摘要：目的：评价生物还原活性和各种潜力，对白毛茛的生物实体进行注释。方法：用不同的乙醇-水馏分混合物对粗提物进行分馏。这证实了 AgNPs 的生物合成还原潜力、其抗氧化、抗脲酶和抗酪氨酸酶活性。结果：紫外可见光谱证实了优化的 50% 乙醇-水馏分混合物对 Ag NPs 的生物还原潜力。透射电子显微镜 (TEM) 在优化的 50% 级分混合物中证实了平均尺寸为 16 nm 的圆形 AgNP。进一步评估含有 90% 和 70% 的植物提取物的乙醇-水馏分显示出更多的抗酪氨酸酶和抗脲酶活性的潜力。此外，稀释的 30% 馏分表现出两倍高的抗氧化和抗脲酶活性。结论：总体而言，这项工作表明，50% 的乙醇-水馏分具有潜在的活性分子（在所有馏分中），主要参与 Ag NPs 的生物还原潜力和酶测定，而 90% 的混合物被证明是最不活跃的。本研究建议选择 50% 乙醇-水的最佳混合分数，以筛选生物活性化合物并为临床试验灌输其活性状态。
关键词
生物 活性,紫藤,纳米颗粒,酶法,生物 还原剂
一、简介
纳米粒子的绿色合成是当前纳米生物技术领域中最引人入胜的研究 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]。进展表明，许多植物在合成和获得颗粒稳定性以增强其生物医学应用方面具有生物还原潜力 [ 5 ] [ 6 ] [ 7]，它表现出显着程度的复杂性，需要通过制备馏分进行整合，以进一步验证生物活性成分。植物作为合成药物预防和治疗疾病的传统手段，食品工业用于维持和保存食品质量以及化妆品领域，提供天然和无害的生物活性成分 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12]。Fagonia cretica 是一种森林覆盖的小多刺草本植物，属于蒺藜科，属于开花植物被子植物的主群。这种植物传播到世界上贫瘠和炎热的地区，主要见于巴基斯坦和除澳大利亚以外的所有其他大陆的干燥岩石（钙质）中 [ 13 ]。在巴基斯坦，它通常被称为 Dhamasa [ 9 ]。药用重要性增加了需求，因为与天花相比，它具有解热和预防作用 [ 14 ]。Fagonia cretica 水煮植物可用于治疗肝炎 Fagonia cretica 风干植物对妇科问题很重要 [ 15 ] [ 16]。Fagonia 压碎的叶子汁在净化血液中起重要作用，用于治疗气体问题和蠕虫感染 [ 17 ]。它可以作为糊剂涂抹在肿瘤的外侧。因此，叶滴剂用于治疗咳嗽、哮喘问题、水肿、作为肠胃胀气缓解剂和收敛剂 [ 18 ]。最近报道了 Fagonia 提取物对 PC12 细胞中化学缺血诱导的抗氧化潜力 [ 19 ]。在另一份报告中，在体外测试了 Fagonia 不同部位的抗氧化潜力并进行了比较 [ 20 ] [ 21 ]。Fagonia 植物的抗脲酶和抗酪氨酸酶活性尚未以提取物和级分形式报道。
清晰的复杂性迫使我们详细阐述使用干燥形式的植物、纯植物、水性植物、甲醇性植物、酒精性植物以及它们的水性介质组合用于人种医学研究，包括抗氧化、血液学、抗辐射、糖尿病、抗癌活性和其他体外和体内使用分析 [ 22 ] - [ 29 ]。每个准备好的摘录都提供了地区对某些特定活动的回应。就像甲醇提取物主要表现出显着的抗菌潜力一样。但以前，为确定提取物的生物医学应用做了很多贡献。
因此，溶剂的选择、组合和分馏是我们关注的问题，以解决确切的生物活性化合物。到目前为止，还没有对用合适的溶剂制备馏分混合物以准确分析整个植物的生物活性进行询问。现在在这里我们建议制备乙醇和水的分馏混合物，分为四种不同的百分比，如 90%、70%、50% 和 30%。对于这种纯白芨草提取物，使用乙醇和水的馏分混合物制备，使用分馏进行分馏，以评估其生物活性，如抗酪氨酸酶、抗脲酶、抗氧化和生物还原潜力，首次用于合成银纳米粒子。该功能作为植物提取物对氧化剂的电位的测量，提供不同的稀释分数以降低复杂性。因此，评估了白菖蒲的抗脲酶、抗酪氨酸酶和抗氧化活性，进一步阐明了在合成银纳米粒子时对所有设计组分的生物还原潜力。
