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摘要：植物花瓣中花青素的种类和含量，可使植物呈现粉红色、红色、紫罗兰色和蓝色等，对植物的着色起主要作用。本研究分析了芫荽“紫芷”、芫荽“粉子芷”和芨芨草“白子芷”3个杂交品种花瓣中花青素的种类和含量，并探讨其直接成因。推断了三个R. rugosa杂交品种的花色差异。为芍药的着色机理和花色育种提供参考。具体方法如下：三个R. rugosa的五个开花期的花瓣以杂交品种为材料，采用高效液相色谱法（HPLC）对其所含花青素的种类和含量进行定性和定量分析。芍药“紫芷”和芫荽“粉子芷”中鉴定出相同的六种花青素，主要是芍药甙和花青素的二甙。两种花青素的相对含量在萌芽期和初开期均较高。“紫芝”不同花期，Pn3G5G含量达4280.84±20.82 μg · g -1 ， Cy3G5G含量达789.41±1.21 μg · g -1。在R. rugosa“粉子志”中，Pn3G5G含量最高达到1293.50±17.64 μg · g -1，Cy3G5G含量最高达到358.86±3.94 μg · g -1。可以推测，Pn3G5G和Cy3G5G含量的差异是造成“紫芝”和“粉紫芝”花瓣颜色差异的主要原因。“白子芷”共鉴定出5种花青素，含量较低。与R. rugosa “紫芝”和R. rugosa相比“粉子之”，没有检测到Cy3G的存在。因此，我们推测上述两个原因可能是造成蒺藜“白子枝”的视觉白色花朵的原因。

 

关键词

 

.蔷薇,花色,花青素, HPLC ;

 

 

一、简介

 

蔷薇是蔷薇科蔷薇属的重要观赏植物。原产中国，栽培历史悠久。它不仅是珍贵的中草药、食品和工业原料，还是园林绿化和水土保持的优良植物材料。大多数蔷薇品种的颜色是紫色，只有少数品种是粉红色和白色，缺少黄色、橙色和红色的花朵 [ 1 ] [ 2 ]。R. rugosa的颜色非常单一，严重影响了其在园林绿化中的应用[ 3 ]。因此，了解 R. rugosa 显色机制成为许多研究人员的目标。

 

植物的花色与色素种类、色素含量（包括各种色素的相对含量）、花瓣的内部或表面结构有关，但最重要的因素是花青素的种类和含量。花青素是植物花瓣颜色和果实颜色的主要色素之一。属于黄酮类化合物的一种水溶性色素。花青素有20多种，主要存在于植物中，花青素、飞燕草素、天竺葵素、矮牵牛素、牡丹素、锦葵素。花青素主要以植物苷的形式存在于液泡中，通常被称为花青素 [ 4 ] [ 5] . 花青素是通过在花青素的 B 环 C3 或 A 环 C5 位置上结合一个或两个糖分子而形成的[ 6 ]。植物花瓣中花青素的种类和含量可以使植物呈现粉红色、红色、紫罗兰色、蓝色等。牛和楚对R. rugosa中的色素进行紫外可见扫描，在380 nm和520 nm处获得了两个吸收峰, 推测是花青素 [ 7 ] . 王先生测定了平阴“风华一号”中的花青素种类，发现其主要成分为Cy3G5G[ 8 ]。张等人。对“紫芷”色素成分进行测定，发现芍药苷、飞燕草素、花青素和天竺葵苷是芫荽“紫芷”花青素的主要成分[ 9] .

 

研究表明，花青素极易提取，安全无毒。目前，测定花青素含量的常用方法有pH差法[ 10 ]、高效液相色谱法(HPLC)[ 11 ]、高效液相色谱-质谱法(LC-MS)[ 12 ]等。然而，pH差分法繁琐、耗时且容易出错，而LC-MS/MS法灵敏度较高，但成本较高。高效液相色谱法具有时间短、重现性好、分析精密度高等优点。它已广泛用于黑米[ 13 ]、牡丹[ 14 ]、蓝莓[ 15 ]、花生[ 16 ]等植物]、黑豆 [ 17 ]、樱桃和蔓越莓 [ 18 ]。

 

本研究采用高效液相色谱法分析了3个芫荽杂交品种（芫荽“紫芷”、芫荽“粉泥芷”和芫荽“白子芷”）在5日时花色苷主要成分和含量的变化。不同花期的研究，为茯苓的颜色发育机制和颜色育种提供参考。

 

2。材料和方法

 

2.1。植物材料

 

蔷薇以山东农业大学月季种质苗圃中的蔷薇“紫芝”、蔷薇“芬妮芝”和蔷薇“白子芝”为试验材料。我们在 2017 年 4 月 20 日至 5 月 10 日的晴天早晨采集了萌芽期、初开期、半开期、全开期和萎蔫期的花瓣。在液氮中快速冷冻后，采集的所有样品均在一式三份，放入-80℃冰箱中保存。

