，在 D. malabarica 的种子和果肉提取物中存在非常少量的非极性植物成分（表 1）。另一方面，与果肉提取物相比，种子提取物的产量更高，这表明 D. malabarica 种子提取物是植物成分的极好来源。
3.2. 定性植物化学筛选
D. malabarica 种子和果肉提取物的定性植物化学筛选结果见表 2。
使用蒸馏水和 70% 乙醇制备的 D. malabarica 的种子和果肉提取物显示出大量的单宁、还原糖、蛋白质、强心苷和醌。此外，这些提取物还
| SL 编号 |
溶剂萃取 （100 毫升中 5 克） |
提取物的产量 （克） |
产率百分比 (%w/w) |
| 1. | 水种子提取物 | 2.03 | 40.6 |
| 2. | 水性肉提取物 | 0.68 | 13.6 |
| 3. | 乙醇种子提取物 | 1.94 | 38.8 |
| 4. | 乙醇肉提取物 | 0.73 | 14.6 |
| 5. | 己烷种子提取物 | 0.12 | 2.4 |
| 6. | 己烷肉提取物 | 0.09 | 1.8 |
表 1。使用蒸馏水、70% 乙醇和己烷制备的 D. malabarica 种子和果肉提取物的百分比产率。
| 测试 |
水性 种子提取物 |
水性 肉提取物 |
乙醇 种子提取物 |
乙醇 肉提取物 |
己烷 种子提取物 |
己烷 肉提取物 |
| 1.皂苷 | ++ | + | + | ++ | + | + |
| 2. 单宁 | +++ | +++ | +++ | +++ | - | - |
| 3. 减糖 | +++ | +++ | +++ | ++ | - | + |
| 4. 糖苷 | ++ | + | +++ | - | - | - |
| 5. 苯酚 | ++ | ++ | ++ | ++ | - | - |
| 6. 生物碱（德拉根多夫试验） | + | ++ | ++ | ++ | - | - |
| 7. 生物碱（瓦格纳试验） | + | ++ | ++ | ++ | - | - |
| 8. 类黄酮 | ++ | + | ++ | ++ | - | - |
| 9. 蛋白质 | +++ | ++ | +++ | +++ | - | - |
| 10. 强心苷 | +++ | +++ | +++ | + | - | - |
| 11. 萜类化合物 | - | ++ | - | ++ | - | - |
| 12.黄蛋白 | + | + | +++ | ++ | + | - |
| 13. 醌类 | +++ | - | +++ | - | - | - |
表 2。使用蒸馏水、70% 乙醇和己烷制备的 D. malabarica 种子和果肉提取物的植物化学筛选。
*注意：+++ = 高；++ = 中等；+ = 低；- = 负数。
显示出适量的苯酚、萜类、皂苷、黄酮类、生物碱和甙（表2）。另一方面，己烷种子和己烷果肉提取物在几乎所有定性测试中均显示阴性结果，这表明 D. malabarica 种子和果肉提取物中不存在非极性植物成分。
3.3. 定量植物化学测定
3.3.1。总酚、单宁和类黄酮含量的测定
D. malabarica 种子和肉提取物的总酚含量 (TPC)、总单宁含量 (TTC) 和总黄酮含量 (TFC) 分别表示为 µg GAE/ml、µg TAE/ml 和 µg CE/ml。数据显示水性种子提取物以剂量依赖性方式显示出最大量的 TPC、TTC 和 TFC，其次是乙醇种子提取物（图 1-3）。对于所有提取物，TPC、TTC 和 TFC 的浓度随着植物提取物量的增加而增加。所有提取物中 TPC、TTC 和 TFC 的量始终遵循相同的顺序：水种子 > 乙醇种子 > 乙醇肉 > 水肉 > 己烷提取物。