摘要：全身麻醉剂 (GA) 已经被发现了几个世纪，并且经常用于外科手术。然而，由于不同的原因，许多患者死于使用 GA。尽管科学家们正在努力解决这些问题，但遗传算法的机制仍然是一个谜。最近，杜克大学的科学家们发现，在睡眠期间活跃的神经元可以在麻醉中被激活。这些神经元被称为麻醉激活神经元 ( AANs )。这是我们解开谜团的一大步。在本文中，我们设计了一个实验，旨在揭示 GA 的一种机制：睡眠相关神经元与 GA 使用下的疼痛感之间的关系。设计的实验涉及几个对照组，这些对照组由对其基因进行不同处理和不同 GA 的小鼠组成。
关键词
全身麻醉药 (GA) ,麻醉激活神经元 (AANs) ,机制,睡眠相关神经元,疼痛通路
一、简介
长期以来，如何控制疼痛一直是一个可能影响每个人的问题 [ 1 ]。麻醉的发现，用于控制手术过程中的疼痛，在医学史上取得了相当大的成功。全身麻醉 (GA) 使用静脉注射药物和吸入气体（麻醉剂）的组合使患者进入无意识状态 [ 2 ]。异丙酚、七氟醚、舒芬太尼等是临床常用的GA。尽管 GA 广泛应用于外科手术，但我们并不完全了解 GA 如何导致患者失去知觉的确切机制。原因是科学家们还没有确定神经元和神经回路水平的机制，我们计算意识水平的能力仍然有限[ 3]。因此，患者仍然存在术中意识和其他并发症，这可能是由于主麻醉剂剂量不足、机器故障或误用 GA 输送方法 [ 3 ]。意识有两个维度，层次和内容。意识水平是指某人有意识的程度。意识的内容是指一个人在某一特定时刻的主观体验，例如梦[ 4]。通过分别影响意识的这两个维度，GA 可以分为两种机制：自下而上（皮层下）和自上而下（皮层）机制。“自下而上”范式声称麻醉剂诱发无意识是通过抑制意识水平产生的。这种方法解释了麻醉剂调节脑干和间脑中的睡眠-觉醒核和神经回路，这些神经回路已经进化到控制大脑皮层下区域的觉醒状态。“自上而下”范式指出，麻醉剂诱发无意识是通过降低意识内容而产生的。这种方法解释了麻醉剂调节参与神经元信息整合的皮质和丘脑皮质回路 [ 4 ] [ 5 ] [ 6]。尽管这两种机制存在争议，但我们的假设和实验设计都是基于自下而上的机制。GA 可以与神经元上的不同电压门控离子通道和神经递质门控离子通道相互作用，调节中枢神经系统中突触或突触外位点的突触传递和膜电位 [ 7 ]。通过这个过程，GA 可以激活视上核（SON）、腹外侧视前核（VLPO）和 paraSON 区（背侧 SON 的腹侧视前区）的神经元。这种神经元称为麻醉激活神经元 (AAN) [ 8]。通过使用 GA 激活 AAN，小鼠将达到理想的无意识状态：一种反向昏迷状态，由于相关神经元被精确控制，它们无法感觉到或对疼痛做出反应。科学家们发现，小鼠实验中的一些 AAN 在睡眠期间会变得活跃 [ 9 ]。这说明了为什么老鼠在被麻醉后会睡着。同时，小鼠不会感到疼痛，因为 GA 会阻断疼痛通路，这可能是由于腹后外侧 (VPL) 核的抑制或轴突在其活动到达体感皮层之前被阻断 [ 10 ]。从以上 GA 的结果，我们可以总结出 GA 的功能是诱导催眠和缓解疼痛。
因为 AAN 在睡眠和 GA 诱导的无意识状态下都被激活，我们假设与睡眠相关的神经元和疼痛的传导之间可能存在关系。因此，我们假设睡眠神经元可以调节痛觉的传播。在所有已知的与睡眠相关的神经元中，我们将重点研究 SON、paraSON 和 VLPO 区域的神经元。最近，一些研究已经确定了 GA 和睡眠的共同神经内分泌底物、加压素、强啡肽和甘丙肽。然而，到目前为止，还没有研究确定睡眠相关神经元与疼痛信号传递之间的关系 [ 8]。此外，相关实验通常使用幼虫斑马鱼模型。然而，由于其大脑与人脑有很大不同，其大脑皮层尚未完全发育，因此存在局限性[ 11 ]。将斑马鱼大脑的结构与老鼠的大脑进行比较；后者更类似于人脑。因此，我们的实验将在实验室小鼠身上进行，我们将通过全脑活动测量来检查疼痛感，同时操纵睡眠神经元的活动。通过实验，我们将揭示睡眠神经元的活动是否会调节疼痛信号向皮层的传递。
