摘要：石莼是一种存在于石莼物种细胞壁中的硫酸化杂多糖，具有独特的结构特性和技术潜力。在这里，我们通过 FTIR 和 NMR 分析从自然环境 (SEA) 中收集的石莼和富营养水 (CULT)中的体外生物质培养后的石莼结构表征。CULT 绿藻硫化多糖的 FTIR 光谱呈现出比 SEA 更强的硫酸盐基团信号。1小时和13核磁共振表明两种绿藻糖都主要由A型和B型绿藻糖醛酸3-硫酸盐组成。SEA绿藻糖呈现木糖的信号特征，表明其结构中存在绿藻二糖，而CULT则呈现出A型二糖的大部分信号。石莼的种植可以成为满足对石莼满足质量和数量要求的新兴需求的替代方案。
关键词
硫酸 多糖,水产 养殖, FTIR 分析, NMR 分析,生物 技术
一、简介
海洋生态系统是具有独特物理化学特性的大分子的丰富来源 [ 1 ]。从这个意义上说，从海洋大型藻类中提取的多糖由于其多样性、生物相容性和其他任何生物体所没有的结构特征而受到越来越多的关注[ 2 ]。
石莼属的物种是绿藻科中最丰富和世界性的大型藻类，能够以高生产力和机会主义生长适应不同的地理气候条件。由于其作为功能性食品、饲料和生物燃料的潜力，石莼在全球范围内的种植正在增加 [ 3 ] [ 4 ]。尽管红色（角叉菜胶和琼脂）和棕色（海藻酸盐）大型藻类的多糖已用于食品工业，但绿色大型藻类的多糖在很大程度上仍未开发。石莼属的主要多糖是石榴石，占干重的 29%，具有广阔的技术应用前景。
绿藻黄均匀分布在细胞间隙和纤维壁 [ 5 ] [ 6 ] 中，负责维持渗透压稳定性和保护菌体免受海洋细菌攻击 [ 2 ] [ 7 ]。Ulvan 由不同数量的鼠李糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、木糖和硫酸盐组成 [ 8 ] [ 9 ]。这种硫酸化杂多糖建立在两个主要重复二糖单元的序列上，称为 ulvanobiuronic acid 3-sulfate type A (A3s) [→4)-β-D-GlcA-(1 → 4)-α-L-Rha 3S-( 1→] 和 B 型 (B3s) [→4)-α-L- IdoA-(1 → 4)-α-L-Rha 3s(1→] [ 10 ] [ 11]。木糖（O-2 硫酸化或未硫酸化）的少量硫酸化残基，命名为 ulvanobiose (U3s) [→4)-β-d-GlcA-(1-2)-α-D- Xyl-(1→] 也可以发生在适当的位置糖醛酸 [ 12 ]。
随着人们对新型和可再生聚合物的兴趣日益浓厚，绿藻硫化多糖引起了人们的关注，研究表明它具有作为抗氧化剂 [ 13 ] [ 14 ]、抗病毒 [ 15 ] [ 16 ]、抗癌 [ 17 ] [ 18 ] 等 [ 19 ] [ 20 ] 的潜力] [ 21 ]。显着的稀有糖、鼠李糖和艾杜糖醛酸的存在，类似于哺乳动物的糖胺聚糖 [ 4 ] [ 9 ] 从其他藻类多糖中挑选出绿藻硫化多糖。L-鼠李糖用于各种抗衰老化妆品 [ 21 ] [ 22] 被许多哺乳动物凝集素特别认可 [ 6 ]。艾杜糖醛酸从未在藻类多糖中被发现 [ 5 ] [ 23 ] 是合成用于对抗呼吸道合胞病毒感染和抗血栓形成活性的肝素类似物所必需的 [ 24 ] [ 25 ]。目前，这种物质是通过几个步骤获得的，这些步骤可以避免使用 ulvan [ 5 ] [ 25 ]。
尽管绿藻泥的生物技术应用前景广阔，但由于生态生理因素作用于石莼 [ 26 ] [ 27 ]，可能会发生结构变化。多糖的商业用途需要具有可预测结构和功能特性的石榴石，这可以通过石莼的受控培养来获得。为了确定在这项工作中培养的石莼对石榴石生产的潜力，我们在营养丰富的水中进行体外生物质培养后，表征了（FTIR 和 NMR）从石莼（绿藻门）中提取的石榴石提取物，并将其与在贫营养池中收集的生物质中的石榴石进行了比较。自然环境，增强潜在的结构差异。