2。材料和方法
2.1。化学试剂
使用的所有化学品均为分析试剂级。硝普钠、抗坏血酸、冰醋酸和三吡啶基三嗪 (TPTZ)、底物 L-酪氨酸、曲酸、磷酸一水合物、尿素、脲酶、硫脲、碱试剂、苯酚试剂、AgNO 3。2,2-二苯基-1-苦基肼 (DPPH)。
2.2. 植物提取物的制备
Fagonia cretica 植物取自巴基斯坦巴哈瓦尔布尔伊斯兰大学的 CIDS 系（Cholistan 沙漠研究所）。新鲜植物材料用蒸馏过的 H 2洗涤O，切成小块，放在阴凉处，直到它变干。将整株植物干燥并使用研杵和研钵粉碎以获得其粉末形式。随后，将 20 g 提取物粉末浸入分别稀释 90% 和 10% 的乙醇和水的混合物中。在过夜温育后进行过滤并将滤液干燥并制备粉末作为级分（90%）以供进一步使用。然后用乙醇重复相同的程序并分别稀释70％和30％，然后重复相同的过程两次，在乙醇和水的帮助下得到植物提取物的50％和30％乙醇稀释。将 90%、70%、50% 和 30% 乙醇稀释的部分保存在 4°C 温度的冰箱中以供进一步活动。
2.3. 通过 AgNPs 合成的生物还原活性
为了合成纳米颗粒，制备了 0.1 摩尔的 AgNO 3溶液。试剂瓶含有 25 ml AgNO 3和 5 ml 不同植物提取物（90%、70%、50% 和 30%），最终体积为 30 ml。将该混合物置于磁力搅拌器(150 rpm)上并在那里放置5小时。在 50°C 下进行反应。颜色发生了变化，这是纳米粒子合成的迹象。之后，将混合物保持在 6000 rpm 离心 20 分钟。改变颜色后，混合物被用来做紫外-可见光以确认银纳米粒子的合成。在所有组分的帮助下合成的 AgNPs 的透射电子显微镜 (TEM) 图像取自 JEOL JEM 2100。
2.4. 抗脲酶活性
进行了 Fagonia cretica 级分的抗脲酶活性。脲酶溶液 20 µl 与 55 µl PH 7.4 的磷酸盐缓冲液 (0.2 M) 混合。将混合物在 3°C 下保温 10 分钟。之后，加入 15 µl 尿素，并在相同的时间和温度下再次保持孵育。孵育已知体积的 Fagonia 后，将每种提取物 (10 µl) 添加到 96 个孔中，然后添加 10 µl 硫脲（标准溶液）。再次适当混合后，在 37°C 下孵育 10 分钟。然后在所有孔中加入 40 µl 碱试剂和 60 µl 苯酚试剂，并在室温下放置 10 分钟。用分光光度法在 625 nm 处测量吸光度。使用上述公式计算脲酶抑制百分比
% 抑制 = [1 - (A 625样品/A 625对照) × 100]。
2.5. 抗酪氨酸酶活性
为了检查 Fagonia cretica 对抗黑素生成的潜力，进行了抗酪氨酸酶活性。96 孔板中的反应混合物含有 140 µl 磷酸盐缓冲液，pH 为 6.8，有或没有不同浓度的样品（5 µl、10 µl、15 µl）和 L-DOPA（0.5 mM）。被添加到井中。曲酸用作（标准溶液）。适当混合后，将板在 37°C 的培养箱中保持 15 分钟。随后在所有孔中加入 L-酪氨酸。混合物再次在 37°C 下孵育 15 分钟。用分光光度法在 475 nm 处测量多巴色素（O-多巴醌）的量。使用上述公式[ 30 ]计算酪氨酸酶抑制百分比。
% 抑制 = [(A 475对照 - A 475样品)/A475 对照] × 100。
2.6. 抗氧化活性