2. 实验设计
我们实验的目的是揭示与睡眠相关的神经元和疼痛感的关系。我们的实验将在老鼠身上进行测试。我们的实验有两个部分，我们将在每个部分中使用不同的鼠标。在第一部分中，我们的目标是通过使用（捕获激活的神经元集合）CANE 技术（图 1）确定有和没有 GA 注射的疼痛刺激激活的神经元。第二部分，我们的目标是确定在 GA 作用下疼痛刺激的神经元回路。
每部分设1个对照组和4个实验组，每组6只不同GA的小鼠。这些不同的 GA 用于判断一个特定现象在几个 GA 中是否广泛存在。至于第一部分，实验从胚胎状态下的Fos TVA基因敲入小鼠开始。然后根据分配的组和 GA 对小鼠施加 GA 和疼痛刺激。将小鼠处死并保存在 4˚C 后，小鼠大脑将使用 Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) 进行处理，这是一种组织清除技术，可以将完整的生物组织转化为三维透明水凝胶基结构 [ 12]，并将通过共聚焦显微镜进行检查。观察后可发现并确保疼痛激活的神经元。在第二部分中，将使用膜结合的 Thy1-GCaMP 转基因小鼠。经过一些操作和疼痛刺激后，将小鼠大脑切片，用抗加压素/强啡肽抗体染色，并通过共聚焦显微镜检查。可以发现 AANs 消融或基因沉默对疼痛通路神经元回路的影响（图 2）。
在实验的第一部分有30只老鼠。小鼠胚胎通过 Fos TVA敲入技术进行操作。将小鼠分为五组，每组包含六只小鼠，对应于六种不同的 GA，如表 1所示。应选择年龄超过八周的转基因成年雄性 Fos TVA小鼠并单独饲养至少一天。然后他们将受到以下操作。第一组小鼠不经历 GA 给药和 AAN 的消融。第二组小鼠经历 GA 给药，但没有消融 AAN。第三组小鼠通过白喉毒素给药体验 GA 给药和消融 SON、paraSON 和 VLPO 中的 AANs [ 13]。第四组小鼠通过敲除加压素/强啡肽基因以去除 SON 和 paraSON 在调节睡眠中的功能，从而在 SON 和 paraSON 中经历 GA 给药和 AAN 基因沉默[ 14 ]。第五组小鼠通过敲除 γ-氨基丁酸 (GABA) 和甘丙肽基因 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] 去除 VLPO 在调节睡眠中的功能，在 VLPO 中经历 GA 给药和 AANs 基因沉默（表 1）。小鼠应按照指定的 GA 给药，如表 2所示，给药过程应遵循适当的方法，并根据其体重使用正确的剂量。GA 给药后，所有小鼠都应失去知觉。
(一)(二)
图 1。CANE技术示意图和现象示例。(a) Fos TVA小鼠基因构建的示意图CANE 技术中激活的(Fos + ) 神经元的假型病毒。(b) 图像分析的一个例子。在 Fos TVA小鼠的社交恐惧经历之后，VMHvl 中 Fos（绿色）和 dsTVA（红色）表达模式的时间过程Sakurai, K., Zhao, S., Takatoh, J., Rodriguez, E., Lu, J., & Leavitt, A. 等人。(2016) 用 CANE 捕获和操纵激活的神经元集合描绘了下丘脑社交恐惧回路。神经元, 92, 739-753。https://doi.org/10.1016/j.neuron.2016.10.015
(一)(二)
图 2。我们实验的整体形象。(a) 麻醉剂激活的神经元（也是与睡眠相关的神经元）在大脑中的位置。这些神经元可能在给予 GA 后被激活。(b) 轴突追踪图像模型和 GA 可能阻塞的可能位置。
|
团体 操纵 |
疼痛刺激 | AANs 消融或基因沉默 | GA 管理 |
| 第 1 组 | 是的 | 不 | 不 |
| 第 2 组 | 是的 | 不 | 是的 |
| 第 3 组 | 是的 | SON, paraSON, VLPO | 是的 |