二、材料与方法
2.1。藻类材料
在巴西 Arraial do Cabo/RJ 的 Prainha 海滩 (22˚57'40"S/042˚01'13"W) 的潮间带收集了健康的石莼菌体，用当地海水冲洗并运送到冷却器内的实验室。用蒸馏水清洗个体以进一步去除沉积物和宏观表观生物。通过分子研究（使用 tuƒA 标记进行条形码）确定作为 U. fasciata 的物种水平鉴定 [ 28]。凭证标本存放在巴西圣保罗大学的生物科学研究所植物标本馆 (SPF-57877)。将部分新鲜生物质 (SEA) 在 50°C 烘箱中干燥至恒重，然后储存在干燥器中直至提取绿藻硫化多糖。剩余的材料用于培养实验（CULT）。来自自然环境和栽培实验（分别为 SEA 和 CULT）的生物质用于绿藻硫化多糖提取（图 1）。
2.2. 石莼栽培
为了确保所有个体都表现出可比较的初始生理条件，U. fasciata thalli 经历了 7 天的实验室条件适应期，然后在培养前进行了 3 天的饥饿期。为了适应环境，将个体保持在富含 von Stosch 培养基 [ 28 ] 的无菌海水中，温度控制在 24.0 ± 1.0˚C、70 μmol 光子 m -2 ∙s -1光合有效辐射 (PAR) 和 12 小时光周期。饥饿时，将体重约 3.5 g 的个体放入 2.8 L Erlenmeyer 烧瓶中，瓶中装有紫外线消毒的天然海水（营养浓度——0.5 µM NH 4、0.03 µM NO 2、0.41 µM NO 3和 0.09 µM PO3- 4)。
为了培养，将体重为 3.0 ± 0.11 g 的饥饿个体培养在 3 升锥形瓶 (n = 4) 中，该瓶中装有富含 200 µM 铵 (NH 4 Cl)、8 µM 硝酸盐 (NaNO 3 )、12 µM磷酸盐（Na 2 HPO 4 ∙12H 2 O），
图 1。绿藻硫化多糖提取和表征步骤的示意图。
盐和维生素 [ 29 ]。在对具有石莼种植潜力的重要巴西海湾 [ 30 ]的一个点进行五年监测后，参考平均最大营养浓度选择营养浓度。保持适应期和饥饿期相同的光照、光周期和温度条件。实验持续了五天。
2.3. 绿藻萃取
培养后，用蒸馏水洗涤个体以去除盐分，并在 50°C 烘箱中干燥至恒重。根据[ 31 ]所述的方法提取多糖。将干燥的藻类生物质（SEA 和 CULT）研磨成粉末，悬浮在超纯水 (Milli-q® ) (100 ml/10g) 中并在 120˚C 高压灭菌 40 分钟。将上清液在 10,000 g 和 4°C 下离心 10 分钟（Eppendorf 离心机 5810 r）。Ulvan 用三倍体积的超纯乙醇 (Merck ® ) 沉淀，在 – 20˚C 下冷却 48 小时，然后在 4˚C 下以 3500 g 离心 5 分钟。将回收的颗粒（绿藻硫化多糖）冷冻干燥。使用[ 32 ]提出的公式计算出绿藻硫化多糖的提取率为16.29%±0.93% ：
绿藻黄产量( % ) = (WeWF) ⋅100(1)
其中，W e是提取的绿藻硫化多糖干重，W f是大型藻类干重。
2.4. 傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 分析