 

2.2. 总花青素提取和 HPLC 分析

 

所有样品（0.1 g 鲜重）在液氮中均质化，然后用 5 mL 酸性甲醇溶液（70:0.1:29.9，v/v/v；CH 3 OH:HCl:H 2 O）萃取在 4˚C 黑暗中 24 小时，然后超声处理 30 分钟 [ 19 ] [ 20 ]。离心后，将每种提取物通过膜过滤器（0.22 mm）。

 

花青素的定性和定量分析通过 HPLC 进行。色谱分析采用Prominence LC-20AT系列HPLC系统（日本岛津公司），检测波长为530 nm，柱（TC-C18柱，5 µm，4.6 mm × 250 mm）保持不变在 30°C。洗脱液由水溶液 A（0.1% 甲酸水溶液）和有机溶剂 B（乙腈）组成。梯度洗脱程序如前所述修改 [ 21 ]：0 分钟，10% B；15 分钟，17% B；20 分钟，23% B；25 分钟，23% B；和 30 分钟，10% B。此外，洗脱液流速为 1.0 ml/min，进样量为 10 µL。Cy3G (C 21 H 21 CLO 11 )、Cy3G5G (C 27 H 31 ClO16 ), Pg3G (C 21 H 21 ClO 10 ), Pg3G5G (C 27 H 31 ClO 15 ), Pn3G (C 22 H 23 ClO 11 ), Pn3G5G (C 28 H 33 ClO 16 ), Dp3G (C 21 H 21 ClO ) 12 ) 和 Dp3G5G (C 27 H 31 ClO 17 ) (EXTRASYNTHESE Trading Company, France)用作花青素分析的参考。对每个样品测量三个独立的生物学重复。

 

2.3. 统计分析

 

对每个样品测量了三个独立的生物学重复，数据以平均值±标准误差 (SE) 表示。在适用的情况下，在 LSD 分析中通过学生 t 检验分析数据。P < 0.01 的值被认为具有统计学意义。

 

3. 结果

 

3.1。3个R. rugosa杂交品种花表型分析

 

R. rugosa杂交品种的花表型展示中，从上到下分别为R. rugosa“紫芝”（图1（a））R. rugosa“Fenizhi”（图1（b））和R. rugosa“白子芝” （图 1（C））。R. rugosa“紫芝”的颜色是紫色，是最常见的颜色。随着花朵逐渐开放，颜色稍浅，萎蔫期最浅。R. rugosa“Fenizhi”的颜色是粉红色的，在最初的开放阶段颜色最深。随着花朵逐渐开放，颜色稍浅，萎蔫期花色最浅。R. rugosa“白子芝”的颜色是白色的。在萌芽期和初开期，其花瓣边缘略带粉红色，半开期粉红色消失变白。

 

3.2. 三个芨芨草杂交品种五个开花期花瓣的高效液相色谱法测定

 

结合标准品对530 nm色谱检测到的花青素进行定性和定量分析。R. rugosa“紫芝”中检测到6种花青素（图2（a）），分别是Cy3G5G、Cy3G、Pn3G5G、Pn3G、Pg3G5G和Pg3G。从“紫芷”不同花期（表1）来看，Pn3G5G含量最高，最高为4280.84±20.82 μg·g -1，Pn3G5G占不同花色苷总含量的82.83%。开花期。Cy3G5G含量较高，最高为789.41±1.21 μg·g -1, Cy3G5G 占不同花期花色苷总含量的 13.56%。两种主要花青素含量变化趋势为出芽期>初开期>半开期>全开期>萎蔫期。其他四种花青素含量较低。

 

R. rugosa“粉子芝”中检测到6种花青素（图2（b）），分别是Cy3G5G、Cy3G、Pn3G5G、Pn3G、Pg3G5G和Pg3G。蒺藜不同花期（表2）中Pn3G5G含量最高，最高为1293.50±17.64 μg·g -1，Pn3G5G占不同花色苷总含量的76.93%开花阶段；Cy3G5G含量较高，最高为358.86±3.94 μg·g -1, Cy3G5G 占不同开花期花色苷总含量的 20.03%。两种主要花青素含量变化趋势为初开期>半开期>全开期>萌芽期>萎蔫期。其他四种花青素含量较低。

 

“白子芷”中检测到5种花青素（图2 （c）），分别是Cy3G5G、Pn3G5G、Pn3G、Pg3G5G和Pg3G。从“白子枝”的不同开花期（表3）来看，各期花青素含量较低且基本稳定。其中，Cy3G5G和Pn3G5G在全开阶段达到最大值，分别为1.26±0.01 μg·g -1

 

 

 