为确定白毛茛的抗氧化潜力，使用了 NO 自由基清除试验。NO具有生物学功能，但其化学性质非常复杂。在 96 孔板的所需孔中加入已知体积 (175 µl) 和 PH (7.4) 的磷酸钠缓冲液，然后在所有孔中加入 20 µl 硝普钠和 5 µl 样品。正确混合所有内容物并在 37˚C 下孵育 3 小时，然后加入 Griess 试剂。孵育后，在每个孔中加入 20 µl Griess 试剂。进一步孵育一小时（在室温下。在 528 nm 分光光度计测量吸光度。对所有样品进行三次分析。使用以下公式测量一氧化氮清除活性。
% NO 清除活性 = [(A 528对照 - A 528样品)/A 528对照] × 100。
3。结果与讨论
合成银纳米颗粒并监测使用乙醇及其后续馏分从白桦茸中提取的生物实体的提取率有助于为成功合成具有所有馏分的 Ag NPs 提供可靠且有证据的方法。
通过根据其化学性质和溶解度将分离和解析的生物活性成分与具有生物还原潜力的 Ag NPs 相关联。存在于植物内部的抗氧化剂、抗酪氨酸酶和抗脲酶等电位通过调节乙醇浓度并随后进行稀释来增强生物还原潜力。由于生物分子的不同化学性质，该研究旨在通过为负责合成的那些生物活性成分提供化学上合适的环境来生物合成 Ag NPs，通过在图 1中制造四组不同的乙醇浓度来提供它们的最大活性. 这提供了相当显着的结果。但为了优化和确认由负责绿色合成的生物活性实体操纵的生物活性，进行了两个平行系列的稀释，分别为稀释 1 (D1) 和稀释 2 (D2)。这揭示了被掩盖的活动，通过稀释简化复杂性并最终确认合成的 Ag NPs 的生物还原潜力。
图 1。示意图显示了 Fagonia cretica 的分馏、它们的光谱和生物活性。
3.1。AgNPs 合成的生物还原活性
由于图 2所示的生物还原潜力。这表明纯 50% 馏分混合物是合成 NP 的最佳馏分。而 90% 和 70% 在 NPs 合成中的作用相对较小。但是纯 30% 的馏分混合物被证明是微不足道的。
银纳米粒子形成的生物还原过程通常通过紫外可见光谱显示 390 - 450 nm 的吸收峰。没有植物提取物的硝酸银溶液用作对照。植物酶、生物碱、多糖、氨基酸、醇类化合物、维生素和蛋白质的几种生物分子）可能导致银纳米粒子的生物还原和合成[ 2 ]。暴露于植物提取物后，银离子还原为银纳米颗粒，随后颜色和紫外可见光谱发生变化。从图 2中可以看出，50% 的 Fagonia 馏分产生最大峰，而 90%、70% 和 30% 的馏分则显示出显着降低的峰，没有生物还原潜力。
进一步确认合成的 Ag NPs 透射电子显微镜 (TEM) 的尺寸和形态与图 3中不同的乙醇混合分数一起使用。它清楚地描绘了平均尺寸为 16 nm 的圆形纳米颗粒，使用 50% 的馏分混合物，在所有馏分中提供了最显着的结果，如图 3 (c) 所示。90% 和 70% 也占合成的比例，但不如图 3 (a)、图 3 (b) 中那样显着。而图 3(d) 展示了 30% 的馏分混合物，结果不显着。这是因为特定组分在某些馏分混合物中表现出最大活性。在这种情况下，50% 的馏分混合物提供了最大生物活性实体的优化比例，平均表现出它们的最大潜力，从而优化了合成 Ag NPs 的生物还原潜力。在其他部分中，抗氧化剂、抗酪氨酸酶和抗脲酶发生了相当大的变化，其中一种被激活
图 2。Fagonia cretica 馏分合成银纳米粒子的生物还原活性。
图 3。具有不同Ag纳米颗粒合成分数的Fagonia cretica的TEM成像。
其他的则以其纯净和稀释的形式受到抑制，从而影响 Ag NPs 合成的整体生物还原潜力。
3.2. 抗脲酶活性
纯提取物和稀释液的所得抗脲酶活性 (AUA) 列在图 4中。在此比较提供 77% AUA 和 90% 馏分混合物的对照硫脲显示高达 87% 的纯活性、93% 的 D1 活性和约 64% 的 D2 活性。70% 馏分混合物分别得到 77% > 52% > 50% 纯度 > D1 > D2。接下来对于 50% 馏分混合物 AUA 是纯的 67%，但在对照中观察到 D1 和 D2 的阴性结果。然而，该部分被认为在植物中的其他生物活性方面表现出更显着的结果。接下来的 30% 部分显示 60% < 82% < 106%，纯 < D1 < D2 显示出显着的 AUA。
