摘要：肺纤维化的病因和发病机制知之甚少。我们和其他人报道了 M-CSF/CSF-1、M-CSF-R 和下游 AKT 激活在小鼠模型和 IPF 患者的肺纤维化中起重要作用。为了了解 M-CSF-R 激活用于指导肺纤维化的潜在分子途径，我们使用了一种新的转基因小鼠模型，该模型表达了由c-fms驱动的组成型活性 AKT 肉豆蔻酰化 AKT (Myr- Akt ) 。M-CSF-R) 启动子。我们对这些 Myr- Akt肺部的基础免疫状态特别感兴趣小鼠评估肺纤维化的 M-CSF-R 相关启动。为了支持启动效应，从未受攻击的 Myr - Akt小鼠的肺中分离出的巨噬细胞显示出 M2 向性，增强了 M-CSF-R 和α -SMA的共表达，通过关键自噬的表达减少所反映的自噬减少基因Beclin -1、MAP1- Lc 3 a ( Lc 3 a )和 MAP1- Lc 3 b ( Lc 3 b ) ，并且与同窝 WT 小鼠相比增加了p 62/ STSQM 1表达。此外，Myr-Akt小鼠比 WT 小鼠具有更多的基础循环纤维细胞。最后，在博莱霉素攻击下，Myr- Akt小鼠表现出增强的胶原沉积，增加 F4/80+ 和 CD45+ 细胞，减少自噬基因Beclin -1、Lc 3 a和Lc 3 b的表达，并且比 WT 同窝小鼠的寿命更短. 这些数据支持 M-CSF-R/AKT 激活可能具有启动效应，使肺组织易发生肺纤维化。
关键词
肺纤维化, AKT , CSF1 , M-CSF 受体,巨噬细胞,肌成纤维细胞,纤维细胞,自噬
一、简介
特发性肺纤维化 (IPF) 是一种进行性呼吸系统疾病，5 年死亡率为 50% - 70% [ 1 ]。IPF 的病理特征是肺结构的破坏、纤维化重塑、肌成纤维细胞的积累和细胞外基质 (ECM) 的沉积 [ 2 ]。迄今为止，IPF的病因和发病机制仍不清楚。
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 AKT 是许多受体酪氨酸激酶的下游，在细胞存活、分化和细胞活化中起重要作用 [ 3 ]。在巨噬细胞中，M-CSF 受体 (M-CSF-R) 的激活诱导磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K) 的刺激，导致 AKT 募集到细胞膜，随后 Thr308 和 Ser437 磷酸化以激活 AKT [ 4 ]。在成纤维细胞中，活化的 AKT 调节胶原蛋白 I 和 III 的产生 [ 5 ] 并有助于人类肝纤维化 [ 6 ] 和博来霉素诱导的小鼠肺纤维化 [ 7 ] [ 8]。重要的是，由于 PTEN 磷酸酶功能水平降低，IPF 成纤维细胞中的 PI3K/AKT 活性增强 [ 9 ]。此外，PI3K/AKT 抑制剂如 PX-866 是 IPF [ 7 ] [ 10 ] 的潜在治疗剂。因此，了解活化 AKT 在 IPF 中的作用很重要。
巨噬细胞表达几种纤维化介质，并在伤口愈合和器官纤维化中发挥重要作用 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]。有两种主要类型的巨噬细胞具有不同的炎症功能：经典激活的“杀伤”巨噬细胞（M1 表型），由微生物剂激活以表达促炎细胞因子，如 TNF-α、IL-18、IL-12、IL-6、 IL-1 和可诱导 I 型辅助 T 细胞增殖的一氧化氮合酶 (iNOS) [ 15 ] [ 16 ] [ 17]，或者激活或 M2 “修复”巨噬细胞，它们表达相对较高水平的抗炎细胞因子 IL-10、甘露糖受体-1 (MRC)-1、YM1 和精氨酸酶-1 (ARG1) 和 Th2-型细胞因子。M2 巨噬细胞表现出促纤维化、促血管生成和抗炎活性 [ 15 ] [ 16 ] [ 18 ]。几项研究表明，M2 巨噬细胞会导致 IPF [ 11 ] [ 19 ] [ 20 ] 等纤维化肺部疾病。因此，了解 M2 巨噬细胞的分子调控在肺纤维化中可能很重要。
IPF 中的另一种关键效应细胞类型是肌成纤维细胞，它会分泌过多的细胞外基质蛋白，如胶原蛋白 I 和 III，从而导致纤维化 [ 19 ] [ 21 ]。肌成纤维细胞通过其 α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 的表达来识别，并且可以与常驻肺成纤维细胞、上皮间充质细胞或循环纤维细胞分化 [ 21 ] [ 22 ]。有趣的是，PI3K/AKT 参与 IPF 中 TGF β 诱导的肌成纤维细胞增殖和分化 [ 23 ]。因此，肌成纤维细胞功能在 IPF 中至关重要。
除了 M2 巨噬细胞和肌成纤维细胞外，循环纤维细胞也与肺纤维化有关 [ 24 ]。纤维细胞是骨髓来源的间充质细胞，表达白细胞、造血细胞和成纤维细胞标志物 [ 25 ]。纤维细胞表达趋化因子受体和粘附分子，可以运输到纤维化区域 [ 24 ]。此外，纤维细胞可以沉积 ECM 蛋白胶原 I 和 III [ 26 ]，还可以分化成成纤维细胞和肌成纤维细胞，这进一步有助于 ECM 沉积 [ 27 ]。因此，循环纤维细胞可促成肺纤维化的发病机制 [ 24 ] [ 28 ]。
在 IPF [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]患者的肺部也发现了减少的细胞稳态过程，如自噬。自噬是一种进化上保守的依赖溶酶体的细胞通路，负责处理不健康的细胞器和细胞废物，以在细胞应激期间维持细胞稳态 [ 32 ]。成功的自噬导致蛋白质和/或细胞器进入双膜自噬体，用于溶酶体降解 [ 32 ] [ 33 ] 和细胞稳态。有趣的是，自噬活性与机体寿命相关 [ 34] 并且自噬的中断与细胞衰老有关。几项研究报告通过减少 LC3A/B-II（微管相关蛋白 1 轻链 3）和增加 p62（自噬体伴侣蛋白）来测量人类 IPF 肺组织中的自噬囊泡形成（自噬体）和活性降低 [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]。BECLIN-1 是自噬的主要调节因子，在 IPF 肺成纤维细胞中减少。此外，BECLIN-1 还与 BCL-2 结合并减少这些成纤维细胞的细胞凋亡 [ 31 ] [ 35 ]。作为自噬调节剂、哺乳动物雷帕霉素靶点或 mTOR，激酶活性在 IPF 肺成纤维细胞中升高 [ 36 ] 通过增强 AKT 激活和 PTEN 抑制 [37 ]。因此，IPF 中调节自噬的途径可能导致肺纤维化。