图 1。三个 R. rugosa 杂交品种的花表型。(a) R. rugosa“紫芝”的五个不同开花阶段；(b) R. rugosa“粉子芝”五个不同的开花期；(c) R. rugosa“白子枝”的五个不同开花阶段。S1，萌芽期；S2，初始开放阶段；S3，半开阶段；S4，全开阶段；S5，萎蔫期。

 

和 3.39 ± 0.01 μg·g -1，分别。Pg3G5G在初开阶段开始出现，其后含量急剧下降，半开阶段未检测到。Pg3G也出现在开放初期，之后内容基本保持稳定。

 

3个毛茛品种中，藿香“紫芷”和芫荽“粉子芷”中检测到6种花青素，而“白子芷”中仅检测到5种。与其他两个品种相比，R. rugosa“白子枝”中未检测到Cy3G。不同花青素5个开花期品种间的花青素含量比较结果（图3）为“紫芷”>“粉子芷”>“白子芷”。与茯苓“紫芷”和芫荽“粉子芷”相比，茯苓“白子希”中的花青素含量非常低。此外，在三个品种中均未检测到飞燕草中两种花青素的存在。

 

4。讨论

 

R. rugosa“紫芝”选自R. rugosa“Jinyiyurui”和Rosa davarica [ 22 ]的杂交后代。它的灌木直立开放，有淡紫色的树枝。刺直立且稀疏。而且一年可以开花很多次。它是一个

 

 

 

图 2。(a) R. rugosa “Zizhi”、(b) R. rugosa “Fenzizhi”和 (c) R. rugosa “Baizizhi”的 HPLC 色谱图。8种花青素标准品（St.）用于检测：（a）Dp3G5G；(b) Cy3G5G；(c) Dp3G；(d) Pg3G5G；(e) Cy3G；(f) Pn3G5G；(g) Pg3G；(h) Pn3G。

 

 

*数据是三个独立重复的平均值± SE。不同大写字母表示差异显着，采用 LSD 分析计算，P < 0.01 水平。“-”表示未检测到相应的花青素。

 

观赏价值很高的树种，广泛用于园林绿化。R. rugosa“粉子枝”和R. rugosa“白子枝”是R. rugosa“子枝”的两个芽变品种，前者为粉红色，后者为白色。由于茯苓花多为紫色，本研究采用具有普遍代表性的茯苓“紫芝”，然后选取两种不同花色芽品种，分别研究其花青素成分，分析花色差异的原因.

 

3个R. rugosa杂交品种中，R. rugosa“紫芝”颜色最深，呈紫色；R. rugosa“粉子芝”的颜色次之，为粉红色；茯苓“白子芝”颜色最浅，呈白色。例如，Pn3G5G，

 

姓名	阶段	Cy3G	Cy3G5G	PN3G	PN3G5G	PG3G	PG3G5G	DP3G	DP3G5G
R. rugosa “粉子芝”	S1	8.77±0.10℃	358.86 ± 3.94B	4.34±0.07℃	1293.50±17.64A	1.90±0.06℃	27.35±0.28℃	-	-
	S2	17.08±0.13D	712.35±1.94B	13.11±0.12D	2978.92±12.66A	2.53±0.05D	90.63±1.05℃	-	-
	S3	11.70±0.26D	651.82±4.25B	8.27±0.13D	2094.54±5.23A	1.51 ±0.01D	63.81±0.54℃	-	-
	S4	8.53±0.23D	530.40±5.85B	7.17±0.10D	1332.25±7.12A	1.47±0.02D	43.11±0.82℃	-	-
	S5	5.38±0.08DE	124.96±1.81B	9.49±0.01D	1116.41±2.31A	0.80±0.01E	26.41±0.27℃	-	-

表 2。粉紫芷花中花青素含量(μg·g -1 FW)。

姓名	阶段	Cy3G	Cy3G5G	PN3G	PN3G5G	PG3G	PG3G5G	DP3G	DP3G5G
R. rugosa “白子芝”	S1	-	0.57±0.01B	0.38±0.01D	2.36±0.02A	-	-	-	-
	S2	-	0.82±0.01℃	0.23±0.01E	2.02±0.01B	0.65±0.01D	3.07±0.01A	-	-
	S3	-	0.52±0.01B	0.16±0.01E	1.43±0.01A	0.23±0.01D	-	-	-
	S4	-	1.26±0.01B	-	3.39±0.01A	0.27±0.01℃	-	-	-
	S5	-	-	-	2.54±0.01A	0.56±0.01℃	-	-	-

表 3。白子枝花中花青素含量(μg·g -1 FW)。

 

*数据是三个独立重复的平均值± SE。不同大写字母表示差异显着，采用 LSD 分析计算，P < 0.01 水平。“-”表示未检测到相应的花青素。

 