由于尿素酶将尿素转化为氨，从而在生物系统中产生碱度，从而导致细菌生长并引起严重感染 [ 31]。目前正在考虑使用脲酶阻断剂来评估由脲酶释放细菌等产生的溃疡和其他感染。因此，建立了专注于抑制脲酶活性以治愈传染病的新治疗方法。目前的工作报告说，在所有 Fagonia 级分（50%、60%、70% 和 90%）的定性分析中，显示出一些定性抑制等级，表现为从浅蓝色到深蓝色的色带变化，这表明这些级分含有一些能够与酶结合并产生显着颜色变化并避免尿素水解的活性生物分子。实际上尿素与试剂反应生成蓝色络合物。如果植物提取物含有脲酶
图 4。Fagonia cretica 纯级分及其稀释液的抗脲酶活性。
抑制潜力比测定的蓝色降低。还观察到，相对于对照（硫脲），纯级分 90% 和稀释液 I 显示出最大的抗脲酶潜力，确保了生物活性分子的存在。抗脲酶测定显示板的第一个两个孔包含没有颜色变化的对照。第3至第 6孔的颜色与对照相比，分别负载90％至30％的混合分数，从浅蓝色逐渐变为深蓝色，表现出抗脲酶活性的降低。进一步研究了具有 90% 稀释 I 级分和 30% 级分具有稀释 I 和稀释 II 的 Fagonia 显示出对脲酶的显着活性。以前阿曼多等人。报道了十种危地马拉胡椒物种的甲醇提取物的脲酶抑制活性 [ 32 ]。在这里，与对照相比，所有组分都表现出抗脲酶活性的显着相关性，这与已发表的数据相符 [ 33 ]。
3.3. 抗酪氨酸酶活性
抗酪氨酸酶活性评估列于图 5。以曲酸为对照，90% 馏分混合物显示 93% < 125% < 140% 活性，70% 馏分混合物显示活性为 100% > 66% < 90%，其次是 50% 馏分，其中活性为 26% < 52% < 96% 和最后 30% 制备的级分混合物贡献了 73% < 85% < 106% 的总抗酪氨酸酶活性，其中纯 < D1 < D2 相对于设定的对照。结果，90% 和 30% 的馏分混合物与稀释度相比，抗酪氨酸酶活性远高于对照，确保了白芨对酪氨酸酶活性的巨大潜力。
基于酪氨酸的肽或生物分子具有通过氧化 L-3, 4-二羟基苯丙氨酸显示酪氨酸酶活性的潜力。它导致黑色素（色素）分解，从而促进皮肤美白[ 34 ]。存在的预期天然产物包括植物螯合肽、类黄酮、
图 5。不同分馏法对酪氨酸酶活性的抑制作用。
芳香酸、多酚或芳香醛，因为这些化合物可以作为黑色素合成黑色素的有效竞争性抑制剂 [ 35 ]。蘑菇酪氨酸酶活性的变化可归因于提取物中单宁的存在能够沉淀蛋白质，从而限制酪氨酸酶抑制[ 36 ]。
从图 5中，筛选数据显示，90% 和 30% 的 Fagonia 部分在其所有稀释液中显示出强抑制潜力，但与标准曲酸相比，50% 稀释显示最低抑制百分比。在第 1 个中，两个孔显示了阴性对照的抗酪氨酸酶测定。这证实了多巴色素的形成。在第 2行，由于多巴色素形成的抑制，没有观察到颜色变化。在这些孔中，标准抑制剂是曲酸。第三至第六_线显示在不同浓度下不同稀释度的 Fagonia cretica 的抗酪氨酸酶潜力。此外，还观察到，90% Fagonia 馏分的稀释液 I 和稀释液 II 与所有其他馏分稀释液相比，其活性也有显着差异。并且比对照具有惊人的更高的抗酪氨酸酶潜力。从而证明 Fagonia cretica 是非常强的候选物，具有抗酪氨酸酶的高潜力。多种生物活性化合物的分离及其结构解释将为开发更有效的皮肤美白和抗衰老产品提供机会。
3.4. 抗氧化活性