在室温下在分光光度计（IR Prestige_21，Shimadzu）上记录具有傅里叶变换（FT-IR）的 Ulvan（SEA 和 CULT）红外光谱。FT-IR光谱在400-4000 cm -1的透射模式下获得。使用含有 2.5 mg 绿硫黄粉末的KBr (Merck ® ) 颗粒记录透射光谱。
2.5. 核磁共振光谱
NMR 分析使用 Varian VNMRSYS 500 MHz 光谱仪（Varian Inc.，Palo Alto，CA，USA）在 37°C 下进行。质子和碳的工作频率分别为 499.77 和 125.68 MHz。以 90 度观察脉冲宽度 (pw = 90 µs)、2.04 秒的采集时间和 1 秒的弛豫延迟记录1 H NMR 光谱。每个样品总共进行了 32 次扫描。对于13 C NMR，使用 90 度脉冲（pw = 90 µs），采集时间为 1.04 秒，弛豫延迟为 2 秒，总共收集了 114.624 次扫描。Ulvan 样品 (2% w/v) 溶解在 D2O 99.99% (Sigma-Aldrich ® ) 中。1 H和13 C NMR化学位移以百万分之几(ppm)表示。
3。结果与讨论
FTIR 和 NMR 光谱是快速且无损的分析，可提供有关绿藻多糖结构的基本信息 [ 26 ]。在这项工作中，这些技术表明来自自然环境 (SEA) 和栽培的 U. fasciata (CULT) 的多糖主要由鼠李糖、艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸、硫酸盐以及在 SEA 的情况下为木糖的情况下构成。
SEA 和 CULT ulvan 的红外光谱如图 2 所示，信号分配通过与公布的数据 [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] 进行比较提供。CULT 和 SEA 光谱呈现出文献 [ 34 ] [ 36 ] [ 37 ] 中描述的所有特征峰，证实提取的多糖是绿藻硫化多糖。根据 FTIR 光谱，两种绿藻硫化多糖提取物与文献 [ 14 ] [ 17 ] [ 33 ]中报道的提取物没有明显差异。
3300 cm -1附近的吸收带归因于羟基（OH）的拉伸。在大约 2937 cm -1处观察到的信号是由于 CH 伸缩振动，是多糖的特征 [ 14 ]。在 1651 和 1435 cm -1附近的两个光谱中都存在具有相似强度的糖醛酸羧酸盐基团的带。1147 和 848 cm -1之间的吸收被称为绿藻硫化氢的指纹区，是最重要的吸收。在 983 cm -1处信号是糖苷键振动的特征，在 848 cm -1处对应于硫酸盐的 COS 在轴向位置的弯曲振动。峰高 900 厘米两种绿藻硫化多糖样品中的-1是硫酸盐存在的特征。
硫酸盐基团的存在、程度和分布对于确定绿藻硫化多糖的生物活性很重要 [ 9 ]。在 1159 和 625 cm -1之间，CULT 绿藻硫化多糖呈现出比 SEA 更强的硫酸盐基团信号。以往的研究发现，绿藻硫化多糖的抗氧化活性和对生理应激的调节与其硫酸盐含量有关[ 38 ][ 39 ]。这一结果表明 CULT 绿藻硫化多糖可能具有更高的抗氧化潜力。
13 C NMR谱如图3所示，具有典型的绿藻硫化多糖信号。
图 2。来自自然环境 (SEA) 和在 400 至 4000 cm -1之间的受控条件 (CULT) 中培养的石莼的红外光谱。
图 3。在自然环境 (SEA) 中收集并在体外培养 (CULT) 的石菖蒲的13 C NMR 光谱 (ppm)。残基 A = 鼠李糖，B = 葡萄糖醛酸，C = 艾杜糖醛酸，D = 木糖。