| 第 4 组 | 是的 | 儿子，副生 | 是的 |
| 第 5 组 | 是的 | 超大型飞机 | 是的 |
表 1。操纵五组小鼠，每组由6个人组成，对应一个特定的GA，后面会提到。
| GA 组 | 第 1 组 | 第 2 组 | 第 3 组 | 第 4 组 | 第 5 组 | ||
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静脉 注射 |
异丙酚 | 没有任何 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | |
| 氯胺酮 | 没有任何 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | ||
| 右美托咪定 | 没有任何 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | ||
| 吸入 | 七氟醚 | 没有任何 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | |
| 异氟醚 | 没有任何 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | ||
| 地氟醚 | 没有任何 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | ||
表 2。该表将根据体重填写每组小鼠的 GA 量。第一组的小鼠不会接受任何 GA。
经过上述操作后，小鼠将在其身体相同位置接受疼痛刺激。以相同的强度和持续时间控制刺激。然后将小鼠处死，用去污剂处理它们的大脑。接下来，CLARITY 将用于呈现疼痛激活的神经元。
我们能够找出第一组小鼠大脑中正常疼痛激活神经元的位置。CANE方法在疼痛激活区域应该有红色的Fos + 。在第二组中，通过GA给药，预计在疼痛激活区域将没有或很少量的红色Fos +。我们可以观察到相应区域的 AAN 是否也被 GA 激活。如果 AANs 被激活，但没有激活疼痛神经元，我们可以假设 AANs 能够阻断疼痛通路的神经元回路。在第三组中，随着 VLPO、SON 和 paraSON 区域神经元的消融，我们预测没有神经元（没有 Fos +表达）将在我们在第一组中发现的皮质体感部分的疼痛激活区域被激活。如果结果符合我们的预期，我们可以得出结论，与睡眠相关的神经元可以影响疼痛通路转导并阻止疼痛感到达皮层。之后，我们想找出 AAN 的哪一部分对疼痛通路的神经元回路的影响最为显着。因此，我们在第 4 组和第 5 组中有不同的对照组。在第四组中，SON 和 paraSON 区域的神经元被沉默。如果 Fos 只出现在丘脑而不出现在皮层，则意味着 VLPO 神经元可能阻止疼痛通路从丘脑到皮层的传导，而不是 SON 和 paraSON 神经元。如果Fos同时出现在丘脑和皮层，但数量少于第1组的表达，SON 和 paraSON 中的神经元被认为在脑干到丘脑和丘脑到皮层通路的疼痛释放中起重要作用。在第五组中，VLPO 中的神经元被沉默。如果 Fos 仅出现在丘脑而不出现在皮质中，则 SON 和 paraSON 中的 AANs 可能会阻止疼痛通路从丘脑到皮质而不是 VLPO 神经元的转导。如果 Fos 同时出现在丘脑和皮质中但少于第 1 组，我们将得出结论，VLPO 神经元在脑干至丘脑和丘脑至皮质通路的疼痛释放中起重要作用。SON 和 paraSON 中的 AAN 可能会阻止疼痛通路从丘脑到皮层的转导，但不会阻止 VLPO 神经元。如果 Fos 同时出现在丘脑和皮质中但少于第 1 组，我们将得出结论，VLPO 神经元在脑干至丘脑和丘脑至皮质通路的疼痛释放中起重要作用。SON 和 paraSON 中的 AAN 可能会阻止疼痛通路从丘脑到皮层的转导，但不会阻止 VLPO 神经元。如果 Fos 同时出现在丘脑和皮质中但少于第 1 组，我们将得出结论，VLPO 神经元在脑干至丘脑和丘脑至皮质通路的疼痛释放中起重要作用。
