摘要：红棕象鼻虫 (RPW)，Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (鞘翅目，Curculionidae)，被认为是巴林王国枣椰树中最具破坏性的害虫之一。RPW 对枣椰树的大规模侵染导致 RPW 幼虫过度摄食，这是由 RPW 中存在的微生物进行的，并在树干内产生湿发酵物质。从饲料废物中分离出培养依赖性细菌，并通过使用 8F 和 1492R 通用引物对 16S rRNA 基因进行测序来鉴定。在培养依赖性分离细菌中，鉴定出 80% 通过比较NCBI数据库中的16S rRNA基因序列，使用GenBank中的BLAST程序。85% 的已鉴定细菌为革兰氏阳性菌，其余为革兰氏阴性菌。大量的细菌来自芽孢杆菌科，与 NCBI GenBank 相比，鉴定出16 种不同的芽孢杆菌。已鉴定菌株的 16S rRNA 基因序列已提交给 GenBank。使用16S rRNA基因序列研究系统发育关系，革兰氏阴性细菌属于一个进化枝，而革兰氏阳性不同芽孢杆菌属。并且菌株彼此表现出进化上的接近性，因此，它们在系统发育树的三个不同亚进化枝下的一个主要进化枝中出现。新芽孢杆菌的发现巴林王国枣椰树自然栖息地中的菌株，保证在 RPW 生物防治研究领域进行广泛的研究。
关键词
红棕榈象鼻虫 (RPW) ,细菌,枣椰树,饲料废物, 16S rRNA
一、简介
红棕象鼻虫（RPW），Rhynchophorus ferrugineus Olivier（鞘翅目：Curculionidae）被认为是全球不同棕榈属中分布最广、入侵最广泛的害虫之一，而枣椰树就是其中之一[ 1 ]。RPW 首次报道于 1980 年代后期来自南亚和东南亚的椰子树（Cocos nucifera）。逐渐地，该害虫的传播范围扩大到中东、地中海盆地、非洲、欧洲、澳大利亚、加勒比海岛屿和美国 [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5]。枣椰树（Phoenix dactylifera, L. Arecales: Arecaceae）是巴林王国具有重要社会经济意义的单子叶木本多年生植物。目前，该国枣椰树的主要威胁是红色棕榈象鼻虫，Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera, Curculionidae)。红棕象鼻虫 (RPW) 是一种侵入性蛀木昆虫，自 1990 年代中期首次在巴林王国引入和攻击枣椰树以来，已造成严重破坏 [ 6 ] [ 7 ]。RPW 是枣椰树最具破坏性的害虫之一，枣椰树是干旱、热带和亚热带地区的主要果树[ 8 ]。RPW 被认为是世界上许多棕榈树种的严重害虫之一，并且可以承受极端天气 [ 9] [ 10 ]。
作为一种无聊的昆虫，成年 RPW 会穿透枣椰树茎并以它为食。虫害通过在树干内用褐色废物制造空心隧道并最终杀死树木，从而改变了棕榈树的健康状况。因此，严重出没的手掌很容易塌陷[ 11 ]。如果不治疗，RPW 的发作会在 6-8 个月内导致枣椰树死亡 [ 12 ]。木材喂养以其与多种微生物的复杂关联而闻名 [ 13 ] [ 14 ]。这种昆虫造成的重大环境和经济损害可能部分归因于细菌的共生关系[ 15]。象鼻虫的肠道菌群含有丰富的共生菌群，在象鼻虫的消化系统和营养吸收中发挥着重要作用[ 16 ][ 17 ]。此外，还有一份关于象鼻虫肠道微生物群季节性变化的报告[ 18 ]。
RPW 幼虫在棕榈树的顶端生长点内尽情进食，并在隧道内产生潮湿的发酵咀嚼废料，并造成广泛的破坏 [ 19 ] [ 20 ]。健康、未发酵的棕榈汁含有葡萄糖和蔗糖，缺乏有机挥发物 [ 21 ]。然而，当它暴露在细菌中时，它们会使用这种糖作为底物来产生发酵的咀嚼废物，其中含有酒精、乙酯、石炭酸、乙酸盐和硫化合物，并导致棕榈树液发出难闻的气味 [ 22 ]。据报道，幼虫的摄食活动是由具有发酵代谢的兼性和专性细菌介导的 [ 14 ] [ 15 ]]。三种不同芽孢杆菌的分离。是唯一一份来自埃及红枣椰枣植物的报告 [ 23 ]。尽管 RPW 及其在枣椰树中的幼虫造成了巨大的破坏，但在国际上很少得到承认，没有对其在巴林王国栖息地的微生物群进行研究。因此, 对 RPW 栖息地微生物群落的研究需要进行调查, 这可能有助于巴林王国 RPW 种群的生物控制措施的发展。通过使用 16S rRNA 扩增鉴定微生物群落：通过 PCR 编码 DNA (rDNA) 或 16S rRNA 揭示了巨大的系统发育多样性 [ 24 ] [ 25 ] [ 26]。16S rRNA 分子因其普遍分布、恒定功能和序列变异而成为微生物的重要系统发育标志物 [ 10 ] [ 16 ]。因此，我们研究的目标是使用 16S rRNA 区域的 PCR 扩增和从受侵染的枣椰树收集的 RPW 咀嚼废物的序列分析来识别培养依赖性细菌群落。