3个杂交品种中花青素含量占优势，以“紫芝”花青素含量最高，达4280.84±20.82 μg∙g -1；茯苓“粉子志”最高含量为1293.50±17.64 μg∙g -1，而“白子志”最高含量仅为3.39±0.01 μg∙g -1. 可以看出，花青素含量与花色呈正相关，花色越深，花青素含量越多。除花青素种类不同外，“白子芷”中没有检测到Cy3G，提示这两个因素可能是“白子芷”颜色的原因。Cy3G 是 Cy3G5 合成的前体。在R. rugosa“白子志”中可以检测到Cy3G5G，但不能检测到Cy3G。可以推测，R. rugosa“白子枝”中的Cy3G在花蕾期之前就已经耗尽，转化为Cy3G5G。张等人。在“紫芷”中检测到飞燕草素，发现其含量基本稳定[ 9] . 然而，我们在三个R. rugosa品种的五个开花期的花青素物种的HPLC测试中没有检测到飞燕草素的存在，这与她的研究结果不一致。

 

花瓣中所含色素的种类和含量以及细胞液的pH值是影响花朵颜色的主要因素[ 23 ]。本研究发现，3个茯苓花瓣中的花青素衍生物主要为二糖苷类，这表明3个茯苓杂交品种中二糖苷类花色苷的结构非常稳定，这与以往的报道[ 24 ][ 25 ]一致。 ] . 此外，本研究发现 R.

 

 

 

图 3。三个蒴果杂交品种五个开花期花青素含量的比较。(a) 萌芽阶段；(b) 初始开放阶段；(c) 半开放阶段；(d) 全面开放阶段；(e) 萎蔫期。误差条代表一式三份反应的 SD。该实验重复了 3 次，每次都产生了相似的结果。

 

rugosa“紫芝”和R. rugosa“粉子芝”含有芍药苷和花青素的衍生物。R. rugosa“紫芝”不同花期，Pn3G5G和Cy3G5G的含量随着花瓣的开放而降低。在“粉子枝”的不同开花期，Pn3G5G和Cy3G5G的含量也随着花色的变化而变化，在开放初期达到最高值，然后逐渐降低。由此可以推断，“紫芷”和“粉子芷”的花色变化主要与Pn3G5G和Cy3G5G含量的变化有关。

 

芫荽“紫芝”和芫荽“粉芷”花瓣中花青素的定量结果表明，大部分花青素在花蕾期和初期的相对含量最高，可以推断，大部分R. rugosa颜色所需的花青素在花蕾期和初期已经充分积累，并逐渐降解。芫荽“紫芷”和芫荽“粉子芷”随着花的开放，花青素的含量随着花的开放而降低。这可能是随着花朵的开放，花瓣逐渐展开，花瓣的受光面积增加，光线影响其稳定性，导致其逐渐降解，导致含量逐渐减少。R. 花瓣中花青素的定量结果。rugosa“白子志”表明Cy3G5G和Pn3G5G在花蕾期合成，在开花期达到最高值。可以推测，这两种花青素可能是蒺藜“白子枝”形成的主要原因。初期合成了两种花青素Pg3G5G和Pg3G。Pg3G5G在合成后迅速耗尽，在半开期检测不到，这可能与“白子枝”半开期花瓣边缘粉红色消失有关。可以推测，Pg3G5G参与了其花瓣粉红色边缘的形成。可以推测，这两种花青素可能是蒺藜“白子枝”形成的主要原因。初期合成了两种花青素Pg3G5G和Pg3G。Pg3G5G在合成后迅速耗尽，在半开期检测不到，这可能与“白子枝”半开期花瓣边缘粉红色消失有关。可以推测，Pg3G5G参与了其花瓣粉红色边缘的形成。可以推测，这两种花青素可能是蒺藜“白子枝”形成的主要原因。初期合成了两种花青素Pg3G5G和Pg3G。Pg3G5G在合成后迅速耗尽，在半开期检测不到，这可能与“白子枝”半开期花瓣边缘粉红色消失有关。可以推测，Pg3G5G参与了其花瓣粉红色边缘的形成。

 

5. 结论

 

综上所述，在本研究中，我们分析了3个R. rugosa杂交品种不同开花期花色苷种类和含量的差异，推测花色苷含量低和Cy3G的缺乏可能是花色的原因。茯苓“白子志”代。此外，推测Pn3G5G和Cy3G5G的含量差异是R. rugosa“紫芝”和R. rugosa“粉紫芝”颜色的主要原因。通过以上分析，我们初步确定了3个毛茛杂交品种（毛茛“紫芝”、芫荽“粉子芷”和芨芨草“白子芷”）颜色差异的直接原因。希望这将为 R. rugosa 的后续颜色改进项目提供必要的信息。

 

笔记

 

#这些作者的贡献相同。

 

利益冲突

 

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

 

参考

 

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