因此，通过上述实验，我们将能够发现睡眠相关的神经元是否在 GA 的给药下起到缓解疼痛的作用。如果是这样，我们可以进一步发现在 GA 的给药下，哪一部分神经元在疼痛释放中起最重要的作用。有三种可能的结果。第一个可能的结果是SON中的神经元，paraSON是阻断疼痛通路的重要部分。第二个机会是VLPO神经元是阻断疼痛通路的重要部分。第三个是SON、paraSON、VLPO神经元缺一不可，必须相互促进、共同激活才能达到最终的止痛效果。
Fos 表达提供了由有害刺激激活的神经元群体的广泛图像 [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]，但没有关于 Fos 激活基础电路的信息。尽管也有例外，但大脑中疼痛通路干预电路的图谱几乎是未知的。因此，设计了一种方法来追踪疼痛通路神经元回路，并找出 AAN 阻断的轴突上的确切位置，即神经元膜结合的 Thy1-GCaMP。GCaMP是一种Ca 2+指示剂，当神经元被激活时会显示出更强的绿色荧光，而当激活的神经元被阻断时会显示出较弱的绿色荧光。
然后，我们可以开始实验的第二部分。这部分有30只小鼠，和第1节的小鼠分在同一组。首先要得到神经元膜结合的Thy1-GCaMP转基因小鼠。然后将使用前面提到的相同消融和基因沉默方法对小鼠进行操作，以使其特征与每组的标准相匹配。GA给药后，给予相同强度和持续时间的疼痛刺激。然后将小鼠处死，并将其大脑切片。抗加压素/强啡肽/甘丙肽抗体将用于染色脑片并指示 AAN 可能影响的位置。在第一组，即没有给予 GA 的组中，我们可以在小鼠大脑中找到标准的疼痛通路轴突回路。在第二组中，在没有 AANs 消融的组中，抗加压素/强啡肽/甘丙肽抗体可用于对脑片进行染色，以确定 AANs 是否分泌这些肽。然后，可以通过观察有色抗体的位置来判断这些肽。如果肽出现在疼痛通路的大致所有部分（这表明第一部分第 1 组中的 Fos 表达），我们可以假设 AANs 分泌的肽可以阻断疼痛通路的突触连接。加压素/强啡肽/甘丙肽的位置将是判断 AANs 抑制的神经元的标准。在第1组和第2组的实验之后，我们应该在AANs中找到对疼痛通路有影响的神经元。之后，我们可以在这个激活的轴突追踪和肽定位实验中找到更具体的阻断位置。在第三，第四，和第五组，我们将通过观察与第一组相比，观察失活的轴突和肽位置后，弄清楚SON和paraSON区域或VLPO区域的AAN是否可以阻断轴突上某些位置的疼痛通路。我们假设由于 AAN 的消融，该组将没有肽，并且轴突颜色与第 1 组几乎相同。在第四组中，如果轴突颜色与第一组的强度相同，我们推断VLPO神经元不能起到缓解疼痛的作用。如果轴突比第 1 组轻并且出现肽加压素/强啡肽/甘丙肽，我们假设 VLPO 神经元具有疼痛通路阻断作用。至于第 5 组，情况则相反。与第一组相比，观察失活的轴突和肽位置后，我们将弄清楚SON和paraSON区域或VLPO区域的AAN是否可以阻断轴突上某些位置的疼痛通路。我们假设由于 AAN 的消融，该组将没有肽，并且轴突颜色与第 1 组几乎相同。在第四组中，如果轴突颜色与第一组的强度相同，我们推断VLPO神经元不能起到缓解疼痛的作用。如果轴突比第 1 组轻并且出现肽加压素/强啡肽/甘丙肽，我们假设 VLPO 神经元具有疼痛通路阻断作用。至于第 5 组，情况则相反。与第一组相比，观察失活的轴突和肽位置后，我们将弄清楚SON和paraSON区域或VLPO区域的AAN是否可以阻断轴突上某些位置的疼痛通路。我们假设由于 AAN 的消融，该组将没有肽，并且轴突颜色与第 1 组几乎相同。在第四组中，如果轴突颜色与第一组的强度相同，我们推断VLPO神经元不能起到缓解疼痛的作用。如果轴突比第 1 组轻并且出现肽加压素/强啡肽/甘丙肽，我们假设 VLPO 神经元具有疼痛通路阻断作用。