这表明大部分酚类、单宁和类黄酮是通过极性溶剂（即水和乙醇）提取的。苯酚、单宁、种子水提液和黄酮类化合物的含量显着高于果肉水提液。类似地，乙醇种子提取物中的酚、单宁和黄酮含量显着高于乙醇肉提取物。尽管就其酚、单宁和类黄酮含量而言，含水种子和乙醇种子提取物之间的差异非常微小（图 1-3）。TPC 最高的是种子水提取物 (23 µg GAE/ml)，而己烷果肉提取物 (1.15 µg GAE/ml) 的 TPC 最低，浓度为 100 µg/ml ( 尽管就其酚、单宁和类黄酮含量而言，含水种子和乙醇种子提取物之间的差异非常微小（图 1-3）。TPC 最高的是种子水提取物 (23 µg GAE/ml)，而己烷果肉提取物 (1.15 µg GAE/ml) 的 TPC 最低，浓度为 100 µg/ml ( 尽管就其酚、单宁和类黄酮含量而言，含水种子和乙醇种子提取物之间的差异非常微小（图 1-3）。TPC 最高的是种子水提取物 (23 µg GAE/ml)，而己烷果肉提取物 (1.15 µg GAE/ml) 的 TPC 最低，浓度为 100 µg/ml (图 1）。同样，在 500 µg/ml 浓度的水种子提取物中发现了最高的 TTC (369 µg TAE/ml)，在己烷种子提取物中发现了最低的 TTC (10.72 µg TAE/ml)（图 2）。此外，在 1000 µg/ml 浓度的水种子提取物中发现最高的 TFC (110 µg CE/ml)，在己烷种子提取物中发现最低的 TFC (2.81 µg CE/ml)（图 3）。
3.3.2. 总生物碱和总皂苷含量的测定
用重量分析法估算了 D. malabarica 种子和果肉提取物的总生物碱和总皂苷含量（表 3）。总金额
图 1。估计 D. malabarica 种子和果肉提取物的总酚含量 (TPC)。该图显示了所有提取物的三种不同浓度（即 20 µg/ml、60 µg/ml 和 100 µg/ml）的 TPC，以 µg GAE/ml 表示。这里，AF = 水性肉提取物，AS = 水性种子提取物，EF = 乙醇性肉提取物，ES = 乙醇种子提取物，HF = 己烷肉提取物和 HS = 己烷种子提取物。数据以不同重复的平均值±标准偏差 (n = 3) 的形式呈现。通过 GraphPad Prism 5.0 使用 ANOVA 分析数据并确定显着性水平 (*p < 0.05, ***p < 0.001)。
图 2。估计 D. malabarica 种子和肉提取物的总单宁含量 (TTC)。该图显示了种子和果肉提取物的三种不同浓度（即 125 µg/ml、250 µg/ml 和 500 µg/ml）的总单宁含量，以 µg TAE/ml 表示。这里，AF = 水性肉提取物，AS = 水性种子提取物，EF = 乙醇性肉提取物，ES = 乙醇种子提取物，HF = 己烷肉提取物和 HS = 己烷种子提取物。数据以不同重复的平均值±标准偏差 (n = 4) 的形式呈现。使用 ANOVA 通过 GraphPad Prism 5.0 分析数据并确定显着性水平 (***p < 0.001)。
图 3。估计 D. malabarica 提取物的总黄酮含量 (TFC)。该图显示了种子和果肉提取物的三种不同浓度（即 250 µg/ml、500 µg/ml 和 1000 µg/ml）的总黄酮含量，以 µg CE/ml 表示。这里，AF = 水性肉提取物，AS = 水性种子提取物，EF = 乙醇性肉提取物，ES = 乙醇种子提取物，HF = 己烷肉提取物和 HS = 己烷种子提取物。数据以不同重复的平均值±标准偏差 (n = 4) 的形式呈现。使用 ANOVA 通过 GraphPad Prism 5.0 分析数据并确定显着性水平 (***p < 0.001)。