2。材料和方法
2.1。RPW咀嚼废物的取样
RPW 的咀嚼废物（图 1）用于所有实验，这些实验是从位于巴林王国北部省 Hoorat A'ali 的受侵染枣椰树种植园的树干中收集的（2017 年 12 月 28 日）（纬度：26.167612 经度：50.527532 ）。收集的咀嚼材料储存在 4˚C 以供分析。
2.2. 用于培养的咀嚼废物的处理
在三种不同的系列稀释后，将 1 克咀嚼过的废物在 10 毫升无菌蒸馏水中均质化，以便在两种不同的培养基中铺板；马铃薯葡萄糖琼脂，Sigma Aldrich (PDA) 和 Luria-Bertani 琼脂，Difco TM Miller (LBA)。
图 1。枣树上的红棕榈象鼻虫侵染，从那里收集 RPW 咀嚼的饲料废物。
2.3. 细菌培养
将三种不同稀释度的接种物接种在 PDA 和 LBA 培养基上。所有板均在 37°C 下孵育 72 小时。在所有板上都清楚地观察到不同的细菌菌落（图2（a））。将来自单个菌落的细菌分离并在相应的 PDA 和 LBA 培养基中分别传代培养过夜（图 2（b））。
2.4. 细菌的储存
进一步允许来自每个菌落的细菌在 LB 肉汤中生长，并在 37°C 的摇床上以 150 rpm 的速度孵育过夜生长。每个分离物的培养物储存在 50% 甘油中，并储存在 -80˚C 以供进一步使用。
2.5. 细菌鉴定
在鉴定的第一步，使用标准革兰氏染色技术对所有细菌分离物进行形态学检查。使用显微镜技术在（100×）下用油浸将染色的细菌载玻片区分为革兰氏阳性/阴性细菌。
2.6. DNA的提取
从新鲜生长的过夜培养物中分离 DNA。按照制造商的说明，使用试剂盒 (XG-2411-00) 分离基因组 DNA。提取的 DNA 的纯度通过 1% 琼脂糖凝胶通过 DNA 条带的可视化来确认。
2.7. 16S rRNA 基因的 PCR 扩增
用 16S rRNA 特异性通用引物 8F 和 1492R 扩增所有细菌的分离 DNA（表 1）。扩增在 ABI Veriti 中进行
图 2。(a) PDA 板显示在 37°C 下生长 72 小时后细菌菌落的生长。(b) PDA 平板显示单个菌落在 37°C 生长 24 小时后的继代培养。
热循环仪在 94°C 初始变性 3 分钟，94°C 30 秒、52°C 30 秒和 72°C 1 分钟的 35 个循环，最后在 72°C 延伸 7 分钟（表 2）。1.2%琼脂糖凝胶用于检测PCR扩增产物。在使用凝胶记录系统（Zenith Biosciences，图 3 (a)，图 3 (b)）在紫外光下对扩增产物进行可视化后，进一步处理用于测序。
表 1。从咀嚼过的 RPW 废物中分离出培养依赖性细菌的 16S rRNA 基因扩增反应混合物中所用试剂的组成和浓度。
表 2。从 RPW 咀嚼废物的饲料废物中分离的培养依赖性细菌的 16SrRNA 基因 PCR 扩增中使用的引物列表、它们的序列和退火温度。
*双向测序。
图 3。1.2% 琼脂糖凝胶显示两种不同细菌的单个 1500 bp 16S rDNA 扩增子（（a），（b））。泳道 1：100 bp DNA 梯；泳道 2：16S rDNA 扩增子。
2.8. 16S rRNA基因测序
PCR 扩增子使用 BDT v3.1 进行纯化和测序，循环测序试剂盒在 ABI 3730xl 遗传分析仪（Applied Biosystems，美国）上，双向使用 8F 和 1492R 引物。使用的测序设置为 95°C 3 分钟和 25 个循环（95°C 5 秒，55°C 5 秒，60°C 4 分钟）。使用密码比对器比对序列。
2.9。序列分析
获得的每个分离株的16S rRNA基因序列用于在NCBI Genbank数据库中进行BLAST分析。基于最大同一性得分，使用多重比对软件程序 ClustalW，比较序列。成功分离株的 16S rRNA 基因序列保存在 GenBank 中（表 4）。
3. 结果
3.1。革兰氏染色和细菌