至于第 5 组，情况则相反。我们假设由于 AAN 的消融，该组将没有肽，并且轴突颜色与第 1 组几乎相同。在第四组中，如果轴突颜色与第一组的强度相同，我们推断VLPO神经元不能起到缓解疼痛的作用。如果轴突比第 1 组轻并且出现肽加压素/强啡肽/甘丙肽，我们假设 VLPO 神经元具有疼痛通路阻断作用。至于第 5 组，情况则相反。我们假设由于 AAN 的消融，该组将没有肽，并且轴突颜色与第 1 组几乎相同。在第四组中，如果轴突颜色与第一组的强度相同，我们推断VLPO神经元不能起到缓解疼痛的作用。如果轴突比第 1 组轻并且出现肽加压素/强啡肽/甘丙肽，我们假设 VLPO 神经元具有疼痛通路阻断作用。至于第 5 组，情况则相反。
3. 方法
3.1。技术介绍
CANE（捕获激活的神经元集合）
用工程小鼠和病毒捕获激活的神经元集合 (CANE) 是一种标记、操纵和跨突触追踪神经回路的技术，这些神经回路在行为情况下以高效率和时间精度瞬时激活 [ 13 ]。Fos 是一种立即早期基因 (IEG)，被广泛用作响应各种感觉刺激的激活神经元的可靠标记 [ 21 ]。CANE 技术可以选择性且有效地标记 Fos +神经元。开发 CANE 技术的研究人员设置了一个名为 Fos TVA的基因序列，将其转染到小鼠体内，呈现刺激后的神经元活动。在分析偶然关系时，脑组织应该被EnvA包被（假型）病毒感染，以诱导dsTVA/Fos的表达，这表明了神经元的活动。EnvA-LV 和 EnvA-RV 是两种假型病毒。EnvA-LV是一种无毒病毒，可以稳定的转基因表达；因此，它们非常适合在瞬时 Fos +神经元中引入和持续表达所需的转基因。单突触 RV 可用于跨突触追踪，将突触前输入输入到 Fos +神经元 [ 13 ]。
为了了解睡眠相关的 AAN 在给予和不给予 GA 的情况下是否对疼痛信号转导有影响，我们将测试受操纵小鼠中的 Fos 表达。Fos表达水平可以指示转基因Fos TVA敲入小鼠疼痛刺激后大脑不同区域神经元的活动。mCherry 是一种红色荧光蛋白，我们将使用 EnvA-LV-mCherry 检测 Fos 表达并评估神经元活性 [ 13 ]。
轴突追踪：用神经元膜结合的 Thy1-GCaMP 标记神经元回路
疼痛的感觉是由从疼痛（有害）刺激特异性激活的伤害感受器开始的上行疼痛通路产生的。然后，受体将“有害”信息转换为电信号，并沿轴突将其从外围传输到中枢神经系统。在我们的实验中，我们将通过轴突膜靶向绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达来追踪传递疼痛的轴突。GCaMP 由绿色荧光蛋白 (GFP)、钙调蛋白和 M13（肌球蛋白轻链激酶的肽序列）融合而成 [ 22]。通过应用 GCaMP，可以通过电压门控钙通道检测钙流入来间接监测神经元中动作电位的产生。GCaMP 的敏感性及其高表达水平对于获得最佳信噪比至关重要，因此对于成功检测神经元活动 [ 22 ]。在我们的实验中，我们将构建一个神经元膜结合的 GCaMP 基因，然后转染到成年小鼠中，这样它就可以在 GA 内外疼痛刺激期间显示神经元回路。
明晰
Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) 是一种组织清除技术，是一种先进的技术，可以将完整的生物组织转化为具有所有基本结构的三维透明水凝胶基结构 [ 12 ] . 在 CLARITY 操作后，由于水凝胶骨架支撑，膜结合的 GFP 和 Fos 仍然存在。因此，我们将使用 CLARITY 来观察疼痛信号的回路和 Fos 的表达。
3.2. 设计程序
生成 CANE 技术需要 Fos TVA敲入小鼠
Fos TVA敲入小鼠将通过插入 2A 序列、随后是不稳定的核 CFP（nCFP 融合 PEST 序列）、第二个 2A 序列、随后是不稳定的 TVA（结合 PEST 序列的 TVA）、bGH polyA 和通过同源重组，紧接在 Fos 编码序列的终止密码子之前的 Frt 侧翼 PGK-新霉素抗性盒。然后将转基因小鼠喂养到成年状态[ 13 ]。
