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摘要：

内脏炎症慢性肝病增加肠道血管生成。在目前的研究中，我们的目的是证明小肠淋巴管生成与大鼠慢性胆汁淤积中的血管生成有关。在胆汁淤积的大鼠中进行了小肠淋巴微循环的体视学研究。胆汁淤积中的前门肠病增加了黏膜和黏膜下层的淋巴微血管。因此，关于肌肉层 0.015 ± 0.01，黏膜 (0.16 ± 0.01) 和黏膜下层 (0.16 ± 0.01) 的淋巴微血管体积分数优于 (p < 0.001)。粘膜（76.89 ± 2.86 mm -2 ; p < 0.001）和粘膜下层（14.87 ± 2.86 mm）的淋巴微血管长度密度更高-2 ; p < 0.01)，与肌肉层有关 (5.04 ± 2.92 mm -2 )。这些改变主要发生在十二指肠（体积分数：0.10 ± 0.01 和长度密度：33.55 ± 5.98 mm -2）和回肠（体积分数：0.16 ± 0.01 和长度密度：38.62 ± 6.07 mm -2）。这项研究证明了与慢性肝病相关的小肠两端淋巴管生成反应增加的优势。由于慢性肝功能不全患者的门体静脉侧支循环发育于胃肠道末端，十二指肠-回肠淋巴管的过度生成可能提示慢性门静脉高压症中肠系膜-全身淋巴旁路的发展。

 

关键词

 

慢性 肝病,淋巴管生成,显微外科,侧支淋巴循环

 

 

一、简介

 

在门静脉高压症的胃肠道中发现的基本结构损伤是血管性的，由更多数量和更大的血管组成 [ 1 ] [ 2 ]。因此，为这种肠病提出的名称是“高血压门肠血管病”[ 3 ]。

 

此外，持续的门静脉高压会增加肠系膜淋巴流量并导致淋巴引流受损，这被认为是腹水的重要致病机制 [ 4 ] [ 5 ]。反过来，门静脉高压症中胃肠道淋巴血管系统的慢性功能衰竭会引起代偿性淋巴管生成反应 [ 5 ] [ 6 ]。目前，门静脉高压症典型的肠道淋巴血管改变的特征尚不清楚，尤其是与慢性进行性肝功能衰竭相关时 [ 6]。因此，本研究的目的之一是在继发于胆管纤维化的慢性门静脉高压症的实验模型中证明肠道淋巴血管变化的分布。

 

由于与慢性肝功能衰竭相关的内脏改变在本质上被认为是炎症 [ 7 ] [ 8 ]，因此可以提出，类似于肠系膜静脉血管病，高血压肠淋巴管病与大鼠胆道纤维化相关，这也将具有类似的发病机制。

 

二、材料与方法

 

2.1。动物管理

 

使用来自拉巴斯大学医院实验手术室动物设施的平均体重在 218 和 334 g 之间的雄性 Wistar 大鼠，对应年龄为 8 至 10 周。

 

给动物喂食标准实验室啮齿动物饮食（大鼠/小鼠A 04 维持饮食；Panlab.Barcelona.Spain）和随意饮水。他们被安置在一个平均温度（22˚C ± 2˚C）和湿度（65% - 70%）的光照/黑暗控制房间（光照周期：上午 7:30 - 晚上 7:30），分组三到四只动物。

 

本研究中采用的实验程序基于 1986 年欧洲实验动物护理和使用指南的原则和实践，符合欧洲共同体理事会指令 (86/609/EEC) 的伦理指南，并以西班牙语出版皇家法令 1201/2005。所有程序均经拉巴斯医院动物福利委员会批准。

 

2.2. 实验设计

 

将 41 只雄性大鼠随机分为两组：假手术组（SO；n = 11）、显微外科胆汁淤积组（MC；n = 30）。SO组全部存活，MC组5只大鼠在术后第7周死于肝功能衰竭相关的胃肠道出血。因此，从研究开始有 36 只大鼠存活到处死：假手术（SO；n = 11）和显微手术胆汁淤积（MC；n = 25）。