我们实验室以前的数据显示，CSF1 有助于小鼠肺纤维化，因为 CSF1-/-小鼠在应对博来霉素攻击时表现出较少的纤维化 [ 38]。然而，M-CSF-R 介导的信号通路和将 CSF1 和 M-CSF-R 信号通路连接到特定靶细胞群的调节通路的具体机制尚不清楚。目前该领域的知识是在 IPF 患者的肺部观察到 AKT 激活、M2 巨噬细胞极性、肌成纤维细胞和纤维细胞数量增加以及自噬减少。在这里，我们通过使用小鼠模型（c-fms 定向的 Myr-Akt 表达）扩展了我们之前的研究，以检查由 M-CSF-R 启动子驱动的组成型 AKT 激活的作用，并确定肺纤维化的潜在启动。通过这种小鼠模型，我们研究了 M-CSF-R 导向的 AKT 激活与细胞表型之间的潜在因果关系以驱动纤维化。我们观察到，与 WT 小鼠相比，Myr-Akt 小鼠的肺具有代表 M2 巨噬细胞的基因表达增加、α-SMA 阳性细胞增加、纤维细胞数量增加和自噬相关转录物减少。这些数据表明 M-CSF-R/AKT 激活可能导致肺纤维化表型。
2。材料和方法
2.1。道德声明
本研究严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。动物方案得到俄亥俄州立大学机构实验动物护理和使用委员会 (ILACUC) 的批准（方案：2011A00000077 和 2009A0124-R1）。
2.2. 试剂
无内毒素 RPMI 1640 (15-040) 和 DPBS (21-031) 购 自 Corning Cellgro。无内毒素（经证明小于 0.06 EU/ml）胎牛血清（FBS，S11150）购自 Atlanta Biologicals。购买重组小鼠 CSF1 (416-ML) 来自研发系统。抗小鼠 CD45 抗体（克隆 30-F11、103112）、Alexa488 抗小鼠 F4/80（克隆 BM8、123120）、PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CXCR4（克隆 L276F12、146510）和 APC 抗小鼠 CD115 (CSF-1R/M-CSF-R) (克隆 AFS98, 135510) 购自 Biolegend。抗兔 αSMA (ab5694) 和抗小鼠胶原蛋白 I（克隆 COL-1，ab6308）获自 Abcam。LC3B (D11) XP Rabbit mAb (3868) 和 Alexa Fluor® 488 偶联二抗购自 Cell Signaling Technology。FITC 抗小鼠 α-SMA 抗体（克隆 1A4，F3777）购自 Sigma-Aldrich。Cytofix/Cytoperm 溶液 (554714) 购自 BD Biosciences。除非另有说明，否则用于定量实时聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 的引物和 SYBR Green Master Mix (4385610) 购自 Thermofisher Scientific。
2.3. 动物模型
如前所述 [ 39 ]，Michael Ostrowski 博士 (OSU, Columbus, OH) 产生了组成型活性肉豆蔻酰化 Myr-Akt 转基因小鼠。简而言之，使用 c-fms-Myr-Akt 质粒产生在单核吞噬细胞中表达膜结合形式的 Akt1 的小鼠。Akt 上的肉豆蔻酰化标签促进膜结合，导致组成型激活（补充图 1（一个））。6-8 周大的雄性和雌性小鼠在吸入异氟醚后通过心脏穿刺处死，肺部灌注 25-35 mL DPBS。组织在 10% 福尔马林中固定用于组织学和免疫组织化学分析，在液氮中速冻用于 RNA 分析，或立即消化以获得单细胞悬液用于流式细胞术分析。通过在补充有 10% FBS、1% PSA（青霉素-链霉素两性霉素）、5 µg/mL 多粘菌素 B 和 20 ng/ml 重组鼠 CSF1，如 [ 40 ] 所述。如图和图例所示，每组使用 3-5 只小鼠进行实验。如所述[ 38 ]给予博来霉素治疗] 使用 6 - 12 周大的雄性小鼠。
2.4. 免疫组织化学 (IHC)
如所述[ 41 ] ，在俄勒冈州立大学兽医学院的组织学中心进行免疫组织化学处理和苏木精和伊红 (H&E)、Masson 三色、F4/80 或 α-SMA 染色。对于 LC3B 染色，小鼠肺在新鲜制备的 4% 多聚甲醛中固定 24 小时，并在俄勒冈州立大学韦克斯纳医学中心病理中心进行处理和染色。使用配备奥林巴斯 IX50 倒置显微镜的尼康相机 (Olympus)，每部分拍摄 10 张照片。如所述 [ 41 ] ，使用 Adobe Photoshop CS 和直方图分析 (Adobe) 量化对应于特定污渍的平均像素数。数据以每个高功率场 (HPF) 的阳性细胞百分比表示，并表示为平均值 ± SEM。
2.5. 单细胞悬液和流式细胞术
收获小鼠组织并立即用 McIlwain Tissue Chopper (Ted Pella, Inc.) 匀浆以获得如前所述的单细胞悬液 [ 41 ]。简而言之，在含有 0.525 mg/mL 1 型胶原酶（Worthington Biochemical Corporation）、0.02 mg/mL 脱氧核糖核酸酶 I（Sigma）和 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中将机械匀浆的组织在 37°C 的摇床上以 250 度消化 1 小时转。将匀浆通过 70 μm 过滤器并用 RBC 裂解缓冲液（0.034 M 氯化铝、0.01 M 碳酸氢钾、0.1 mM EDTA 的 dH 2溶液）裂解红细胞O) 30 秒。将细胞悬浮在流式洗涤缓冲液（DPBS 中的 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠）中，并对等数量的细胞进行流式细胞术。首先将细胞与 Chrom Pure Mouse IgG (Jackson Immuno Research) 一起孵育以阻断 Fcγ 受体。然后将细胞在冰上用细胞外抗原抗体染色 30 分钟，然后在冰上透化/固定 20 分钟，再在冰上细胞内染色 30 分钟。用 BD LSR II 流式细胞仪 (BD Biosciences) 洗涤和测量细胞。使用 FCS3 Express 软件 (De Novo) 分析数据。
2.6. 纤维细胞分离
如所述[ 42 ] ，从新鲜收集的外周血中分离出原代鼠纤维细胞。简而言之，从心脏穿刺收集血液并使用 Lympholyte-Mammal (Cedarlene) 分离 PBMC。PBMC 在补充有 20 mM HEPES、2×NEAA、2 mM 丙酮酸钠、4 mM 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 2× ITS-3 的 FibroLife 基础培养基（Lifeline Cell Technology）中培养5 天生成小鼠纤维细胞。对细胞进行计数，并用对 CD45 和 CXCR4 特异的抗体对相同数量的细胞进行染色，透化/固定，并对胶原蛋白 I 进行染色。通过流式细胞术分析细胞。