CANE 捕获激活的神经元
在生成 Fos TVA敲入小鼠后，五组小鼠的 AAN 将通过一些消融来操纵。最近的研究 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] 发现 VLPO 分泌的 γ-氨基丁酸 (GABA) 和甘丙肽是与睡眠相关的神经内分泌底物。SON、paraSON 神经元分泌的加压素或强啡肽可促进睡眠[ 14 ]。因此，一些神经元的消融可以通过使用同源敲除删除功能性神经内分泌底物基因来实现。
8 周以上的转基因成年雄性 Fos TVA小鼠将单独饲养至少一天，然后进行操作，如表 1所示。我们将给每组的小鼠注射六种不同的 GA（丙泊酚、氯胺酮、右美托咪定、七氟醚、异氟醚、地氟醚）。异丙酚、氯胺酮和右美托咪定是静脉注射 GA，而七氟醚、异氟醚和地氟醚是吸入 GA。每只小鼠都会根据体重给予一定量的 GA，以确保 GA 对它们的影响相同（表 2，取决于真实数据）。然后应该生产或购买病毒 EnvA-LVs-mCherry。通过针刺对这五组小鼠进行疼痛刺激两小时后，将EnvA-LVs-mCherry引入Fos TVA小鼠的大脑中，以捕获疼痛激活的神经元。
清晰度观察
疼痛刺激五分钟后，将小鼠处死并保存在 4°C。水凝胶聚合物必须从组织内部生长，以支持小鼠大脑的结构和分子含量。这可以通过将 4˚C 水凝胶单体混合物、甲醛和热触发引发剂注入组织中来完成 [ 12 ]。甲醛具有双重目的，即使含胺组织成分彼此交联，并将水凝胶单体共价结合到天然生物分子上，包括蛋白质、核酸和其他小分子，但不包括膜。然后，水凝胶聚合由 37˚C 的热量引发 [ 12]。由于甲醛的结合作用，现在可以从大脑中提取脂质，而不会破坏大脑的重要成分。这可以通过在 37˚C [ 12 ] 下使用基于强离子洗涤剂的清洁溶液 [硼酸盐缓冲 4% (wt/vol) SDS] 来实现。大脑清理干净后，将其浸入折射率 (RI) 均质溶液中 [ 12 ]。随后构建三维大脑模型是使用高分辨率共聚焦显微镜对大脑进行可视化。可以检测到先前标记的疼痛电路和可以表达 Fos 的神经元。
Thy1-GCaMP转基因小鼠
GCaMP2.2c基因将通过将GCaMP2.0的第二个精氨酸变为缬氨酸和将118处的丝氨酸变为半胱氨酸来产生。GCaMPs 的所有体外表达构建体都通过 2A 肽 (P2A) 序列与 tdTomato 的编码序列连接，并亚克隆到修饰的 pBluescript 质粒中，该质粒含有 CAG 启动子（巨细胞病毒早期增强子元件和鸡 β-肌动蛋白的组合）发起人）。在生成 Thy1-GCaMP 转基因小鼠时，应将 GCaMP2.2c 和 GCaMP3 编码序列克隆到 Thy1 转基因结构中。之后，必须通过测序验证所有结构。胚胎需要通过提前交配F1杂种获得。然后，准备好的胚胎将使用标准技术注射凝胶纯化的 DNA，以产生 Thy1-GCaMP 转基因小鼠 [ 23] [ 24 ]。
4. 数据分析
4.1。第一节
通过使用 CLARITY，可以显示每个具有红色 Fos +表达的小鼠组的脑图。首先，通过第1组和第2组的比较，将揭示AANs是否有效阻断疼痛通路的神经元回路。如果第 1 组和第 2 组的图表表明 AANs 可以阻断疼痛通路的神经元回路，则将通过积分测量和计算红色 Fos +表达的面积。之后会比较结果。根据这些结果，可以对区域（VLPO）或区域组合（VLPO、SON、paraSON/SON、paraSON）在阻断疼痛通路的神经元回路方面的有效性进行排名。
4.2. 第二节