 

2.3. 手术程序

 

用 1.5% - 2% 异氟烷（吸入蒸发器，TEC 4 (Ohemeda)）麻醉大鼠。手术在无菌但非无菌条件下进行。

 

在 SO 大鼠中，胆管及其小叶分支被解剖而不切除。如前所述 [ 9 ] [ 10 ]，在 MC 大鼠中，使用双目手术显微镜（OPMI 1-FR；蔡司，马德里，西班牙）进行肝外胆道切除术。简而言之，结扎胆总管（丝绸 4/0）并切片，结扎小叶胆管分支，然后切片。

 

用可吸收缝线（3/0 聚乙醇酸）和丝线（3/0）将腹部封闭成两层。在术后早期给予丁丙诺啡（0.05 mg/kg/8 h sc）用于镇痛。还施用了广谱抗生素（头孢曲松；50 mg/kg，每周两次）和维生素 K1（植物甲萘醌；8 mg/kg，每周一次）。

 

干预第8周处死所有大鼠。研究了以下几个方面：

 

2.4. 腹水量测定

 

使用 10 ml 注射器通过抽吸在所有胆汁淤积的大鼠中提取腹水。

 

2.5. 门体侧支循环

 

首先，进行中腹部切口。接下来，研究了侧支静脉循环发展的区域，即脾肾、胃食管和结肠直肠的侧支静脉 [ 7 ]。

 

2.6. 血清生化检查

 

在通过穿刺肝下下腔静脉获得的血液中，使用日立 U- 2000 分光光度计（日立日精产业株式会社，日本）。

 

2.7. 用 LYVE-1 对肠淋巴管进行免疫标记

 

淋巴管内皮细胞与血管内皮细胞有许多共同的标志物 [ 11 ]。已开发出淋巴管内皮特异性的细胞表面标志物。淋巴管内皮细胞已通过使用抗 podoplanin、血管内皮生长因子受体 (VEGFR)-3 或淋巴管透明质酸受体 (LYVE)-1 的抗体进行阳性选择，并通过使用针对 CD34 的抗体进行阴性选择来分离 [ 12 ]。此外，转录因子 prospero 相关的同源域转录因子 (Prox)-1 对于建立淋巴管内皮细胞身份至关重要。它的表达由 Sox 18 转录因子控制 [ 13 ] [ 14]。淋巴管内皮细胞表达特定分子，如 Prox-1、VEGFR-3、膜糖蛋白 podoplanin 和 LYVE-1 [ 15 ]；后者在目前的体视学研究中用作细胞淋巴标志物（图 1）。

 

取各组小肠（十二指肠、空肠和回肠）样品，用多聚甲醛（10%）固定1周，乙醇脱水，石蜡包埋。切割石蜡切片（2 - 4 μm 厚）并附在载玻片上。一些脱蜡切片用苏木精-伊红 (HE) 染色以显示形态学发现。其他脱蜡切片在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中再水化并进行免疫染色 [ 16]。简而言之，免疫过氧化物酶染色的所有连续切片首先用 PBS 中的 1% 过氧化氢封闭。接下来，将它们在封闭溶液、含有 5% 正常山羊血清 (NGS) (Vector Laboratories; Burlingame, CA, USA) 的 PBS 中在室温下孵育 1 小时。然后用兔多克隆抗 LYVE-1 对它们进行免疫染色，稀释度 1:500（Abcam；Cambridge，UK），在 4°C 下用 5% NGS 的 PBS 中过夜。最后将免疫染色切片在生物素缀合的山羊抗兔 IgG (Vector Lab.) 中在室温下孵育 1 小时。免疫反应产物随后用 Vectastain® 亲和素-生物素复合物 (ABC) 试剂 (Vector Lab.) 和金属增强的二氨基联苯胺 (DAB) 底物试剂盒 (Pierce; Rockford, IL, USA) 进行可视化 [ 17]。免疫反应后，切片用哈里斯苏木精复染。所有载玻片在乙醇中脱水并固定在合成树脂（Depex，Serva，Heidelberg，Germany）中。