| D. malabarica 植物零件 | 生物碱含量（克） | 皂苷含量（克） |
| 种子 | 13.6 ± 0.92*** | 0.42±0.05 |
| 肉 | 3.4±0.40 | 0.74 ± 0.07 |
表 3。D. malabarica 种子和肉提取物的总生物碱和总皂苷含量。
***显着性水平（p < 0.001）。
100克D. malabarica种子粉中生物碱含量为13.6克。另一方面，100粒肉粉中的生物碱含量为3.4克，即种子的生物碱含量明显高于肉。因此，D. malabarica 种子是生物碱的极好来源。然而，100克D. malabarica种子和果肉粉末中皂苷的含量分别为0.42 gm和0.74 gm，即果肉的皂苷含量不显着高于种子。因此，D. malabarica 果实是皂苷的适度来源。
3.3.3. 总蛋白、还原糖和维生素 C 含量的估算
以剂量依赖性方式测定 D. malabarica 种子和肉提取物的总蛋白质、总还原糖和总维生素 C 含量（图 4-6）。种子乙醇提取物的总蛋白质和总维生素 C 含量最高，而种子水提取物的总还原糖含量最高。在所有浓度下，用极性（即水和乙醇）溶剂提取的蛋白质、还原糖和维生素 C 含量较高，这表明 D. malabarica 种子和果肉中存在的大多数蛋白质、还原糖和维生素 C极地性质。种子水提取物的蛋白质、还原糖和维生素C含量显着高于肉水提取物。另一方面，蛋白质，还原糖，种子乙醇提取物维生素C含量显着高于果肉乙醇提取物。种子水提取物和乙醇种子提取物之间的蛋白质、还原糖和维生素 C 含量差异不显着（图 4-6）。在乙醇种子提取物中获得最高的蛋白质含量（920 μg BSAE/ml），而在 600 μg/ml 浓度的水性肉提取物中获得最低的蛋白质含量（156 μg BSAE/ml）。图 4）。在水种子提取物中获得最高的还原糖含量（694 μg GE/ml），最低的还原糖含量为
图 4。估计 D. malabarica 种子和肉提取物的总蛋白质含量。该图显示了以 µg BSAE/ml 表示的种子和果肉提取物的四种不同浓度（即 100 µg/ml、200 µg/ml、400 µg/ml 和 600 µg/ml）的总蛋白质含量。这里，AF = 水性肉提取物，AS = 水性种子提取物，EF = 乙醇性肉提取物，ES = 乙醇种子提取物，HF = 己烷肉提取物和 HS = 己烷种子提取物。数据以不同重复的平均值±标准偏差 (n = 3) 的形式呈现。使用 ANOVA 通过 GraphPad Prism 5.0 分析数据并确定显着性水平 (***p < 0.001)。
图 5。估计 D. malabarica 种子和肉提取物的总还原糖含量。该图显示了种子和果肉提取物的三种不同浓度（即 62.5 µg/ml、125 µg/ml 和 250 µg/ml）的总还原糖含量，以 µg GE/ml 表示。这里，AF = 水性肉提取物，AS = 水性种子提取物，EF = 乙醇性肉提取物，ES = 乙醇种子提取物，HF = 己烷肉提取物和 HS = 己烷种子提取物。使用 ANOVA 通过 GraphPad Prism 5.0 分析数据并确定显着性水平 (***p < 0.001)。
图 6。估计 D. malabarica 种子和肉提取物的抗坏血酸含量。该图显示了种子和果肉提取物的四种不同浓度（即 125 µg/ml、250 µg/ml、500 µg/ml 和 1000 µg/ml）的维生素 C 含量，以 µg AAE/ml 表示。这里，AF = 水性肉提取物，AS = 水性种子提取物，EF = 乙醇性肉提取物，ES = 乙醇种子提取物，HF = 己烷肉提取物和 HS = 己烷种子提取物。通过 GraphPad Prism 5.0 使用 ANOVA 分析数据并确定显着性水平 (*p < 0.05, ***p < 0.001)。