将记录第1组和第2组的抗体染色图像。这两组之间的比较可以证明 AAN 是否可以在缓解疼痛的过程中产生某些神经递质。如果 AANs 被证明能有效缓解疼痛，我们可以继续分析第 3、4 和 5 组。最后三组 GFP 的颜色强度将由软件 Adobe Kular 记录。然后，将呈现实验组的图像。通过对比变化前（即第1组的图像）和变化后的照片（即第3、4、5组的图像）的差异，可以找到痛觉通路的位置。每个图形的 GFP 颜色强度将由计算机计算。将记录数据，并根据数据创建条形图。
对每一种遗传算法都应该重复上述分析。比较每个 GA 下 AAN 有效性的最终结果。从比较中，分析AANs的效果是普遍的还是随着不同的GA而不同。
5. 讨论
因设备所限，以上仅为实验建议。科学家们将不得不根据他们的资源选择一种老鼠进行实验。但是，实验中使用的所有小鼠都必须是雄性，并且年龄超过八周。在本节的其余部分，我们将讨论实验的理想结果。
通过实验的第一部分，应该发现与睡眠相关的神经元活动是否可以阻断疼痛通路。这个实验的理想结果是睡眠相关的神经元活动可以阻断疼痛通路，然后可以进行下一部分实验。在理想状态下，可以找到疼痛传导的阻断位置及其初步机制。但是，所设计的实验是一个理论模型，在操作过程中需要注意一些细节。在进行 Fos TVA敲入技术时，我们应确保 Fos TVA基因成功插入小鼠胚胎。老鼠长大后，我们需要在总验证实验前检查Fos表达筛选。通过敲除神经元功能肽基因可以达到目标神经元沉默是一种理论设计。我们知道敲除基因也可能改变其他重要的新陈代谢。因此，在敲除功能肽基因后，我们应该增加一些行为测试来检查小鼠的活动情况，以确保它们是否有异常的死亡率和除睡眠相关活动之外的活动。如果有大量死亡或小鼠有精神障碍，我们将通过查阅文章，找到只消融VLPO或SON/parason神经元的药剂，将基因敲除改为神经元消融。在做 CLARITY 技术的过程中，我们应该通过控制温度来确保热触发程序不会使 CANE 实验中的红色荧光蛋白失活。在实验的第二部分，还需要筛选转基因 Thy1-GCaMP 小鼠。我们将观察轴突绿色荧光强度并将其与对照组进行比较。因此，需要高分辨率显微镜来保证绿色荧光强度的可区分性。在进行抗体染色的步骤中，应该使用三种肽加压素/强啡肽/甘丙肽抗体，因为我们还不确定在不同的神经元消融或基因沉默条件下哪种肽在疼痛通路阻断中起作用。
如果在完成所有设计的实验后出现理想的结果，则可以进行以下进一步的研究。科学家们可以通过使用该协议来测试更多的 GA，以发现与睡眠相关的神经元与疼痛信号的转导之间的更多关系。然后外科医生可以根据实验结果选择遗传算法，并将不同的遗传算法应用于不同的场景。此外，这个实验可能会导致对遗传算法机制的更深层次的理解。基于睡眠相关神经元与疼痛信号转导的关系，科学家可以改进现有的 GA 并发明新的 GA。科学家可以研究与睡眠和疼痛相关的 GA 并发症和后遗症，并可能找到防止这些情况发生的方法。
六，结论
我们的实验旨在检验睡眠神经元活动可以调节疼痛信号向皮层传递的假设。通过相应的转基因小鼠，我们的实验旨在显示激活的神经元和激活的神经元回路。在我们实验的第一部分，可以找到疼痛激活的神经元。也可以发现对阻断疼痛信号传导作用最显着的AANs的部分或多个部分的组合。在我们实验的第二部分，我们将弄清楚 AAN 如何以及在何处阻断疼痛信号转导。如果在疼痛激活区域检测到加压素/强啡肽/甘丙肽，而小鼠大脑皮层没有信号，我们可以假设睡眠神经元被 GA 激活，它们可以分泌作用于疼痛通路的肽。之后，通过激活轴突追踪，轴突上较轻和较弱的 GFP 可以告诉我们轴突上疼痛信号消失的位置。最后，我们可以评估我们的假设并找出阻断神经元的重要疼痛通路及其初步机制。
致谢
我们感谢国泰科学研究所让我们与杰出的教授和尖端技术会面，这帮助我们完成和改进了论文。
笔记
*这些是共同第一作者，按姓氏字母顺序排序。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
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