 

2.8. 研究肠道淋巴管的定量方法

 

在所有动物组中评估以下参数：

 

1) 淋巴管所占的体积分数 (V v vasc)。

 

五v血管=∑船舶积分参考空间上的∑点(1)

 

2) 淋巴管长度密度(L v )。解剖器框架用于对符合 Sterio 规则 [ 18 ] 计数的免疫染色血管轮廓进行采样。长度密度使用以下公式计算：

 

大号v=( 2 × ∑ Q - )∑ A(2)

 

其中 Q- = 符合条件的免疫阳性血管分布的数量和

 

∑ A= 采样的基质面积，即解剖帧的面积乘以所选帧的数量。

 

L v =以mm -2表示（容器的mm长度/mm 3参考体积）。

 

3) 根据公式计算的平均血管直径 (AVD)，以 µm [ 18 ] 表示：

 

一个视频_= 2 × 103 ×五v血管/五v基质⋅ π⋅大号v-------------------√(3)

 

 

 

图 1。假手术 (SO) 和显微手术胆汁淤积大鼠 (MC) 的小肠用 LYVE1 进行免疫染色。(a) 十二指肠 SO-大鼠的图像：在固有层中观察到一个小的淋巴管腔 (箭头); (b) 患有 MC 的大鼠的十二指肠固有层：观察到大量和扩大的​​淋巴管（箭头）；(c) 空肠 SO-大鼠的图像：在粘膜下层观察到淋巴管腔 (箭头); (d) 患有 MC 的大鼠的空肠固有层：在固有层（星形）和黏膜下层（箭头）中观察到大量和扩大的​​淋巴管；(e) 来自 SO 大鼠的回肠图像：可见两个小淋巴管腔（箭头）；(f) 来自具有 MC 的动物的回肠粘膜显示淋巴微血管的相关扩大（箭头）。所有图像中校准条的大小为​​ 100 µm。

 

2.9。统计分析

 

使用社会科学统计软件包（SPSS，第 21 版，Chicago, Inc.）分析数据。从立体学参数获得平均值±SEM。进行了 2 因子 ANOVA 和事后 Duncan 检验以进行统计比较。如果 p < 0.05，则假定具有统计学意义。

 

3. 结果

 

3.1。身体和器官重量

 

相对于 SO 动物，MC 动物的肝脏和脾脏重量增加（p < 0.001）。相反，相对于 SO 大鼠，MC 大鼠的睾丸重量减少（p < 0.05）（表 1）。

 

3.2. 门体侧支循环

 

所有胆汁淤积的大鼠均出现门体侧支循环，无论是直肠旁、食道旁或脾肾。

 

3.3. 腹水量

 

MC组平均腹水量为10.5±8.6 ml。

 

3.4. 肝功能

 

相对于 SO 大鼠（表 2 ） ，患有 MC 的动物的总胆红素、碱性磷酸酶、AST 和 ALT 血清水平增加（p < 0.001 ）。与 SO 大鼠相比，MC 大鼠的血清白蛋白水平较低（p < 0.001）（表 2）。

 

3.5. 显微外科阻塞性胆汁淤积症淋巴微循环的体视学研究

 

显微外科胆汁淤积大鼠显示位于黏膜（V v vasc：0.16 ± 0.01；L v：76.89 ± 2.86 mm - 2）和黏膜下层（V v vasc：0.16 ± 0.01 ）的淋巴管的体积分数和长度密度增加; L v : 14.87 ± 2.86 mm -2 ) 与 SO 大鼠相关（图 2 (a)、图 2 (b) 和图 3 (a) 和图 3 (b)）。因此，这些参数在十二指肠中增加（V v vasc：0.10 ± 0.01 vs. V v vasc：0.04 ± 0.01；p < 0.001；L v：33.55 ± 5.98 mm -2与 L v : 8.68 ±