2.7. 通过病理评估分析肺部炎症
一位获得委员会认证的兽医病理学家以盲法进行主观分析，评估肺部炎症、巨噬细胞数量以及 H&E 和三色染色载玻片中存在的纤维结缔组织的数量，并如前所述对它们进行相应评分。38 ]。
2.8. RNA 提取和定量实时 PCR
使用 TRIzol (Thermofisher Scientific) 提取总 RNA，并使用 1 µg 总 RNA 与 SuperScript III 逆转录酶 (Thermofisher Scientific) 合成 cDNA。使用 SYBR Green Master Mix (Applied BioSystems) 和带有 Sequence Detector v1.7 (Applied Biosystems) 的 ABI PRIZM 7700 一式两份进行定量实时 (qRT)-PCR。补充表 1中列出了小鼠胶原蛋白 1A、胶原蛋白 3B、IL-12、iNos、IL10、Ym1、Atg3、Atg5、Beclin-1、Lc3a 和 Lc3b 的引物序列。将目标基因标准化为看家基因 Cap1、Rpl4（Thermofisher Scientific）和 Gapdh [ 38 ]的平均值，并使用 2 （-ΔCt）表示为相对拷贝数（RCN ） 。
2.9。蛋白质印迹
获得单细胞悬液并在具有蛋白酶抑制剂（Cell Signaling Technology）的细胞裂解缓冲液中裂解。通过 Dc 蛋白质测定法 (Bio-Rad) 测定蛋白质浓度，在 10% 或 4% - 12% NuPAGE Novex bis-tris 凝胶 (Thermofisher Scientific) 上分离等量的蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，用指示抗体并由 ECL (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) 检测。使用 Quantity One 程序 (Bio-Rad) 量化 ECL 信号和条带密度。将蛋白质表达标准化为总蛋白质或β-肌动蛋白。
2.10。统计分析
使用方差分析（单向方差分析）分析数据，并通过 Tukey 方法调整多重性，以使用 JMP 9 软件（SAS Institute，Inc；Cary，NC）将家庭错误率控制在 0.05。在这些研究中，P = 0.05 被定义为具有统计学意义。通过交互对比测试协同效应的假设检验。通过对数秩检验比较组间生存率的差异。SAS 9.3 软件 (SAS Institute, Inc; Cary, NC) 用于数据分析。
3. 结果
3.1。M-CSF-R 驱动的 Myr-Akt 在肺中诱导 M2 巨噬细胞趋向性
由于从表达由 M-CSF-R 启动子驱动的 Myr-Akt 的小鼠收集的骨髓衍生巨噬细胞 (BMM) 提高了存活率 [ 40 ]，我们首先检查 Myr-Akt 小鼠是否比 WT 小鼠产生更多的 BMM。Myr-Akt 转基因的外显率与转基因表达和脾肿大相关。出于这个原因，在本研究中分类为 Myr-Akt 基因型是使用鼠基因分型（补充图 1（a））和脾脏大小（补充图 1（b））确认的。巨噬细胞标记 F4/80 的免疫组织化学染色显示，与 WT 同窝小鼠相比，Myr-Akt 小鼠脾脏中的巨噬细胞数量显着增加（p < 0.001）（图 1（a），顶部和图 1 ）(b))，然而，我们没有观察到这些 Myr-Akt 和 WT 小鼠的肺中 F4/80 表达的任何差异（图 1（a），底部和图 1（b））。我们接下来从骨髓中提取巨噬细胞，并用流式细胞术测量 F4/80 的表达。我们的数据表明，与 WT 小鼠相比，Myr-Akt 小鼠在第 1 天 (p = 0.02) 和第 2 天 (p = 0.02) 的 F4/80+ BMM 数量增加（图 1 (c)）。然而，在培养第 3 天后，BMM 数量相似（数据未显示）。
由于我们没有在 Myr-Akt 小鼠的肺中观察到更多的巨噬细胞，我们接下来询问来自 Myr-Akt 小鼠的肺或脾脏的组织巨噬细胞是否表达了代表 M2 表型的表型 [ 43 ] [ 44 ]。我们从整个肺或脾组织中分离出总 RNA，并进行 qRT-PCR 以检测 M1 和 M2 基因的表达。Myr-Akt 和 WT 小鼠在 M1 促炎标志物 IL-12 和 iNos 方面没有显着差异（图 1（d），左），但 M2 抗炎基因 IL-10（p与 WT 小鼠相比，Myr-Akt 的肺 = 0.047，脾脏 p = 0.036）和 Ym1（肺 p = 0.01，脾脏 p = 0.05）（图 1(d)，右)。我们的数据表明，由 Myr-Akt 小鼠中的 M-CSF-R 启动子驱动的 AKT 激活驱动肺和脾巨噬细胞中的 M2 趋向性。
3.2. 未受挑战的 Myr-Akt 小鼠肺中的 α-SMA+ 和 α-SMA+/M-CSF-R+ 细胞流入
由于 α-SMA 阳性肌成纤维细胞介导人类 IPF [ 21 ] [ 45 ]中的肺纤维化。我们接下来想要确定来自 Myr-Akt 和 WT 小鼠的肺细胞 [ 46 ] 中 α-SMA 表达的基础差异。使用肌成纤维细胞标记物 α-SMA 进行免疫染色，我们发现 Myr-Akt 小鼠肺组织中的 α-SMA 表达高于 WT 小鼠（p = 0.001），后者主要局限于上皮和上皮下组织（图 2（a）和图 2 (b))。与 WT 小鼠相比，Myr-Akt 整个肺组织的 α-Sma mRNA 表达显着增加支持了这一观察结果（p = 0.05）（图 2（C））。使用流式细胞术，我们还发现与 WT 小鼠相比，Myr-Akt 小鼠肺中表达 α-SMA 的细胞数量增加（Myr-Akt 平均为 43.44% ± 3.46%，WT 为 29.34% ± 1.64%；p = 0.02) (图 2 (d))。由于 Myr-Akt 同种型由 M-CSF-R 启动子控制，我们接下来检查了共表达 M-CSF-R 的 α-SMA+ 肌成纤维细胞群。与 WT 小鼠相比，我们观察到 Myr-Akt 小鼠肺部的 α-SMA+/M-CSF-R+ 细胞显着增加（Myr-Akt 平均为 2.76% ± 0.54%，而 WT 为 0.9% ± 0.11%；
