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摘要：食品中的生物保存系统越来越受到行业和消费者的关注。产生乳酸杆菌属的细菌素。被认为是公认安全的 (GRAS)，可用于控制病原体的快速发展以及食品和饲料中的腐败微生物。乳酸杆菌属 w是通过使用选择性培养基从传统的冬季发酵蔬菜黄瓜和胡萝卜中分离出来的。尤其是 De Man、Rogosa 和 Sharpe (MRS) 琼脂培养基用于分离乳杆菌属物种。通过革兰氏染色和菌落形态进行形态学鉴定。通过过氧化氢酶、氧化酶、 MRVP和碳水化合物发酵试验进行生化识别。 乳酸杆菌属的抗菌活性。通过井扩散法证实。细菌素蛋白的分子特征和通过 SDS PAGE 法测定的分子量。发现分离物为兼性厌氧菌、革兰氏阳性菌和过氧化氢酶阴性菌。抗微生物活性的结果由抑制区的任意单位 (AU/ml)测量。从样品中发现了6 株分离株，但大多数活动都表现出对巨大芽孢杆菌的分离株 4 (55 mm) 区域的直径。经计算，洗涤过的细菌素的分子量约为 40 kDa（分离物 1）和 15 kDa 和 30 kDa（分离物 5）。细菌素蛋白可减少化学防腐剂的使用，未来可用作食品工业中的生物防腐剂。

 

关键词

 

乳酸杆菌属 .细菌素,抗菌 活性, SDS PAGE ,生物 防腐剂 

 

 

一、简介

 

控制各种食品中的致病微生物和腐败微生物对于保证食品质量和安全非常重要。最近，生物保存已成为人们感兴趣的话题 [ 1 ]。该技术被用作化学添加剂的替代品，通过使用原生微生物群落及其抗菌产品 [ 2 ] 来提高自我寿命储存和增加食品的安全性。乳酸菌被认为是安全的，因为它们作为发酵食品中的正常菌群长期以来一直有效；因此，它们在生物保存中具有巨大的应用潜力。乳酸菌的保藏作用是由于产生抗微生物剂如有机酸、过氧化氢和细菌素或相关物质[ 3 ][ 4 ]。

 

现代食品加工目前面临的挑战是，它旨在通过化学手段延长食品和饮料的保质期和安全性，而另一方面，消费者更喜欢加工最少且不含化学防腐剂的食品。这引起了人们对所谓的“绿色技术”的极大兴趣，包括最小化处理和利用微生物代谢物进行生物保存的新策略 [ 5 ] [ 6 ] [ 7]。乳酸菌 (LAB) 通常被认为是安全的，并在食品和饲料发酵和保存中发挥重要作用，无论是作为天然微生物区系还是在受控条件下添加的发酵剂。乳酸菌的防腐作用主要是由于有机酸（如乳酸）的产生导致pH值降低[ 8 ]。

 

乳酸菌 (LAB) 因其商业潜力 [ 9 ]、食品保鲜和健康益处而被广泛研究。它们是具有重要工业意义的微生物，在世界范围内主要用于乳制品行业，用于制造发酵乳制品和奶酪。乳酸菌在工业上的重要性在于它们能够将糖容易地发酵成不同的代谢物，并为保存发酵食品提供了一种有效的方法。这些细菌是革兰氏阳性菌，不形成孢子，并且天然存在于富含有机产品（如食品）的培养基中 [ 10 ]。

 

二、材料与方法

 

2.1。样品收集

 

冬季蔬菜（胡萝卜和黄瓜）是从孟加拉国达卡市 Azimpur 集市的零售市场地点收集的。得到胡萝卜和黄瓜各约250克。将样品分别包装在无菌聚乙烯袋中，然后运出孟加拉国科学与工业研究委员会 (BCSIR) 食品科学与技术研究所 (IFST) 工业微生物实验室进行进一步分析。

 

2.2. 样品制备

 