 

 

平均值±标准误差；*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001：关于 SO 大鼠的统计显着值。

 

 

平均值±标准误差；***p < 0.001：关于 SO 大鼠的统计显着值。

 

 

 

图 2。根据小肠层 (a) (黏膜、黏膜下层和肌肉) 和区域 (b) (十二指肠、空肠和回肠) 对淋巴管体积分数 (Vv) 进行立体量化。SO（假手术大鼠）；MC（大鼠显微外科胆汁淤积症）；结果表示为平均值±标准差。**p < 0.01; ***p < 0.001：对 SO 大鼠有统计学意义。

 

 

 

图 3。根据小肠层 (a) (黏膜、黏膜下层和肌肉) 和区域 (b) (十二指肠、空肠和回肠) 对淋巴管长度 (Lv) 密度进行立体量化。SO（假手术大鼠）；MC（显微外科胆汁淤积大鼠）；结果表示为平均值±标准差。**p < 0.01; ***p < 0.001：关于 SO 大鼠的统计显着值；p < 0.05; P < 0.001：关于 MC 大鼠的统计显着值。

 

5.98 毫米-2；p < 0.001) 空肠 (V v vasc: 0.08 ± 0.01 vs. V v vasc: 0.03 ± 0.01; p < 0.01; L v : 25.42 ± 5.98 mm -2 vs. L v : 7.02 ± 5.98 mm -2 ; p < 0.01) 和回肠 (V v vasc: 0.16 ± 0.01 vs. V v vasc: 0.02 ± 0.01; p < 0.001; L v : 38.63 ± 6.07 mm -2 vs. L v : 6.26 ± 6.07 mm -2 ; p < 0.001 ), 与 SO 大鼠相关的胆汁淤积大鼠, 尽管这些增加在十二指肠和回肠中更为显着 (图 1 (b) 和图 1 (e);图 2(b) 和图 3 (b))。

 

最后，所有层的平均血管直径（AVD）与 SO 大鼠和胆汁淤积大鼠小肠的每个解剖区域（十二指肠、空肠和回肠）相似。

 

4。讨论

 

本实验研究使用立体学方法结合淋巴管内皮细胞的细胞表面标记物来估计显微手术胆汁淤积大鼠小肠中淋巴管 [ 19 ] [ 20 ] 的体积分数、长度密度和平均血管直径等参数。

 

淋巴管内皮细胞共享许多标记 [ 11 ]，这些标记已通过使用抗足足蛋白、血管内皮生长因子受体 (VEGFR)-3 或淋巴管透明质酸受体 (LYVE)-1 的抗体进行阳性选择以及使用抗体进行阴性选择进行分离到 CD34 [ 12 ]。Prox-1 对于建立淋巴管内皮细胞身份至关重要；它的表达受 Sox 18 转录因子 [ 13 ] [ 14 ] 控制。淋巴管内皮细胞表达特定分子，如 Prox-1、VEGFR-3、膜糖蛋白 podoplanin 和 LYVE-1 [ 15 ]。

 

在这个显微外科胆道纤维化实验模型中，小肠黏膜和黏膜下层淋巴管的体积分数和长度密度增加可归因于间质淋巴产生增加，这反过来又使淋巴微血管中的淋巴流量和压力增加。此外，肠道淋巴管功能障碍可导致蛋白质和富含脂质的间质液积聚和淋巴水肿 [ 21 ]。

 