图1. Myr-Akt 小鼠表现出脾脏中 F4/80+ 巨噬细胞增加和肺中 M2 巨噬细胞偏向性。处死 6-8 周大的 Myr-Akt 或 WT 小鼠，收获（a，顶部）脾脏和（a，底部）肺，石蜡包埋，并对巨噬细胞进行 F4/80 免疫组织化学染色。使用 4X 和 20X 物镜（分别为 40× 和 200× 放大倍率）对每部分 10 张图片进行成像。(b) 使用 Adobe Photoshop CS5 软件中的直方图分析功能对每个高倍视野 (HPF) 的棕色染色百分比 (F4/80+ 像素) 进行量化，并表示为平均值 ± SEM。(c) BMMs 由 Myr-Akt 或 WT 同窝小鼠与重组鼠 (rh)CSF1 (20 ng/ml) 产生。在接种祖细胞（第 0 天）后 1 天和 2 天使用 Accutase 去除细胞。通过流式细胞术评估 F4/80 的细胞表面抗原表达。提供的数据是 F4/80 表达的平均几何平均值 ± SEM。(d) 使用 TRIzol 从肺和脾脏中提取总 RNA，并使用小鼠 IL12、iNos、IL10 或 Ym1 特异性引物从 1 μg RNA 合成 cDNA 进行定量实时 (qRT)-PCR。数据表示为相对拷贝数 (RCN)（d，左）IL12 和 iNos mRNA，或（d，右）IL10 mRNA 和 Ym1 mRNA 表达超过内源对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh）的平均值。数据代表平均 RCN ± SEM。每个实验使用 5 对年龄匹配的同窝小鼠。(d) 使用 TRIzol 从肺和脾脏中提取总 RNA，并使用小鼠 IL12、iNos、IL10 或 Ym1 特异性引物从 1 μg RNA 合成 cDNA 进行定量实时 (qRT)-PCR。数据表示为相对拷贝数 (RCN)（d，左）IL12 和 iNos mRNA，或（d，右）IL10 mRNA 和 Ym1 mRNA 表达超过内源对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh）的平均值。数据代表平均 RCN ± SEM。每个实验使用 5 对年龄匹配的同窝小鼠。(d) 使用 TRIzol 从肺和脾脏中提取总 RNA，并使用小鼠 IL12、iNos、IL10 或 Ym1 特异性引物从 1 μg RNA 合成 cDNA 进行定量实时 (qRT)-PCR。数据表示为相对拷贝数 (RCN)（d，左）IL12 和 iNos mRNA，或（d，右）IL10 mRNA 和 Ym1 mRNA 表达超过内源对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh）的平均值。数据代表平均 RCN ± SEM。每个实验使用 5 对年龄匹配的同窝小鼠。
图 2. Myr-Akt 和 WT 小鼠肺中肌成纤维细胞的差异表达。(a) 处死 6-8 周大的 Myr-Akt 或 WT 小鼠，收获肺，石蜡包埋，并对肌成纤维细胞进行 α-SMA 免疫组织化学染色。使用 4X 和 20X 物镜（分别为 40× 和 200× 放大倍率）对每部分 10 张图片进行成像。(b) 使用 Adobe Photoshop CS5 软件通过直方图分析对图像进行量化，每个切片至少五个图像的每个高倍视野 (HPF) 的棕色染色百分比 (α-SMA+ 像素) 表示为平均值 ± SEM。(c) 从 Myr-Akt 或 WT 同窝小鼠肺中提取总 RNA，并通过 qRT-PCR 测量 α-SMA mRNA。数据表示为 α-SMA mRNA 表达相对于内源对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh）平均值的相对拷贝数（RCN）。数据代表平均 RCN ± SEM。使用小鼠 α-SMA 抗体对来自肺匀浆的单细胞悬浮液进行免疫染色或用 α-SMA 和 M-CSF-R (CD115) 抗体进行双重免疫染色，并通过流式细胞术进行分析。(d) 数据代表 α-SMA+ 细胞的平均百分比和 (e) α-SMA+/M-CSF-R+ 细胞 ± SEM。每个实验使用 5 对年龄匹配的同窝小鼠。
p = 0.014（图 2 (e)）。这些数据表明，与 WT 小鼠相比，Myr-Akt 小鼠共表达 M-CSF-R 的肺肌成纤维细胞 (α-SMA+) 的基础浓度增加。
3.3. Myr-Akt 小鼠改变了肺中关键自噬基因的表达
自噬是一个通过在细胞应激期间降解和回收细胞蛋白质和细胞器来维持细胞和组织稳态的过程。自噬活性与机体寿命相关，并且在 IPF 患者的肺组织中减少 [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]。因为细胞自噬被 PI3K/AKT/mTOR 通路的激活抑制 [ 47 ] [ 48 ] [ 49]，我们询问 M-CSF-R 驱动的 Myr-Akt 是否会损害 Myr-Akt 小鼠肺部的细胞自噬。合成后，微管相关蛋白轻链 proLC3 的羧基末端区域被半胱氨酸蛋白酶 ATG4 切割，在自噬过程中产生可溶性胞质形式的 LC3A/BI，LC3A/BI 转化为膜结合的 LC3A/B-II表格 [ 50 ]。由于 Cell Signaling Technology 的 LC3B 抗体主要识别自噬标志物 LC3BII，我们用 LC3B 对 Myr-Akt 小鼠及其 WT 同窝小鼠的肺进行染色（图 3 (a) 和图 3(b))。有趣的是，与 WT 小鼠的肺相比，我们观察到 Myr-Akt 小鼠肺中的 LC3B 显着降低（p = 0.016），这意味着 Myr-Akt 小鼠肺中的自噬受损。我们接下来通过 qRT-PCR分析了关键的自噬调节基因：Beclin-1 [ 29 ] 和 Lc3a 和 Lc3b [ 50 ] [ 51 ]。与 WT 小鼠的肺相比，Myr-Akt 小鼠的肺中 Beclin-1、Lc3a 和 Lc3b 基因表达显着降低（Beclin-1 p = 0.0025，Lc3a 和 Lc3b p < 0.001）（图 3 (c)） . 同样，与 WT 小鼠的肺相比，Myr-Akt 小鼠的肺中的 BECLIN-1 和 LC3A/B-II 蛋白也显着减少（BECLIN-1 的 p < 0.01，LC3A/BI 的 p = 0.09 和 p = 0.014对于 LC3A/B-II) (图 3(d))。因为抑制自噬会增加自噬受体 p62 蛋白的积累 [ 52 ]，我们还评估了多聚泛素结合蛋白 p62/SQSTM1 的表达，并观察到 Myr-Akt 小鼠肺中 p62 蛋白的积累增加（图 3 (d)， p = 0.07)。尽管 p62 蛋白作为自噬标志物，它可以在转录和翻译后水平进行调节 [ 53 ]，因此我们通过 qRT-PCR 从 Myr-Akt 和 WT 小鼠肺部测量 p62 mRNA，发现 p62 mRNA 没有变化，表明p62在翻译后水平受到调节，p62蛋白的积累是由于低自噬（图3(e))。此外，由于 AKT 正向调节 mTOR 活性，我们证实了 Myr-Akt 小鼠肺中磷-mTOR 的升高（图 3（f），p = 0.029）。总之，这些数据表明，与 WT 小鼠的肺相比，Myr-Akt 小鼠的肺减少了基础自噬并增加了 mTOR 活性。
3.4. Myr-Akt 小鼠体内循环纤维细胞数量增加