样品在分析前保持在室温下。进行自然发酵过程的方法有很多：将新鲜蔬菜样品每10克浸泡在90毫升生理盐水（8.5克NaCl/L）中，均质20分钟，用生理盐水适当稀释。从每个样品中，按照 Harrigan (1998) [ 11 ]的方法进行连续稀释。

 

2.3. 培养分离物的纯化

 

MRS琼脂上的典型菌落在同一培养基上一次又一次地继代培养，直到获得每种培养分离物的纯生长。在此过程中，在 MRS 琼脂培养基上进行四到五次传代培养。

 

2.4. 从纯培养物中鉴定细菌

 

2.4.1。乳杆菌属的鉴定

 

采用 MRS 琼脂的传统方法 [ 12 ] 采用划痕平板法技术从自然发酵的胡萝卜和黄瓜中分离出细菌素生产者。在 32˚C 下孵育 48 小时后，分离出典型的菌落并无罪。分离株根据其形态、培养和生理特征，如氧化酶试验、柠檬酸盐作为唯一碳源的利用和过氧化氢酶试验[ 13 ]进行区分，并据此初步识别到属水平[ 14 ]。

 

2.4.2. 形态学检查

 

根据Collins等人的方法，在培养的每个步骤中检查革兰氏染色后培养分离物的固体培养基上的菌落特征和细胞形态。[ 15 ] 用于识别。载玻片制备和涂片固定后的革兰氏染色通过以下程序进行：

 

2.4.3。生化和酶学测试

 

以下生化测试是根据 Harrigan (1998) 描述的方法进行的。

 

1) 过氧化氢酶测试程序

 

首先取新鲜的载玻片。然后在载玻片上滴一滴 3% 的过氧化氢。使用循环后拿起测试有机体并接触3%的过氧化氢溶液。然后等待2分钟观察气泡。沙门氏菌在此过程中使用阳性对照。

 

2) 氧化酶测试程序

 

起初在实验台上取了 Whatman 滤纸。然后滴入一滴氧化酶试剂（对氨基甲基苯胺草酸盐）。通过使用循环放置隔离菌落后。等待 10 - 30 秒观察颜色，假单胞菌在此过程中使用阳性对照。

 

3) 甲基红测试程序

 

进行该测试是为了检测在葡萄糖发酵过程中产生酸的生物体。将成分溶解在蒸馏水中。将 pH 值调节至 7.5，并将培养基以 5 mL 的量分布在试管中。然后将这些试管在 115°C 下灭菌 20 分钟。用特定/测试微生物接种培养基，并在 37˚C 下使用 5 滴甲基红指示剂（0.1g 甲基红在 300 mL 95% 乙醇中，在蒸馏水中补足 500 mL）孵育 48 - 72 小时）。大肠杆菌使用阳性对照，假单胞菌用作阴性对照。记录酸产生的结果并改变颜色。

 

4) VP (Voges Proskauer) 测试程序

 

分离的测试生物体在 37˚C 下孵育 48 小时。加入 40% KOH（巴里特试剂 B）和 5% α-萘酚钠（巴里特试剂 A）。将试管剧烈摇晃后静置20分钟。大肠杆菌使用阴性对照，蜡状芽孢杆菌用作阳性对照。

 

5) 碳水化合物发酵试验

 

酚红肉汤基础培养基用作该实验的培养基。使用了各种糖底物，即蔗糖、麦芽糖、乳糖、山梨糖醇和葡萄糖。将 0.1 克 (0.1% w/v) 的每种糖底物添加到 100 ml 培养基中。将 5 ml 的每种混合物转移到每个试管中。对于气体鉴定，将达勒姆管添加到含有葡萄糖的试管中。所有试管均在 121°C 下灭菌 15 分钟。用研究中的单菌落接种试管。通过培养基颜色的变化来报告细菌的阳性反应 [ 16 ]。

 

2.5. 维持纯文化

 