在用于研究的连续稀释培养物中，RPW 喂养废物平均含有 1.2 - 1.9 × 10 9 CFU/ml 的细菌。对24株可培养细菌进行革兰氏染色，其中革兰氏阳性16株（图4（a）），革兰氏阴性8株（图4（b））。由于革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖层较厚，洗涤后取结晶紫染色，呈紫色染色（图4 （a））。另一方面，革兰氏阴性菌在洗涤后不能保留结晶紫染色剂，因为它们的细胞壁肽聚糖层更薄且夹在中间（图4（b））。
3.2. RPW咀嚼废物中可培养细菌的鉴定
使用 16S rRNA 特异性通用引物 8F 和 1492R 对所有可培养细菌进行 DNA 分离和 PCR 扩增，用于鉴定，如
图 4。革兰染色的载玻片在显微镜下油浸在 100 倍功率下将培养的细菌区分为革兰氏阳性 (a) 和阴性 (b)。
表格1. PCR 扩增按照表 2 所述条件进行。1.2% 琼脂糖凝胶显示所有不同细菌分离株的单个扩增 DNA 产物为 1500 bp，如图 3(a) 和图 3(b) 所示（只有两种不同的细菌已经出现）。但是，不同细菌分离物的 PCR 扩增子（1500 bp）的双向 DNA 测序产物的测序结果从 1316 bp 到 1461 bp 不等，如表 3 所示。使用 16S rRNA 基因序列鉴定从 RPW 咀嚼废物中分离的细菌 DNA NCBI 站点中的 BLAST 比对。本研究序列获取成功率为91.66%。根据 GenBank 中的最大序列同一性水平鉴定细菌。最后，79。参考已提供的 GenBank 登录号 (NCBI)，使用 BLAST 程序鉴定了 16% 的细菌。序列同一性百分比的水平从 94 到 100 不等。
表 3。使用 16SrRNA 基因序列通过 NCBI 位点的 BLAST 比对鉴定从咀嚼过的 RPW 废物中分离出的培养细菌列表。基于最大序列同一性 (%) 水平鉴定细菌，并提供了比较细菌的 NCBI 登录号。
3.3. 鉴定的细菌和系统发育
已鉴定细菌的 16S rRNA 基因序列已提交至 NCBI GenBank，其序列大小、名称和登录号见表 4. 本研究采用全局多序列比对（MSA）进行序列比对，在NCBI GenBank中识别和提交序列。66% 的已鉴定细菌为革兰氏阳性菌，其余为革兰氏阴性菌。在这项研究中，86% 的细菌属于不同菌株的不同芽孢杆菌属（门：厚壁菌门），14% 是其他细菌（木糖氧化无色杆菌 MPF-B6 菌株、加纳醋杆菌 MPF-C5 菌株、溶藻弧菌 MPF-D3 菌株） . 革兰氏阳性芽孢杆菌属。（科，芽孢杆菌科）属于厚壁菌门，革兰氏阴性菌属于来自三个不同科的变形杆菌。使用 16S rRNA 序列分析了分子系统发育亲和性，并在图 5中构建了系统发育树. 这
表 4。培养依赖细菌的 GenBank (NCBI) 登录号列表，从巴林王国 RPW 出没的枣椰树的咀嚼废物中分离出来。根据 16S rRNA 基因序列鉴定细菌。
图 5。从巴林王国枣椰树树干内的 RPW 幼虫喂养废物中分离出的生物体 16S rRNA 基因序列的分子系统发育亲和性分析。进化历史是使用邻接法[ 27 ]推断的。显示了分支长度总和 = 0.29047318 的最优树。绘制系统发育树以推断进化距离。进化距离是使用 Kimura 2 参数方法计算的，以每个位点的翻译取代数为单位，而密码子位置包括 1 st + 2 nd + 3 rd+ 非编码。所有包含空白和缺失数据的位置都被删除。分析包括 16 个核苷酸序列，进化分析在 MEGA 7 [ 28 ] 中进行。
在 MEGA7 软件 [ 28 ] 中使用邻接法 [ 27 ] 绘制系统发育关系和进化史]。根据 16S rRNA 基因序列，解淀粉芽孢杆菌 MPF-C2 菌株、暹罗芽孢杆菌 MPF-C3 菌株、甲基营养芽孢杆菌 MPF-C1 菌株、tequilensis 菌株 MPF-A2、维德曼芽孢杆菌 MPF-B1a 菌株均显示亲近，并在系统发育树中成为一个进化枝。序列之间的成对距离数据和进化分歧的分析使用 Kimura-2 参数遵循程序中提到的密码子的转换和颠换。结果表明，解淀粉芽孢杆菌与溶藻弧菌MPF-D3株、加纳醋杆菌MPF-C5株、木糖氧化无色杆菌MPF-B6株的序列在其进化历史上的距离分别为67%、70%和70%。