在肺纤维化的发病过程中，骨髓来源的循环纤维细胞可以运输到肺部 [ 24 ] [ 28 ]。我们询问 Myr-Akt 小鼠是否可以在体内产生更多的循环纤维细胞。我们从在纤维细胞衍生培养基中培养的小鼠 PBMC 中产生纤维细胞，并观察到与 WT 小鼠相比，Myr-Akt 小鼠的梭形成纤维细胞样细胞形态更多（图 4（a））。由于 CD45+/COL1+/CXCR4+ 纤维细胞在骨髓中扩增，据报道会导致博莱霉素诱导的肺纤维化 [ 24 ]，我们接下来用 CD45、胶原蛋白 I 和 CXCR4 特异性抗体对 PBMC 分化细胞进行染色（图4(b))。我们的数据表明，Myr-Akt 小鼠比 WT 小鼠产生明显更多的循环 CD45+/COL1+/CXCR4+ 纤维细胞（p = 0.05），基本。
图 3. Myr-Akt 小鼠肺部的自噬减少。(a) 处死 6-8 周大的 Myr-Akt 或 WT 小鼠，收获肺，石蜡包埋，并进行 LC3B 免疫组织化学染色。使用 10X 和 40X 物镜（分别为 100× 和 400× 放大倍率）对每部分 10 张图片进行成像。(b) 使用 Adobe Photoshop CS5 软件中的直方图分析功能对每个部分至少五张图像中每个高倍视野 (HPF) 的棕色染色百分比 (F4/80+ 像素) 进行量化，并表示为平均值 ± SEM。(c) 使用 TRIzol 从匀浆的肺中提取总 RNA。合成 cDNA 并使用对小鼠 Beclin-1、Lc3a 和 Lc3b mRNA 特异的引物进行 qRT-PCR。数据表示为 mRNA 表达相对于平均内源性对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh）的相对拷贝数（RCN）。数据代表平均 RCN ± SEM。(d) 分离总蛋白并在 4% - 12% SDS-PAGE 凝胶上分离等量的蛋白，并对 BECLIN-1、LC3A/BI 和 LC3A/B-II 和 β-ACTIN 进行免疫印迹。(e) 使用 TRIzol 从匀浆的肺中提取总 RNA。合成 cDNA 并使用对小鼠 p62/SQSTM1 mRNA 特异的引物进行 qRT-PCR。数据表示为 mRNA 表达相对于平均内源性对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh）的相对拷贝数（RCN）。数据代表平均 RCN ± SEM。(f) 磷-mTOR (ser2448) 和 mTOR (Cell Signaling Technology) 的免疫印迹。通过比较每个相应泳道中 β-ACTIN 或总 mTOR 的条带密度，使用密度测定法对条带进行量化。数据表示为平均光密度值 ± SEM。
图 4。与 WT 小鼠相比，Myr-Akt 小鼠的循环纤维细胞升高。(a) 处死 6-8 周大的 Myr-Akt 或 WT 小鼠并从心脏穿刺中收集血液。PBMC 被分离并在 FibroLife 培养基中培养 5 天以产生小鼠纤维细胞。在第 5 天使用 10 倍物镜（100 倍放大率）拍摄图像。(b) 使用 Accutase 去除细胞，用 CD45 和 CXCR4 对等量的细胞进行染色，然后对胶原蛋白 I 进行透化/固定和染色。通过流式细胞术分析细胞，并将纤维细胞鉴定为 CD45+/COLI+/CXCR4+ 群体。数据代表每组 5 只小鼠的纤维细胞平均百分比 ± SEM。
3.5. 博莱霉素挑战增强肺中的胶原蛋白沉积并降低 Myr-Akt 小鼠的存活率
因为 Myr-Akt 巨噬细胞表达 M2 嗜性，增加 α-SMA+ 肌成纤维细胞，增加循环 CD45+/COL1+/CXCR4+ 纤维细胞，并降低自噬相关基因表达，我们假设 Myr-Akt 小鼠会发展更多纤维化以响应重复施用博来霉素。
Kaplan-Meier 存活分析（图 5 (a)）说明与博来霉素处理的 WT 小鼠相比，用博来霉素攻击的 Myr-Akt 小鼠的存活率降低（p = 0.0284）。虽然在用 PBS（载体）处理的 Myr-Akt 或 WT 小鼠组中没有死亡，但 Myr-Akt 小鼠在博来霉素治疗后第 7 天开始死亡，而所有 WT 小鼠在博来霉素方案中存活到第 28 天。与载体处理的小鼠相比，接受博来霉素并存活到第 33 天的小鼠在肺中显示出典型的纤维化，包括蓝色染色像素（三色）作为胶原沉积的指示（图 5 (b) 和图 5 (c)）和显着炎症（图5（d））。博来霉素
图 5.Bleomycin 诱导肺中的胶原蛋白沉积并降低 Myr-Akt 小鼠的存活率。如材料和方法中所述，Myr-Akt 和野生型 (WT) 同窝小鼠每周用博来霉素 (0.035 U/g) 或 PBS（载体）处理 4 周，持续 4 周。(a) 使用 Kaplan-Meier 曲线记录和绘制小鼠存活率。Myr-Akt 小鼠对博来霉素治疗的反应比 WT 小鼠的存活率更差。每个 WT 和 Myr-Akt 小鼠组 N = 7 只小鼠。(b) 在第 33 天处死所有存活的小鼠，将肺福尔马林固定、切片并用马森三色染色。每张幻灯片捕获五张图像。红色染色代表角蛋白，浅红色和粉色染色代表细胞质，深棕色代表细胞核，蓝色染色代表胶原蛋白。这些图像是来自每组 3 只小鼠的代表性图像，使用 20 倍物镜（200 倍放大倍率）。(c) 通过使用 Adobe Photoshop CS 的直方图分析和来自 10 个图像的每个高倍视野 (HPF) 的蓝色染色百分比对图像进行盲目量化，并表示为平均值 ± SEM。(d) 来自 WT 和 Myr-Akt 小鼠的肺经 PBS 或用 H&E、三色和 F4/80 染色的博来霉素由董事会认证的病理学家评估炎症评分（0 到 5 分）。(e) 使用 TRIzol 从匀浆的肺组织中提取总 RNA。合成 cDNA 并对小鼠胶原蛋白 IA 和 IIIB 进行 qRT-PCR。数据表示为 mRNA 表达相对于平均内源性对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh）的平均相对拷贝数 (RCN)。数据代表平均 RCN ± SEM 和 N = 每组 4 只小鼠。(c) 通过使用 Adobe Photoshop CS 的直方图分析和来自 10 个图像的每个高倍视野 (HPF) 的蓝色染色百分比对图像进行盲目量化，并表示为平均值 ± SEM。(d) 来自 WT 和 Myr-Akt 小鼠的肺经 PBS 或用 H&E、三色和 F4/80 染色的博来霉素由董事会认证的病理学家评估炎症评分（0 到 5 分）。(e) 使用 TRIzol 从匀浆的肺组织中提取总 RNA。合成 cDNA 并对小鼠胶原蛋白 IA 和 IIIB 进行 qRT-PCR。数据表示为 mRNA 表达相对于平均内源性对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh）的平均相对拷贝数 (RCN)。数据代表平均 RCN ± SEM 和 N = 每组 4 只小鼠。(c) 通过使用 Adobe Photoshop CS 的直方图分析和来自 10 个图像的每个高倍视野 (HPF) 的蓝色染色百分比对图像进行盲目量化，并表示为平均值 ± SEM。(d) 来自 WT 和 Myr-Akt 小鼠的肺经 PBS 或用 H&E、三色和 F4/80 染色的博来霉素由董事会认证的病理学家评估炎症评分（0 到 5 分）。(e) 使用 TRIzol 从匀浆的肺组织中提取总 RNA。合成 cDNA 并对小鼠胶原蛋白 IA 和 IIIB 进行 qRT-PCR。数据表示为 mRNA 表达相对于平均内源性对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh）的平均相对拷贝数 (RCN)。数据代表平均 RCN ± SEM 和 N = 每组 4 只小鼠。