以 250 μg/ml 的浓度在水性肉提取物 (194 μg GE/ml) 中获得（图 5）。在乙醇种子提取物中获得最高的维生素 C 含量（23 μg AAE/ml），而在 250 μg/ml 浓度的水性肉提取物中获得最低的维生素 C 含量（5 μg AAE/ml）（图 6）。己烷提取物显示很少或几乎没有蛋白质、还原糖和抗坏血酸。
3.4. 抗氧化活性测定
3.4.1。DPPH 自由基清除试验
DPPH是一种稳定的自由基，可以接受电子或氢自由基成为稳定的分子。新制备的 DPPH 溶液呈深紫色，在存在抗氧化剂的情况下最大吸收波长为 517 nm，该抗氧化剂可淬灭 DPPH 自由基并将其转化为无色产物 [ 9 ]。在此，所有 D. malabarica 果实提取物均用于 DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 自由基清除测定，抗坏血酸用作阳性对照。最高的清除活性是种子水提取物，其次是乙醇种子提取物，即使在非常低的浓度 (5 µg/ml) 下也显示出显着的自由基清除活性（图 7（一个））。另一方面，水和乙醇肉提取物在 50 µg/ml 时均显示出显着的自由基清除活性（图 7 (A)）。
为了确定D. malabarica 种子和果肉提取物的 DPPH 自由基清除活性的 IC 50值（即抑制自由基形成 50% 所需的植物提取物的浓度），不同浓度的吸光度将不同植物提取物的浓度与浓度作图，并找到每种提取物的折线图。IC 50值由折线图计算。具有最低IC 50值的提取物具有最高的DPPH自由基清除活性。水溶液的 IC 50值
图 7。D. malabarica 提取物的抗氧化活性测定。(A) 不同种子和果肉提取物清除DPPH自由基百分比的剂量反应曲线。图中显示了不同浓度的提取物 (1 - 200 µg/ml)。该图显示自由基清除活性与提取物浓度成正比。(B) IC 50的比较D. malabarica 不同种子和果肉提取物的价值。数据表示为不同重复的平均值±标准偏差（n = 3）。这里，AS = 水性种子提取物，AF = 水性肉提取物，ES = 乙醇种子提取物，EF = 乙醇肉提取物，HS = 己烷种子提取物和 HF = 己烷肉提取物。使用 ANOVA 通过 GraphPad Prism 5.0 分析数据并确定显着性水平 (***p < 0.001)。
种子、含水果肉、乙醇种子、乙醇果肉、己烷种子和己烷果肉提取物分别为 44.50 µg/ml、156.03 µg/ml、49.12 µg/ml、113.53 µg/ml、1811.36 µg/ml 和 2359.66 µg/ml，分别。然而，抗坏血酸的 IC 50值为 32.42 µg/ml（图 7 (B)）。因此，表明含水种子、含水果肉、乙醇种子和乙醇果肉提取物的IC 50值对于抗坏血酸不显着。然而，与抗坏血酸相比，两种己烷提取物的 IC 50值均具有统计学意义。最低 IC 50种子水提取物的值（即 44.50 µg/ml）是最有效的自由基清除剂。另一方面，己烷肉提取物的IC 50值最高（即2359.66 µg/ml），是最不有效的自由基清除剂。
3.4.2. 铁还原抗氧化能力 (FRAP) 测定