使用16S rRNA基因序列研究系统发育关系，革兰氏阴性细菌属于一个进化枝，而革兰氏阳性不同芽孢杆菌属。不同菌株的 1 个显示出进化上的相似性，因此，它们在系统发育树中的三个不同亚进化枝下属于一个主要进化枝（图 5）。
4。讨论
4.1。16S rRNA 序列分析的影响
细菌的鉴定通过使用NCBI位点的16S rRNA基因序列分析进行比较（表3和表4）。细菌 16S rRNA 基因序列的比较已被表征为一种优选的遗传技术，用于识别来自任何来源的描述不佳、很少分离或表型异常的细菌菌株 [ 29 ] [ 30 ]。序列同一性搜索，特别是使用 NCBI 中的 BLAST 程序，是最广泛使用和最可靠的，用于以极高的可靠性识别和表征新确定的序列 [ 31]。在培养依赖性分离细菌中，80% 是通过使用 BLAST 比较 NCBI 数据库中的 16S rRNA 基因序列来鉴定的。在鉴定出的细菌中，85% 为革兰氏阳性菌，其余为革兰氏阴性菌。与 NCBI GenBank 相比，从厚壁菌门的芽孢杆菌科和 16 种不同的芽孢杆菌中鉴定出高丰度的细菌。其他革兰氏阴性细菌属于三个不同科的变形菌门。
4.2. 鉴定的细菌和系统发育关系
鉴定出的细菌百分比最高的是不同的芽孢杆菌。RPW 饲料废物中存在的不同菌株。有几份关于 RPW 肠道微生物群的报告，其中主要是芽孢杆菌属。与观察到的其他细菌一起。这些细菌在 RPW 的消化系统、营养吸收、木质纤维素降解及其生存中发挥着重要作用 [ 13 ] [ 23 ] [ 32 ]。几种芽孢杆菌具有重要的医学、生物技术和经济重要性 [ 33 ]。由于孢子的产生，它们对热、辐射、化学品、氧化剂和干燥具有抵抗力，这是它们适应不同生态位的重要条件[ 34]。鉴定出的生物体 B. tequilensis 菌株 MPF-A2 与 B. tequilensis 菌株 HBUM07078 和 Bacillus subtilis 菌株 5723 具有 99% 的序列同一性。类似地，B. tequilensis sp。11 月，显示与枯草芽孢杆菌密切相关 [ 35 ]。在另一篇报道中，B. tequilensis GYLH001 被认为是内生菌，被用作稻瘟病菌的生防剂[ 36 ]。此外，Bacillus altitudinis P-10 可作为潜在的针对米黄单胞菌 pv 的生物保护剂。oryzae，分离自印度尼西亚爪哇的水稻根际 [ 37 ]。B. altitudinis、B. xiamenensis 和 B. pumilus 是表型和基因型密切相关的物种，它们从纤维二糖、葡萄糖和甘露糖中产生酸 [ 38]。B. aerius 和 B. stratosphericus 被公认为在工业用途中具有益生菌活性的酶生产者 [ 37 ]。几种芽孢杆菌。即。B. megaterium、B. laterosporus 和 B. sphaericus 在埃及与 RPW 昆虫受损的枣椰树相关的自然栖息地中分离出来，它们的生物测定表明，在喂养研究中 40% - 60% 的 RPW 幼虫被杀死 [ 23 ]。考虑到 RPW 对经济和环境造成的巨大破坏，人们对不同化学和生物防治策略 [ 39 ] 对几种用作生物防治的细菌 [ 10 ] [ 20 ] 的功效给予了一些关注。
在系统发育研究中，革兰氏阴性细菌属于一个进化枝，而革兰氏阳性芽孢杆菌属。显示出彼此在进化上的接近性，因此它们在系统发育树中属于一个主要进化枝和三个不同的亚进化枝。
5. 结论
红棕象鼻虫（RPW）是枣椰树的主要害虫之一。在目前的研究中，基于 16S rRNA 序列从 RPW 的饲料废物中分离和鉴定了不同的细菌。鉴定出的细菌菌株大多是不同种类的芽孢杆菌。由于不同的研究表明芽孢杆菌属的重要意义。在感染控制方面，本研究加强了对RPW害虫管理方案新生物防治剂的探索。
致谢
该研究得到了阿拉伯海湾大学生命科学系农业生物技术计划研究生院研究资助#“LS_AA_2017”的支持。作者要感谢工作、市政和城市规划部农业事务植物财富局的 Ahmed Ali Al-Asfoor 先生，感谢他在红棕象鼻虫喂养废物样品的领域和处理方面提供的技术帮助。我们要感谢 AGU 和印度 Xcelrislabs 的 Ali Ebrahim Al-Mahmeed 先生对分析的支持。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
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