将 WT 小鼠肺中的胶原蛋白沉积增加 15%（博来霉素与 WT 中的载体，p < 0.001），而 Myr-Akt 将博来霉素效果提高到 28%（博来霉素与 Myr-Akt 中的载体，p = 0.004） , 统计协同检验表明这种增强是显着的 (p = 0.0178)。此外，博来霉素处理在 WT 中将胶原蛋白 IA 和 IIIB mRNA 上调 4 倍和 3 倍（与载体相比，p < 0.001），而 Myr-Akt 将博来霉素作用提高到 6 倍和 5 倍，分别（博莱霉素与 Myr-Akt 中的载体，均 p < 0.0001）。统计协同测试表明这种增强是显着的（对于胶原蛋白 IA，p = 0.0063，对于胶原蛋白 IIIB，p = 0.0014）（图 5(e))。我们的结果表明，Myr-Akt 增强了博来霉素的作用，导致肺纤维化增加和总体存活率降低。
3.6. Myr-Akt 小鼠在博来霉素攻击后表现出增加的 CD45 和 F4/80+ 细胞
为了确定 Myr-Akt 小鼠的肺部炎症是否增强，我们使用白细胞标记 CD45 [ 54 ] 和组织巨噬细胞标记 F4/80 [ 16 ] 对小鼠肺部进行免疫染色。与 WT 相比，Myr-Akt 小鼠中存在更多的 CD45+ 细胞（p = 0.05）（图 6 (a) 和图 6 (b)）。正如预期的那样，博来霉素治疗显着增加了 WT 和 Myr-Akt 小鼠肺中的 CD45+ 细胞（均 p < 0.01）。此外，在博莱霉素攻击后，与 WT 小鼠的肺相比，Myr-Akt 小鼠的肺中存在更多的 CD45+ 细胞 (p = 0.001) (图 6 (a) 和图 6 (b))。重要的是，与 CD45+ 细胞不同，如图 1 (a) 和图 1 所示(b)，F4/80+ 细胞在 Myr-Akt 和 WT 小鼠之间具有可比性（图 6 (c) 和图 6 (d)）。在博莱霉素攻击后，Myr-Akt 小鼠的肺中存在比 WT 小鼠更多的 F4/80+ 细胞 (p = 0.01)。正如预期的那样，博来霉素使 WT 小鼠肺中的 F4/80+ 细胞增加了 6 倍（p < 0.001），而 Myr-Akt 使博来霉素的作用增加了 8 倍（博来霉素与 Myr-Akt 中的载体）。尽管在统计学上差异不大，但 Myr-Akt 和博来霉素对 F4/80 表达具有显着的协同作用（p = 0.0708）（图 6（d））。这些数据表明博来霉素诱导的肺纤维化可能涉及募集的造血细胞，特别是 M2 巨噬细胞。
3.7. 博来霉素抑制肺中自噬基因的表达
IPF 中自噬水平降低可诱导上皮细胞衰老并加速肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞 [ 29 ]。我们的数据表明，与 WT 小鼠相比，Myr-Akt 小鼠在基础和博来霉素后都含有更多的 α-SMA + 肺肌成纤维细胞和更少的自噬相关基因在肺组织中表达。具体来说，我们最初观察到（图 3）与 WT 相比，基础 Myr-Akt 表达降低了关键自噬基因 Beclin-1、LC3a 和 LC3b。该数据被证实，与 WT 小鼠相比，载体处理的 Myr-Akt 小鼠在整个肺组织中的 Beclin-1、LC3a 和 LC3b mRNA 显着降低（对于 Beclin-1、LC3a 和 LC3b，p < 0.001）。可以预见的是，博莱霉素
图 6。Bleomycin 可增加 Myr-Akt 小鼠肺部的 CD45+ 和 F4/80+ 细胞。在第 33 天处死在博莱霉素或 PBS 方案中存活的小鼠，收获肺并进行免疫组织化学染色。每张幻灯片拍摄了十张图片。棕色像素代表 (a) CD45+ 或 (c) F4/80+ 细胞。图像代表每组三只小鼠。通过使用 Adobe Photoshop CS 的直方图分析和使用 10 倍物镜（100 倍放大率）从每个切片至少五张图像中获得的每个高倍视野 (HPF) 的棕色染色百分比对图像进行盲目量化，并表示为平均值 ± SEM ( b) 和 (d)。
WT 和 Myr-Akt 小鼠的治疗进一步降低了 Beclin-1 mRNA（载体与博来霉素在 WT 小鼠中的 p < 0.001；载体与博来霉素在 Myr-Akt 小鼠中的 p < 0.006）；LC3a mRNA（在 WT 小鼠中，载体与博来霉素的 p < 0.001；在 Myr-Akt 小鼠中，载体与博来霉素的 p < 0.001）；和 LC3b mRNA（在 WT 小鼠中，载体与博来霉素的 p < 0.001；在 Myr-Akt 小鼠中，载体与博来霉素的 p < 0.001）与样品匹配的载体对照相比（图 7）。有趣的是，博莱霉素治疗 Myr-Akt 小鼠后观察到自噬基因的协同降低（对于 beclin-1、LC3a 和 LC3b，p < 0.001）（图 7）。
4。讨论
我们之前曾报道，CSF1 在小鼠和 IPF 患者的肺纤维化中起重要作用 [ 38 ]。然而，该报告缺乏关于 CSF1 和 M-CSF-R 介导的信号如何促进
图 7。Bleomycin 抑制 Myr-Akt 小鼠肺中的自噬基因表达。根据制造商的方案，使用 RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE 从石蜡包埋的肺组织切片中提取总 RNA。合成 cDNA 并对小鼠 Beclin-1、Lc3a 和 Lc3b 进行 qRT-PCR。数据表示为 mRNA 表达相对于内源对照 RNA（Cap1、Rpl4 和 Gapdh.）平均值的相对拷贝数 (RCN)。数据代表平均 RCN ± SEM 和 N = 每组 4 只小鼠。