抗氧化活性研究示于图6。结果和计算表明，它对纯馏分混合物产生负面或无效影响，除了纯 50% 比对照活性高 7%。在 D1 中，只有 50% 和 30% 的馏分混合物提供了 103% 和 75% 的活性。其中纯 50% 被认为是良好的稀释分数，其活性比对照高 3%。接下来在 D2 中，相对于对照，90% > 70% > 50% > 30% 级分混合物分别产生 25 < 107% > 50% < 111% 的活性。取决于馏分混合物，50% 馏分混合物被证明几乎是显着的
图 6。Fagonia cretica 部分及其稀释的抗氧化剂。
结果是纯的和 D1，但总体 D2 组混合物给出了比对照预期的更显着的结果。
Fagonia cretica 的抗氧化潜力可去除潜在有害的 NO。采用加拉特法清除 NO 自由基。按照这种方法，应该减少 不-3进入 不-2在样本中。亚硝酸根离子定量通过 Griess 反应进行。在以维生素 C 作为对照的反应结束时生成粉红色复合物。具有抗氧化活性的植物提取物导致粉红色减少。得出的结论是，90%、70% 和 30% 的 Fagonia 提取物具有较低的自由基清除或抗氧化活性，因为它产生深粉红色，而 50% 馏分混合物的颜色变为浅粉红色，这确保了显着的抗氧化潜力。先前的研究还表明，白花苜蓿根和地上部分的甲醇提取物具有抗氧化应激的抗氧化潜力 [ 16]。这表明这种植物可用作治疗氧化应激介导的疾病。用制备的稀释液观察到令人惊讶的更显着的结果。如在70% 馏分和 30% 馏分的第一次稀释中，没有观察到表明存在生物掩蔽实体的活性，已用所用的特定稀释液掩蔽了该活性。当第二次稀释时，这些化合物变得活跃并开始清除 NO 自由基。50% 的部分含有某些化合物，在第一次稀释时变得有活性，但在第二次稀释时被掩盖了稀释，因为它具有非常低的自由基清除活性。因此得出的结论是，与标准相比，90% 的 Fogonia 部分含有非活性化合物，而 70% 和 30% 的部分在第 2 次稀释时具有显着浓度的生物活性化合物，但 50% 的部分仅在第 1 次稀释时具有活性化合物。
植物中的生物实体包括多酚、类黄酮、单宁、萜烯、芳香醛和醇，但表面上是多酚，类黄酮具有抗氧化、酶抑制机制（即抗酪氨酸酶）和抗脲酶活性的作用。通过上述结果，这些活动以显着的差异速率发生，以响应由不同馏分混合物提供的化学变化环境，从而给出它们之间的相关性。据报道，总酚类和类黄酮含量提供了抗氧化剂与抗酪氨酸酶、抗脲酶、植物还原能力之间的相关性 [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40]。因此，如果 Ag NPs 的成功合成，则可以确保在生物实体之间提供化学优化的环境交叉干扰。
4。结论
Fagonia cretica 等传统植物被认为是天然、环保且成本较低的药物来源。分馏和双浸稀释法用于合成 Ag NPs 并分解负责合成的生物活性实体。Fagonia cretica 50% 分馏已成功用于合成 Ag NPs，这是由于其他有证据的生物活性（包括抗氧化剂、抗酪氨酸酶和抗脲酶）增强了生物还原活性。其中植物提取物的 90% 和 70% 乙醇部分对抗酪氨酸酶和抗脲酶活性更有效。植物提取物的 50% 乙醇馏分显示出抗氧化、抗脲酶的潜力。30%的植物提取物乙醇部分稀释两次后，抗氧化和抗脲酶活性变强。50% 和 30% 的植物提取物乙醇部分仅在高浓度使用时显示抗酪氨酸酶活性。因此，植物提取物的 50% 乙醇馏分具有更多的活性化合物（在所有馏分中）涉及各种药理活性。
致谢
作者要感谢巴基斯坦巴哈瓦尔布尔伊斯兰大学和高等教育委员会 (HEC) 资助的国家大学研究计划 (NRPU) (5194) 提供的财政和技术支持。
道德批准
该研究得到了巴基斯坦巴哈瓦尔布尔伊斯兰大学当地伦理委员会的批准。
笔记
*这些作者同等贡献这项工作。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
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