在 FRAP 测定中，D. malabarica 果实提取物的抗氧化活性以 µg AAE/ml 表示。在这里，三吡啶基三嗪铁 (Fe 3+ -TPTZ) 配合物在抗氧化剂存在下还原为亚铁形式 (Fe 2+ ) 在低 pH 值下产生强烈的蓝色，可以通过测量 593 nm 处的吸光度来监测[ 38 ]。因此，吸光度的变化与反应混合物中存在的给电子抗氧化剂的还原能力直接相关[ 35]。种子水提取物的铁还原抗氧化能力 (FRAP) 显着高于肉水提取物。同样，乙醇种子提取物的 FRAP 显着高于乙醇肉提取物。然而，水种子和乙醇种子提取物在降低铁的抗氧化潜力方面的差异在统计学上不显着（图 8）。在目前的研究中，与浓度为 25 μg/ml 的其他提取物相比，水种子 (7.31 µg AAE/ml) 和乙醇种子 (5.18 µg AAE/ml) 提取物显示出显着的抗氧化活性
图 8。D. malabarica 提取物的抗氧化活性测定。该图显示了通过 FRAP 测定对三种不同浓度（即 6.25 µg/ml、12.5 µg/ml 和 25 µg/ml）的种子和果肉提取物的抗氧化潜力，以 µg AAE/ml 表示。这里，AF = 水性肉提取物，AS = 水性种子提取物，EF = 乙醇性肉提取物，ES = 乙醇种子提取物，HF = 己烷肉提取物和 HS = 己烷种子提取物。数据以不同重复的平均值±标准偏差 (n = 3) 的形式呈现。使用 ANOVA 通过 GraphPad Prism 5.0 分析数据并确定显着性水平 (*p < 0.05)。
（图 8）。此外，抗氧化活性的浓度随着植物提取物（6.25 至 25 μg/ml）量的增加而增加。
3.4.3. 降低功率测定
提取物的还原能力可作为其潜在抗氧化活性的指标 [ 9 ]。在该测定中，样品提取物中抗氧化活性的存在可能导致 Fe 3+ /氰化铁复合物还原为亚铁形式，可在 700 nm 分光光度法监测。不同种子和果肉提取物的抗氧化潜力是根据它们在不同浓度下的吸收差异来估计的。此外，样品提取物的还原能力随着浓度的增加而增加（即，6.25 至 25 μg/ml）（图 9)，没食子酸用作阳性对照。在水性种子和乙醇种子提取物中获得最大的还原能力活性，其次是乙醇肉和水性肉提取物。
4。讨论
本研究旨在研究使用两种极性（即蒸馏水和 70% 乙醇）溶剂和非极性（即己烷）溶剂制备的 D. malabarica 种子和果肉提取物的植物化学成分和抗氧化潜力。对提取物进行了定性和定量的植物化学分析，表明提取物中存在不同的功能成分。例如，定性植物化学分析显示皂苷、单宁、黄酮类化合物、碳水化合物、糖苷、苯酚和蛋白质的存在。另一方面，定量植物化学分析表明，D. malabarica种子和果肉的不同提取物含有不同量的酚类、单宁、黄酮类、生物碱、皂苷、蛋白质、还原糖和维生素C。更具体地说，在水和乙醇种子提取物中发现了这些植物成分的最大量。在 D. malabarica 提取物中检测到的植物化学成分具有修复功效。例如，植物多酚被发现
图 9。不同浓度 D. malabarica 种子和肉提取物的还原能力的剂量反应曲线。X 轴表示不同浓度的没食子酸和 D. malabarica 种子和肉提取物（以 µg/ml 为单位），Y 轴表示 700 nm 处的吸光度值。
可有效预防多种与氧化应激相关的疾病，如癌症、心血管疾病、慢性炎症等 [ 13 ] [ 39 ] [ 40 ]。单宁也已知具有抗菌 [ 41 ] [ 42 ]、抗病毒 [ 43 ] 和抗肿瘤活性 [ 43 ] [ 44 ]。此外，已知植物来源的生物碱具有多种生物活性，包括抗炎 [ 45 ]、抗疟疾 [ 46 ] 和抗菌 [ 47 ]] 活动。皂苷因其广泛的药理和药用活性而广为人知，如抗溃疡、抗癌、抗菌等[ 29 ]。已知维生素 C 可用作食品添加剂、抗氧化剂和还原剂 [ 33 ] [ 48 ]。此外，先前对 D. malabarica 树皮的研究报告了提取物的潜在生物活性（例如，抗氧化活性） [ 18 ] [ 19 ]。