肺纤维化。为了了解 M-CSF-R 和 AKT 激活如何导致纤维化，我们使用了一种新型转基因小鼠模型，该模型在 M-CSF-R 启动子的控制下表达肉豆蔻酰化和组成型活性 AKT 同种型来研究细胞 CSF1 信号传导与肺纤维化发展之间的联系。有趣的是，我们没有观察到转基因或野生型小鼠肺部的基础结构差异，如苏木精和伊红 (H&E) 染色所示（补充图 2（一个））。然而，与来自 WT 小鼠的肺组织相比，Myr-Akt 小鼠的肺含有表达基础 M2 嗜性的巨噬细胞，表现出更多数量的肺细胞共表达 M-CSF-R 和 α-SMA，含有数量增加的循环纤维细胞，并降低了关键自噬基因的表达：在 mRNA 和蛋白质水平上的 Lc3a/b、Beclin-1 和 p62。此外，当用博莱霉素攻击时，Myr-Akt 小鼠比给予博莱霉素的 WT 小鼠肺纤维化、炎症、肌成纤维细胞、自噬更少和寿命更短。有趣的是，我们观察到 Myr-Akt 表达和博莱霉素攻击对调节肺病理学和纤维化的细胞和分子途径的协同作用。我们的研究提供了深入了解 CSF1 诱导的 AKT 激活在肺纤维化易感性中的关键作用的见解。
虽然我们对 M-CSF-R 和 AKT 靶向肺纤维化的潜力感到兴奋，但我们承认 Myr-Akt 小鼠作为人类肺纤维化模型的局限性。首先，仅通过拷贝数很难在这些小鼠中确定 Myr-Akt 表达的外显率。因此，为了选择具有最大 Myr-Akt 构建体外显率的小鼠，我们首先对小鼠进行基因分型，然后将那些脾脏增大的 Myr-Akt 小鼠分类为显示组成型活性 AKT 表型的 Myr-Akt 小鼠，因为脾肿大是与野生型小鼠相比，这些小鼠的巨噬细胞积累增强。我们进一步用巨噬细胞标记 F4/80 对脾脏进行染色，并证实 Myr-Akt 小鼠的脾脏中 F4/80 积累水平显着高于 WT 小鼠。最后，我们化验了肺、脾、图 3）。由于技术限制，我们无法有效地从小鼠肺部获得足够的 M-CSF-R+ 细胞。我们希望在 Myr-Akt 小鼠和具有 M-CSF-R+ 细胞的 WT 小鼠之间观察到更大的基因和蛋白质水平差异。
这种独特的模型提供了对 M-CSF-R 在肺纤维化中作用的深入了解。尽管小鼠模型在模拟人肺纤维化方面存在局限性，但我们从这项研究中获得了宝贵的见解。首先，M-CSF-R 诱导的 AKT 激活增强了 Myr-Akt 小鼠的基底肺 M2 巨噬细胞嗜性，这表明 M-CSF-R 和 AKT 驱动基因的激活可能使宿主在继发性损伤或损伤后易发生纤维化反应. 在人类纤维化器官组织中，M2 巨噬细胞有助于调节 ECM 中的炎症、肿瘤生长、基质形成和细胞碎片的清除 [ 16 ]。
除了我们对 M-CSF-R 激活在 IPF [ 38 ] 中作用的观察之外，另一项研究表明 IPF 患者肺泡巨噬细胞的 M2 基因 CCL18、CCL22 和 CD206 升高。在这项研究中，作者提出 L-4 和 IL-10 负责 M2 表型转变 [ 55]。最重要的是，我们的研究结果表明 M-CSF-R 调节的 AKT 活化与 M2 巨噬细胞极性之间存在联系，因为来自 Myr-Akt 小鼠的整个肺组织在肺和脾脏中增加了 IL-10 mRNA 和 M2 巨噬细胞极化。诚然，肺泡巨噬细胞不是 IL-10 的唯一产生者，在该模型中，整个肺组织中 IL-10 mRNA 的增加可能来自其他炎症细胞以及 I 型肺泡上皮细胞。正在进行研究以确认小鼠模型中肺 IL-10 的来源。事实上，PI3K/AKT 的负调节因子，即含有 src 同源性 2 的肌醇磷酸酶 (SHIP)，会干扰肺 M2 巨噬细胞偏斜，因为来自 SHIP1-/- 小鼠的腹膜和肺泡巨噬细胞在精氨酸酶 1 方面表达了强烈的 M2 基因特征和 Ym-1 mRNA 以及 M2 介导的肺病理学 [44 ]。来自 SHIP1-/- 小鼠的骨髓衍生巨噬细胞仅在 TGF-β 或 IL-3 刺激时显示 M2 表型 [ 14 ] [ 43 ]。此外，PI3K 抑制剂 LY294002 可降低肺泡巨噬细胞中 M2 基因的表达 [ 2 ] [ 14 ]。有趣的是，与 WT 小鼠相比，我们没有观察到 Myr-Akt 的肺中任何显着的形态学变化或巨噬细胞数量的增加（图 1（a）、底部和图 1（b））。因此，我们关于巨噬细胞 M2 表型嗜性、肌成纤维细胞和循环纤维细胞群增加以及自噬基因减少的数据表明，由 M-CSF-R 和 AKT 激活驱动的潜在启动效应有利于为纤维化做好准备的肺环境。
目前肺纤维化的范式表明，在易感宿主中，反复的亚临床肺损伤和上皮损伤会导致高收缩性和纤维化肌成纤维细胞的募集和激活 [ 2 ] [ 56 ]。有趣的是，磷酸酶和张力蛋白同源物 (PTEN)，一种 AKT 活性的负调节剂，在分离自 IPF 患者 [ 9 ] 的肌成纤维细胞 [ 56 ]中被下调。我们观察到未经治疗的 Myr-Akt 肺中基底 α-SMA+ 肌成纤维细胞数量增加。此外，肌成纤维细胞已被证明比正常成纤维细胞更能抵抗细胞凋亡，这可能会中断上皮细胞修复 [ 19 ] [ 30 ] [ 57]。由于在 Myr-Akt 小鼠的脾脏、肺和骨髓中观察到组成型活性 AKT（补充图 3），我们推测持续的 AKT 激活可能导致肌成纤维细胞存活、分化并最终导致器官纤维化。值得注意的是，我们观察到 Myr-Akt 小鼠肺中 α-SMA/M-CSF-R 双阳性细胞的增加。这一观察表明，作为启动效应的一部分，已知表达 M-CSF-R [ 22 ]的增殖平滑肌细胞分化成肌成纤维细胞，或者巨噬细胞可能转分化成肌成纤维细胞。这些问题需要进一步调查以阐明这些细胞的造血或间充质起源。
越来越多的证据表明在纤维化肺中检测到纤维细胞。纤维细胞是组织修复和重塑过程中成纤维细胞和肌成纤维细胞的重要来源 [ 24 ]。事实上，纤维细胞的关键标志物 CXCR4 表达受 PI3K/AKT/mTOR 通路和缺氧调节，因为抑制 PI3K/AKT/mTOR 活性会降低 PDGF 和缺氧诱导的 CXCR4 [ 27 ]。这些数据支持我们的 Myr-Akt 小鼠循环纤维细胞的增加。有趣的是，最近的一份报告表明，纤维细胞不会导致纤维化肺中显着的 I 型胶原沉积，并且它们可能通过协调其他细胞的募集在纤维化中发挥间接作用 [ 58]。研究 AKT 在巨噬细胞分化为成纤维细胞中的作用及其对成纤维细胞的旁分泌作用的研究正在进行中。
除了易感的 M2 极性以及肌成纤维细胞和纤维细胞的存在外，我们还发现来自 Myr-Akt 小鼠肺部的细胞的关键自噬调节基因的表达发生了改变，表明自噬减少。由于自噬是细胞寿命和体内平衡的关键途径，并且在 IPF 患者的肺中减少，因此了解该途径的分子调控可能有助于有效的药物干预。根据现有文献，我们选择测量 LC3-II（LC3 的脂化/自噬体膜相关形式）、Beclin-1 和 p62（泛素结合自噬底物受体）蛋白作为自噬标志物。使用三种标志物来评估自噬有助于克服任何一种单一标志物在评估这种复杂系统时的局限性，从而有助于更准确地解释结果。我们的结果表明来自 Myr-Akt 小鼠的肺组织减少了自噬。与我们在 Myr-Akt 小鼠中的观察结果一致，其他人证明通过敲低 Lc3b 和 Atg5 mRNA 抑制自噬可增强肺成纤维细胞中 α-SMA 和 I 型胶原蛋白的表达。29 ]。同样，通过用雷帕霉素抑制肺成纤维细胞中的 mTOR 活性来诱导自噬可降低细胞 α-SMA 和纤连蛋白的表达 [ 30 ]，这将自噬和 α-SMA 表达与 Myr-Akt 小鼠的肺纤维化联系起来。值得注意的是，除了用于表达肺胶原 mRNA 的 qRT-PCR 外，我们选择使用三色染色代替 Sircol 或对整个肺组织进行羟脯氨酸测定，以确定胶原沉积位置的潜在差异。此外，我们未能在体内评估溶酶体抑制剂的自噬通量。自噬通量是自噬从吞噬细胞形成到底物降解和分解产物释放的完整过程。测量自噬通量将包括在我们未来的自噬分析中。