纯培养物在达卡 Dhanmondi 的孟加拉国科学与工业研究委员会 (BCSIR) 食品科学与技术研究所 (IFST) 工业微生物实验室保持在冷藏温度下，每 10 次后在 MRS 琼脂上进行连续传代培养技术天，以避免任何污染和其他问题。

 

2.6. 筛选分离物的抗菌活性

 

井扩散法

 

通过井扩散法确定细菌分离物对所有病原微生物的抗菌活性 [ 17] 在有氧条件下。在将它们在肉汤中生长并适当稀释后，用 100 mL 的每种目标微生物接种琼脂板。将孔 (3 mm) 切入板中，并将 100 mL 不同菌株的无细胞培养上清液放入每个孔中。对大肠杆菌、大肠杆菌12079、粪大肠杆菌、醋杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、假单胞菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、葡萄球菌属、金黄色葡萄球菌的抑制活性生长在营养琼脂上。将板在凉爽的温度下保持 2 小时，然后在 37°C 下孵育 24 小时。通过测量孔周围抑制区的直径来鉴定抗微生物活性。

 

2.7. 从乳杆菌属中纯化细菌素

 

如Green等人所述，收获细胞并从无细胞上清液中分离细菌素。(1997) [ 18 ]。从乳杆菌属中纯化细菌素。下面给出了。

 

50 ml de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 肉汤和 2 ml Lactobacillus 培养物在 37˚C 厌氧条件下培养 14 小时。然后将 100 ml MRS 肉汤和 1% 的乳酸菌培养物在 37˚C 厌氧条件下培养 24 小时。在 4˚C 下以 6000 rpm 离心 15 分钟。在旋转真空蒸发器中将无细胞上清液浓缩至100ml。在 4°C 下在搅拌下加入硫酸铵至 70% 饱和度。在 4˚C 下以 1000 rpm 离心 20 分钟。收集沉淀物并在离心管中重悬于 3 ml 蒸馏水中。

 

2.8. SDS PAGE技术对细菌素的分子表征

 

为了确定乳酸菌的蛋白质谱，将先前通过其表型特征鉴定的菌株提交给 SDS-PAGE，如 Laemmli [ 19 ] 所述。

 

SDS PAGE法试剂的制备

 

1) 准备以下试剂

 

30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液，10% 硫酸铵 (APS) [200 µl 的等分试样应储存在 -20˚C 以供一次性使用。APS 分解缓慢，因此应每周准备新鲜溶液。]、0.1% BMB（溴酚蓝溶液）或示踪染料、脱色溶液、染色溶液（考马斯蓝凝胶染料）、上样缓冲液、电泳缓冲液（pH 8.3）、堆叠/上凝胶缓冲液（pH 6.8），分离/下凝胶缓冲液（pH 8.8）。

 

2）分离胶（10%）的制备

 

首先，在凝胶浇注室中组装干净新鲜的玻璃板。通过轻轻混合蒸馏水、下凝胶缓冲液以及 10% SDS、30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、10% SDS、10% 新鲜制备的硫酸铵 (APS) 和 TEMED，构建 10% 分离凝胶，如下所示. 一旦将 APS 和 TEMED 添加到混合物中，立即用无菌巴斯德吸管将新鲜混合的溶液小心地倒入玻璃板室中，而不会浪费几秒钟。

 

3）浓缩胶（5%）的制备

 

在分离凝胶的聚合完成后，根据下面给出的制备5％的浓缩凝胶混合物。就像分离凝胶一样，浓缩凝胶混合物也通过将蒸馏水、上层凝胶缓冲液以及 10% SDS 和 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、10% APS 和 TEMED 混合来制备。然后将凝胶混合物快速倒入先前构建的分离凝胶之上。

 

4) 样品制备

 