我们的数据还支持 D. malabarica 水果提取物的抗氧化活性。D. malabarica 种子和果肉的水提取物和乙醇提取物显示出自由基清除和还原能力活性，即抗氧化活性。提取物按照以下顺序显示出抗氧化活性：水种子提取物>乙醇种子提取物>乙醇肉提取物>水性肉提取物>>己烷提取物。根据 Aparadh 等人的说法。[ 49 ] 和侯赛因等人。[ 50 ]，植物提取物的抗氧化活性取决于各自次级代谢物的存在，例如黄酮类化合物、单宁和酚类物质。另一项研究报告说，维生素 C 是抗氧化活性的指标 [ 30]。D. malabarica 果实提取物中酚类、单宁、类黄酮和维生素 C 的含量顺序为水种子 > 乙醇种子 > 乙醇果肉 > 水果肉 >> 己烷提取物（图 1-3 和图 6）。提取物的抗氧化活性与次生代谢物的趋势相同（图 7-9）。总之，由于这些植物成分主要负责抗氧化活性，因此 D. malabarica 果实提取物可以成为天然抗氧化剂的重要来源。
5. 结论
已经使用两种极性溶剂（即水和乙醇）和一种非极性溶剂（即己烷）制备了柿果肉和种子提取物。通过定性和定量分析测定了所有提取物的总酚含量、总单宁含量、总黄酮含量、总蛋白质含量、总还原糖含量、总抗坏血酸含量、总皂苷含量和总生物碱含量等植物成分。其他一些植物成分，如甙、萜类、树脂等，只能通过定性分析来确定。与非极性溶剂对应物相比，从极性溶剂中获得的 D. malabarica 果肉和种子提取物含有更多的植物成分。进一步来说，除蛋白质和维生素 C 的总含量外，水种子提取物含有最高量的植物成分。此外，水种子提取物显示出最高的 DPPH 自由基清除活性、铁还原抗氧化能力 (FRAP) 活性和还原能力活性测定，其次是乙醇种子提取物. 因此，D. malabarica 种子富含具有多种治疗倾向的不同植物成分，可用作天然抗氧化剂的潜在来源，并具有其他治疗用途，包括保肝功效。D. malabarica 果实可以进一步筛选出各种致病病原体，并且可以成为化学和生物学重要候选药物的潜在来源。水种子提取物显示出最高的 DPPH 自由基清除活性、铁还原抗氧化能力 (FRAP) 活性和还原能力活性测定，其次是乙醇种子提取物。因此，D. malabarica 种子富含具有多种治疗倾向的不同植物成分，可用作天然抗氧化剂的潜在来源，并具有其他治疗用途，包括保肝功效。D. malabarica 果实可以进一步筛选出各种致病病原体，并且可以成为化学和生物学重要候选药物的潜在来源。水种子提取物显示出最高的 DPPH 自由基清除活性、铁还原抗氧化能力 (FRAP) 活性和还原能力活性测定，其次是乙醇种子提取物。因此，D. malabarica 种子富含具有多种治疗倾向的不同植物成分，可用作天然抗氧化剂的潜在来源，并具有其他治疗用途，包括保肝功效。D. malabarica 果实可以进一步筛选出各种致病病原体，并且可以成为化学和生物学重要候选药物的潜在来源。马拉巴里卡种子富含不同的植物成分，具有多种治疗倾向，可用作天然抗氧化剂的潜在来源，具有其他治疗用途，包括保肝功效。D. malabarica 果实可以进一步筛选出各种致病病原体，并且可以成为化学和生物学重要候选药物的潜在来源。马拉巴里卡种子富含不同的植物成分，具有多种治疗倾向，可用作天然抗氧化剂的潜在来源，具有其他治疗用途，包括保肝功效。D. malabarica 果实可以进一步筛选出各种致病病原体，并且可以成为化学和生物学重要候选药物的潜在来源。
资金
该研究项目得到了孟加拉达卡 1342 年萨瓦尔的贾汉吉尔纳加大学研究资助 2017-18 年和政府大学拨款委员会-贾汉吉尔纳加尔大学研究资助 2017-18 年的支持。孟加拉国。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
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