结构归因于与已发布数据的比较 [ 11 ] [ 12 ] [ 40 ] [ 41]。鉴定了构成 A 型硫代糖醛酸 (A3s) 的鼠李糖和葡萄糖醛酸的碳以及归因于 B 型硫代糖醛酸 (B3s) 中与艾杜糖醛酸连接的鼠李糖 3-硫酸盐的化学位移，证实提取的多糖主要由重复这两种二糖的序列。对应于碳环的共振区域中的信号（在 CULT 和 SEA 中分别为 70.06 - 80.28 ppm 和 69.60 - 79.88 ppm），鼠李糖的 C-6 甲基基团在 19 ppm 左右，糖醛酸的羧基信号在大约 177 ppm 存在. 在 SEA 中观察到进一步指定的异头碳 (99.28 - 104.62 ppm) 信号。
在13 C NMR 光谱中观察到的噪声与由于聚合物的高分子量和溶液粘度而增加的样品稀释度有关。Ulvan 分子量可在 1.8 × 10 5到 2 × 10 6之间变化，具体取决于样品的提取方法、种类和多分散性 [ 32 ] [ 43 ]。根据[ 6 ] ulvan
图 4。在自然环境 (SEA) 中收集并在体外培养 (CULT) 的石莼石菖蒲的1 H NMR 光谱 (ppm)。残基 A = 鼠李糖，B = 葡萄糖醛酸，C = 艾杜糖醛酸，D = 木糖。
在 80°C - 90°C 的温度下提取，接近本研究中使用的温度，往往呈现更高的分子量。
在SEA 绿藻硫化氢的13 C 和1 H NMR 光谱中，我们可以观察到木糖的信号，表明在这种绿藻硫化氢结构中存在绿藻黄二糖 (U3s)。在 CULT 中，我们无法检测到 U3，但存在 A3 二糖（4.82 ppm）中鼠李糖 C-1 的峰特征 [ 6 ]。根据 [ 27 ] 在石莼的活跃生长过程中，大型藻类倾向于合成更多的 A 型石榴糖醛酸，而石榴糖二糖的产生受到发育调控。在这项研究中，U. fasciata 在整个培养实验中表现出 5.7% 的平均增长率（第-1天）和活跃的养分吸收（数据未显示），这表明个体在收集时尚未达到其生长平台期。
在这项研究中，两种绿藻硫化多糖都呈现出相似的整体结构，但来自栽培的 U. fasciata 的绿藻硫化氢呈现出更强的硫酸盐信号，而来自自然环境的绿藻硫化氢则具有木糖的信号。未来关于纯化和糖定量程序的研究可以帮助阐明两种绿藻硫化多糖样品的精细结构，并评估 CULT 绿藻硫化多糖在抗氧化等不同应用中的功效。
4。结论
具有预测结构和必要数量的 ulvan 的生产是 ulvan 市场发展的障碍之一。此处收集的结果表明，来自栽培 U. fasciata 的绿藻硫化多糖与文献报道的相似，可能是获得这种多糖的来源。通过控制非生物条件，可以最大限度地满足商业需求。
致谢
我们感谢帮助改进这份手稿的审稿人。这项研究的部分资金来自 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 和巴西国家科技与科学发展委员会 (CNPq)-Productivity Fellowship (YYV-301938/2019-9 ）。
笔记
1 H NMR 光谱如图 4 所示，与每个氢原子相关的信号根据参考数据 [ 17 ] [ 32 ] [ 41 ] [ 42 ] 分配。鼠李糖和艾杜糖醛酸的异头质子在 4.28 - 5.13 ppm 之间存在。鼠李糖的质子化学位移显示为 1.30 ppm。葡萄糖醛酸化学位移在 3.36 和 3.79 ppm 之间。木糖信号在 SEA ulvan 处显示为 3.20 和 5.27 ppm。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
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