将蛋白质样品 (10 µL) 与上样缓冲液以 1:1 的比例混合，然后在水浴中煮沸 3 分钟。在沸腾过程中采取预防措施以使样品不会起泡。然后将 5 μL 示踪染料（0.1% 溴酚蓝）添加到煮沸的混合物中。

 

5) 上样

 

浓缩凝胶聚合完成后，用柔软的手将梳子从玻璃室中取出，以免孔分隔器破裂。然后将玻璃室固定在电泳装置中并轻轻放入缓冲液容器中。通过将电泳缓冲液倒入电泳单元的两个玻璃室内直至玻璃的顶部边缘，孔中填充有电泳缓冲液。运行缓冲液也被倒入主缓冲液容器中，直至达到容器高度的1/3 。然后从凝胶右侧将 20 μL 样品添加到孔中。10 μL 分子量标准 (BIO-RAD) 用作标记物。

 

6) 运行凝胶

 

仔细完成加载过程后，将电泳装置与电源组连接，电源组的电流调节为 20 mA，保持电压供应免费。电源保持打开 1 - 1.5 小时。一旦示踪染料达到凝胶的底部水平，就关闭电源。

 

7) 凝胶的染色和脱色

 

运行完成后，将凝胶从玻璃板上释放并浸入新鲜的染色溶液（0.1% 考马斯亮蓝 R 250）中。然后将凝胶在摇床（Memmert，USA）上摇动约 2 小时。然后将凝胶从染色溶液中取出并用脱色溶液（10% 乙酸）淹没并置于旋转振荡器上 2 小时以上。当凝胶背景变得透明时，将其从脱色溶液中取出并浸入蒸馏水中。

 

3. 结果

 

3.1。细菌的分离和鉴定

 

从发酵蔬菜黄瓜和胡萝卜中分离出的细菌被鉴定为乳酸杆菌属。通过观察它们的菌落形态、生理和一些生化特征。所有分离物在 MRS 琼脂平板上均呈白色和乳白色（图 1）。菌落形态呈乳脂状、小条状和光滑的圆形菌落。

 

 

 

图 1。乳酸杆菌属 (Isolate-3) 在 MRS 琼脂培养基上。

 

3.1.1。革兰氏染色

 

显微镜下，所有分离株均呈革兰氏阳性，呈棒状。它们的形态特征已显示（表1）。

 

3.1.2。生化测试

 

生化测试结果（包括：过氧化氢酶、氧化酶、甲基红和 Voges-Proskauer）如下（表 2）。碳水化合物发酵试验结果如下（表3）。图 2显示了乳糖的碳水化合物测试。

 

3.1.3. 双琼脂覆盖法分离乳酸菌对目标菌的抗菌活性

 

乳酸杆菌属的抗菌活性。(分离物1-6)对测试生物体的结果显示(表4 )。图3显示了isolate-1对枯草芽孢杆菌的抗菌活性。

 

3.1.4。细菌素的分子量测定

 

然后SDS-PAGE电泳染色和脱色，分离物1和5显示肉眼可见蛋白条带。这些蛋白质被认为是细菌素。确定细菌素的分子量，以将它们与从美国 Promega 获得的分子量标记进行比较。显示了细菌素的 SDS-PAGE（图 4）。考马斯亮蓝染色可见细菌素蛋白条带，清晰表明蛋白纯度。计算得到纯化的细菌素的分子量约为分离物 1 (40 kDa) 和分离物 5 (15 k Da, 30 kDa)。

 

细菌分离物	资源	形状	安排	革兰氏染色
隔离 - 1	黄瓜	长链	簇	革兰氏阳性
隔离 - 2	黄瓜	小棒	单集群	革兰氏阳性
隔离 - 3	黄瓜	小棒	簇	革兰氏阳性
隔离 - 4	萝卜	长杆	单到集群	革兰氏阳性
隔离 - 5	萝卜	中链	簇	革兰氏阳性
隔离 - 6	萝卜	中棒	单身的	革兰氏阳性