胆汁淤积对肠黏膜有病理作用 [ 21 ] [ 22 ]。事实上，胆管结扎导致的短期胆汁淤积大鼠在回肠黏膜中失去了紧密连接蛋白，随后通透性增加 [ 23 ] [ 24 ]]。这些显着的形态学肠粘膜损伤可能导致乳淋巴管的脆弱性增加，因为它们位于肠绒毛中，因此靠近肠粘膜。研究表明，胆道梗阻患者的身体会发生各种病理生理变化。胆道阻塞不仅会导致肝损伤，还会导致肾功能衰竭和心功能不全和止血异常。此外，胆道梗阻还会损害肠道屏障功能，诱导肠道细菌过度生长和细菌移位 [ 25]。肠道的功能是分泌和吸收，它们在维持生物体的体内平衡方面发挥着重要作用。此外，肠道吸收为身体提供营养。研究发现，胆道梗阻引起的胆汁缺乏会损害肠黏膜 HCO 3 -和 Cl -的分泌能力，并降低维生素 E、钙、镁、脂肪酸和一些药物的肠道吸收[ 25 ]。

 

小肠绒毛的淋巴系统起源于位于绒毛顶端部分的大型中央血管或乳管。小肠的毛细淋巴管有孔。此外，它们被破碎的基底膜包围，锚丝附着在腔外位置 [ 24 ]。胆汁淤积大鼠肠道淋巴病理生理学可能与炎症有关，显微手术肝外胆汁淤积大鼠小肠和肠系膜淋巴复合体中 Th1 和 Th2 淋巴细胞活化增加 [ 26 ]。

 

淋巴管的引流功能对肠间质炎症至关重要。门静脉高压症期间肠道产生的生物活性因子以及易位细菌导致远处器官衰竭 [ 27 ] [ 28 ]。有证据支持肠道和肠系膜淋巴结在多器官功能障碍综合征 (MODS) [ 27 ] [ 28 ] 发病机制中的关键作用]。与门静脉高压相关的肠黏膜炎症，也因并存的肝功能损害程度而加重，会引起淋巴管病变。肠道淋巴系统的这种改变的特点是清除不足，以避免过多的肠道液体积聚和炎症介质。因此，炎症和水肿发展，并且淋巴管扩张。

 

淋巴管在炎症病因中的突出作用已在几篇优秀的评论中得到解释 [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]。淋巴管的生长或淋巴管生成积极参与多种病理状况，包括组织和器官炎症 [ 32 ]。特别是，淋巴管生成可能有利于减少与淋巴水肿相关的炎症 [ 24 ]。

 

本文中显示的体视学研究表明，胆汁淤积大鼠黏膜和黏膜下淋巴微循环的改变可能归因于对肠道炎症反应的淋巴管生成激活，主要是在黏膜中。然而，需要进一步的研究来证明这一假设。已经证明，VEGF 家族的两个成员，VEGF-C 和 VEGF-D，通过激活 VEGFR-3 产生淋巴管生成，该 VEGFR-3 由正常成人组织中的淋巴管内皮细胞表达 [ 33 ] [ 34 ]。

 

相对于空肠，十二指肠和回肠中淋巴管的体积分数和长度密度增加可能对应于小肠两端门静脉高压症中炎症反应的优势。肠淋巴管生成的这种特征性位置与门静脉高压症中血管生成反应的特殊肠道位置相似。因此，腹腔内肠道近端和远端，即食道和直肠的过度血管生成分别诱导门体侧支循环的发展。图 4）。门体静脉侧支循环的存在允许肠道来源的有害物质，如损伤相关分子模式 (DAMP) 和病原体相关分子模式 (PAMP)，到达体循环 [ 28 ] [ 29 ]。由于体循环中这些有害物质的存在严重加重了慢性肝病患者的预后，因此肠系膜-体循环侧支循环的存在将代表这些患者的一个新的病理生理因素（图5）。

 

在门静脉高压症中，过度的血管生成反应和淋巴管生成反应可能与小肠和肠系膜淋巴结中肥大细胞浸润增加有关 [ 35 ] [ 36 ]。人肥大细胞是血管生成因子和淋巴管生成因子的主要来源。此外，在炎症和肿瘤部位产生的 VEGF-C 和 VEGD-D 可以通过与 VEGFR 相互作用来放大肥大细胞浸润。此外，肥大细胞衍生的蛋白酶，例如类胰蛋白酶、MMP2 和 MMP9 糜酶，可以调节血管生成和淋巴管生成 [ 35 ] [ 37]。免疫系统细胞及其介质需要考虑在未来对慢性炎症性疾病和肿瘤中的血管生成/淋巴管生成进行治疗操作 [ 34 ]。