有趣的是，自噬的调节可能是细胞特异性的。阿拉亚等人。据报道，在人支气管上皮细胞中激活自噬可抑制内质网 (ER) 应激和细胞衰老 [ 29 ]。相比之下，抑制自噬还可以促进 IPF 患者肺部的肌成纤维细胞分化 [ 29 ]。我们的研究显示 Myr-Akt 小鼠肺中的关键自噬基因 Beclin-1、Lc3a 和 Lc3b 减少。几条证据表明，自噬、细胞凋亡和衰老受到严格调节以维持细胞和器官的稳态。例如，人类 IPF 样本中肺肌成纤维细胞凋亡减少导致肺修复失调 [ 59 ] 与 IPF 肺组织中自噬的抑制相关[59]。30 ] [ 31 ] [ 47 ]。重要的是，AKT 诱导的 mTOR 激活对于减少自噬至关重要，因为已证明雷帕霉素可诱导自噬 [ 47]。我们观察到 Myr-Akt 小鼠肺中 mTOR 活性升高，表明通过 AKT/mTOR 通路减少自噬。此外，在我们的 Myr-Akt 鼠模型中，组成型 AKT 激活与自噬基因表达降低相关，博莱霉素攻击进一步降低了自噬基因表达。组成型活性 AKT 和博莱霉素的组合可能会产生一种情况，即不需要的蛋白质和细胞器的清除受到阻碍，从而导致 Myr-Akt 小鼠的存活时间缩短。我们目前正在研究巨噬细胞中 AKT 的激活以及观察到的自噬标志物肺表达的变化是否直接归因于巨噬细胞本身的变化，或者这种 AKT 活性是否转化为其他细胞表型的改变。
本报告提供了 M-CSF-R 诱导的 AKT 活性与 M2 巨噬细胞偏向、肌成纤维细胞标志物表达和自噬基因表达降低之间的联系。我们使用转基因鼠模型来证明 CSF1 和 AKT 在肺中的促纤维化作用，并相信这些观察结果可能适用于临床肺病，因为我们显示过表达 AKT 在博莱霉素存在下使肺易发生纤维化。这一预测是基于我们之前的数据表明 CSF1 在 IPF 中很重要，我们推测本报告阐明了这种效应的潜在机制，即 CSF1 诱导的诱发人类肺纤维化的诱因。
致谢
作者感谢 DHLRI 动物核心设施的 Leeanne Garrett 和 Christie Newland 提供的帮助，他们维护了小鼠群体并帮助进行了小鼠手术。作者还感谢俄亥俄州立大学兽医学院的免疫组织化学核心设施，以协助组织切片和染色。Melissa G. Piper 于 2013 年 12 月去世。这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所 (NHLBI) HL067176、HL109481 和 HL102464 (CBM) 的研究资助。
作者贡献
构思与设计：CBM、MGP、TDE、YW；数据采集：YW、DD、TB、EE；数据分析和解释：CBM、TDE、YW、DD、XM；手稿的写作和编辑：DD、YW、TDE、CBM
补充材料
补充表 1。qRT-PCR 引物。
用于 qRT-PCR 的鼠引物：（5' 至 3'）
伊尔12
（向前）
ggaagcacggcagcagaata
（撤销）
aacttgagggagaagtaggaatgg
伊诺斯
（向前）
accctaagagtcaccaaaatggc
（撤销）
ttgatcctcacatactgtggacg
伊尔-10)
（向前）
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（撤销）
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Ym1
（向前）
ctggaattggtgcccctaca
（撤销）
caagcatggtggttttacagga
大肠杆菌
（向前）
atggattcccgttcgagtacg
（撤销）
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ColIIIb
（向前）
cacccttcttcatcccactctta
（撤销）
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SMA
（向前）
gctcagccagatgcaatcaa
（撤销）
ccttggccacaatggtcttg
贝林1
（向前）
caatgtcttcaatgccacctt
（撤销）
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地图1lc3a
（向前）
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（撤销）
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地图1lc3b
（向前）
cgtcctggacaagaccaagt
（撤销）
ccattcaccaggaggaagaa
补充图 1。AKT 组成型激活和 Myr-Akt 小鼠鉴定的示意图。(a) 在 Myr-Akt 小鼠中，在没有 CSF1 的情况下，AKT 在巨噬细胞中具有活性。(b) 基因分型确定了将 Myr-Akt 与 WT 小鼠区分开来的 200 bp 条带。(c) 脾肿大作为 Myr-Akt 外显率的确认。
补充图 2。Myr-Akt 小鼠的组织结构。处死 6 - 8 周大的 WT 或 Myr-Akt 小鼠并 (a) 肺和 (b) 脾脏收获，石蜡包埋，并使用 4X 和 20X 物镜 (40X) 进行苏木精和伊红 (H&E) 染色和显微镜检查和 200 倍放大倍率）。
补充图 3。Myr-Akt 小鼠各种组织中的信号通路激活。处死 6-8 周大的 WT 或 Myr-Akt 小鼠，收获 (a) 肺、(b) 脾和 (c) 骨髓，并进行蛋白质印迹分析，以了解磷-Akt 和磷-EKR 的差异相对于 β-ACTIN 的表达。
笔记
@Melissa G. Piper 于 2013 年 12 月去世。
＃这些作者同等贡献这项工作。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
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