表 1。细菌分离物的形态学特征。

隔离名称	测试/外观结果
	过氧化氢酶	氧化酶	甲基红	Voges-Proskauer
（积极控制）	产生泡沫	紫色	红色	红色
隔离-1	缺席泡沫	无色	红色	红色
隔离-2	缺席泡沫	无色	红色	红色
隔离-3	缺席泡沫	无色	红色	红色
隔离4	缺席泡沫	无色	红色	红色
隔离 5	缺席泡沫	无色	红色	红色
隔离-6	缺席泡沫	无色	红色	红色
（阴性对照）	缺席泡沫	无色	黄色	黄色

表 2。生化检测结果。

隔离名称	碳水化合物发酵试验名称：
	葡萄糖	蔗糖	乳糖	山梨糖醇
隔离-1	气体和酸生产	无气制酸	产气微酸	没有煤气但 酸生产
隔离-2	气体和酸生产	气体和酸生产	气体和酸生产	气体和酸生产
隔离-3	没有气体和酸的产生	气体和酸生产	气体和酸生产	气体和酸生产
隔离4	不产气但产酸	无气制酸	气体和微酸生产	没有气体和酸的产生
隔离 5	不产气但产酸	气体和酸生产	气体和酸生产	气体和酸生产
隔离-6	气体和酸生产	气体和酸生产	气体和酸生产	气体和酸生产
控制 （没有隔离）	没有气体和酸的产生	没有气体和酸的产生	没有气体和酸的产生	没有气体和酸的产生

表 3。碳水化合物发酵试验。

 

 

 

图 2。乳糖的碳水化合物测试。

 

 

 

图 3。乳酸杆菌的抗菌活性。(Isolate-1) 对抗枯草芽孢杆菌。

 

 

 

图 4。从 SDS-PAGE 方法获得的细菌素蛋白的分子量（Isolate-1 为 40 kDa，Isolate-5 为 15 kDa 和 30 kDa）。

 

 

4。结论

 

用细菌进行乳酸发酵早已为人类所知并实用，可用于制作不同的食物。乳酸菌 (LAB) 在乳酸发酵过程中会产生不同的化合物，如有机酸、二乙酰、过氧化氢和细菌素或杀菌蛋白，在这项研究中分离出对某些病原菌具有抗菌活性的乳酸菌，这些细菌将在未来用作益生菌对于食品工业，最后从两个分离物（Isolate-1 和 Isolate-5）中纯化和提取细菌素蛋白，该蛋白将来用作食品工业中的生物防腐剂。

 

在纯化过程中应用了几种不同的方案。通过加入硫酸铵沉淀实现了最佳回收率。使用的方案导致比活性增加和 26.32% 的回收率。来自乳酸杆菌属的纯化细菌素。在 10% SDS PAGE 上显示蛋白质条带的均一性。通过 SDS-PAGE 估计其分子量为 40 kDa (Isolate-1) 和 15 kDa、30 kDa (Isolate-5)。

 

该研究表明，来自乳酸杆菌属的细菌素。从蔬菜（黄瓜和胡萝卜）的天然乳酸发酵中分离出来。乳酸杆菌属 分离物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、粪大肠杆菌、伤寒杆菌具有广谱的抑制活性。因此，它具有作为生物防腐剂应用于不同食品本身或与其他防腐方法结合使用的潜力。此外，这项研究表明乳酸杆菌属的可能作用。增强胡萝卜和黄瓜的抗菌活性。

 

致谢

 

该研究工作得到了孟加拉国科学与工业研究委员会 (BCSIR)、Dhanmondi 和达卡下属的食品科学与技术研究所 (IFST) 工业微生物实验室的支持。非常感谢合著者在数据分析方面的适当帮助和帮助，以开展成功的研究工作。

 

利益冲突

 

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

 

参考

 

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[ 10 ] Pierre, R. (2002) 转基因乳酸菌：在食品或健康和风险评估中的应用。Biochime, 84, 1073-1087。