 

与大鼠胆道纤维化相关的门静脉高压症导致肠系膜淋巴复合体 (MLC) 的广泛肥大细胞浸润 [ 36 ]。此次大规模招聘

 

 

 

图 4。显微外科胆汁淤积大鼠的内脏系统侧支循环、静脉（左）和淋巴（右）示意图。继发于失代偿的慢性加急性炎症性肝病，在患有阻塞性胆汁淤积的大鼠中诱发门脉高压性肠病，具有过度的血管生成和淋巴管生成反应，与淋巴血管内皮的通透性增加、间质水肿、腹膜间皮的通透性增加有关最后，腹水发展。FBD：纤维化胆道疾病；MLC：发炎的肠系膜淋巴结复合体。

 

 

 

图 5。血管生成和淋巴管生成在与慢性肝病相关的门静脉高压症中内脏-全身侧支循环发展中的病因相互关系的示意图。DAMPs：损伤相关的分子模式；MODS：多器官功能障碍综合征；MOF：多器官衰竭；PAMPs：病原体相关分子模式。

 

MLC 中的肥大细胞反过来会损害肠源的淋巴流动。因此，门静脉高压症中肥大细胞相关性肠系膜腺炎可加重肠淋巴高压。如果是这样，这个因素也会通过机械传导和随后的淋巴管生成诱导肠道炎症。特别是，趋化因子，炎症反应的基本介质，将参与淋巴重塑过程，无论是血管还是淋巴结 [ 38]。通过这种方式，可以提出肠系膜淋巴侧支循环是通过门脉高压大鼠连续两次打击而发展的假设。第一次打击与门静脉高压产生的炎症有关，水肿和淋巴流量增加，而第二次打击将是肠淋巴高压，这反过来又有利于淋巴管生成和肠系膜腺炎[ 38 ]。因此，门静脉高压症中的肠道血管生成或淋巴管生成将具有互补的致病作用 [ 39 ]。

 

最后，这种与门静脉高压相关的肠道淋巴病变可能在腹水产生中具有致病作用。因此，门静脉高压和肠系膜淋巴高压之间的耦合会引起肠道炎症反应，这是一种有害的影响。也许这种肠道淋巴的过度生成压倒了胆汁淤积大鼠新生淋巴侧支循环的引流能力。如果是这样，间质-淋巴-腹膜轴的淋巴量超载最终会导致腹水 [ 6 ] [ 39 ] [ 40 ]。

 

5. 结论

 

总之，本研究表明患有与胆汁淤积相关的慢性肝病的大鼠发生淋巴血管性肠病。十二指肠和回肠中过多的淋巴管生成可能代表小肠两端的炎症反应占主导地位。然后，结果将是该实验模型中肠系膜系统淋巴侧支循环的发展。由于慢性肝功能不全的门体静脉侧支循环在胃肠道末端发育，过度的十二指肠-回肠淋巴管生成可能提示慢性门静脉高压症的肠系膜-系统淋巴旁路的发展。产生过度淋巴管生成的肠道炎症反应类型的表征将有助于更好地了解门脉高压性肠病的病理生理机制。此外，这种认识将有助于为其严重并发症（包括侧支淋巴循环和腹水）建立更有效的治疗方法。

 

资金

 

这项研究得到了 Mutua Madrileña 基金会 (FMM-Ref. No. PA 6977/2009 和 AP 105502012) 的资助。

 

致谢

 

我们要感谢马德里自治大学医学院解剖学、组织学和神经科学系的 Carmen Sánchez，感谢她在准备本研究中的病理学方法方面提供的宝贵技术帮助，感谢 Elizabeth Mascola 将手稿翻译成英文。

 

利益冲突

 

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

 

参考

 

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