摘要:传染性支气管炎 (IB) 是商业家禽的高度传染性疾病,通过在肉鸡中生产劣质肉并影响种鸡的生产,造成巨大的经济损失。据报道,即使在用多变种株疫苗免疫后,病原体也是其他感染因子中最危险的病原体。目前,不同的菌株,如 H-120、4/91 和 D274 已被广泛用于巴基斯坦各地的速发型菌株的免疫预防,但报道的保护作用很小。在目前的研究中,PCR 分析用于调查 2016 年巴基斯坦旁遮普省和信德省 IB 分离株的分子性质。考虑在 10 日龄鸡胚蛋中接种总共 100 个气管样本进行病毒接种。IBV感染的羊水用H-120、4/91和D274株的单克隆抗血清中和。对 IBV 筛选的样品进行 RNA 提取,然后使用每种菌株的类型特异性引物进行 PCR。通过Sanger测序对840 bp的扩增产物进行测序。根据 PCR 结果,从两个区域获得了四个相似的扩增产物,在琼脂糖凝胶电泳中显示出相似性,但它们在核苷酸序列的基础上彼此不同。系统发育分析表明,卡拉奇分离株的核苷酸序列与 IBV H-120、Mass-41 和 Connecticut 46 参考菌株相似。而来自旁遮普省的分离株与 Mans-2、Mans-3、9/41(UK) 相似,但与其他参考菌株没有显着相似性。所以,
关键词
传染性 支气管炎 病毒, S1 糖蛋白,聚合酶 链式 反应,病毒 中和 试验,分子 进化 遗传学 分析
一、简介
传染性支气管炎 (IB) 是一种高度传染性的呼吸道疾病,其特征是家禽和野生鸟类的呼吸道、消化道、生殖和肾脏感染 [ 1] . 它在任何年龄都会袭击鸡群,但年轻的鸡群被认为更容易感染这种疾病。该病临床表现为气管啰音、流鼻涕和打喷嚏、咳嗽、体重减轻、鼻窦炎、饮水量增加、抑郁、嗜睡和肉鸡生长不良。与肉鸡相比,禽传染性支气管炎在蛋鸡和种鸡中更为重要,因为它会导致产蛋量大幅下降,有时可能会损害输卵管,导致产蛋量永久丧失。在生殖损伤的情况下,病原体驻留在输卵管中,影响鸡蛋的内部和外部质量,例如粗糙、畸形的鸡蛋在鸡蛋表面带有颈圈,出现稀薄的水样和混合的内部内容物 [ 2 ] [ 3 ] [4 ] [ 5 ]。Schalk 和 Hawn 的第一份 IB 报告提到了 1931 年美国北达科他州出现呼吸道症状的幼鸡的一种高度传染性疾病 [ 6 ]。该疾病也被称为由传染性支气管炎病毒 (IBV) [ 7 ] 引起的幼鸡传染性支气管炎。病原体是有包膜的冠状病毒,属于冠状病毒科的单链RNA病毒。
此后至今,世界各地已检测到多种不同的 IBV 血清型和基因型,造成严重的经济损失[ 8 ]。尽管广泛使用减毒活疫苗和灭活疫苗,IB 仍对家禽业造成严重的经济损失。IB 仍然是韩国和世界许多其他国家最重要的家禽疾病之一。世界范围内已鉴定出多种 IBV 血清型,其中一些血清型无法通过异源血清型疫苗进行控制 [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]。
IB 是主要问题之一,在环境中存在许多变体,使得疫苗接种在所有年龄组和物种中都无效。病原体分为两种主要类型,经典菌株和变异菌株。两种菌株类别彼此差异很大,以至于针对一种菌株产生的抗体在接种疫苗后不会对另一种菌株产生交叉保护作用[ 12 ][ 13 ]。
IB病毒具有根据周围环境改变其遗传结构的潜力。诱导遗传变异的能力最终将帮助病毒逃避免疫反应并导致接种疫苗的鸡群爆发。遗传变异的产生被认为是由 IBV 的刺突 (S) 糖蛋白中的一些氨基酸变化引起的 [ 14] . 病毒的刺突 (S) 本质上是一种糖蛋白,将 S 蛋白锚定到病毒体的脂质双层中,在疾病发病机制中起关键作用。IBV S基因由1162个氨基酸组成,被切割成两个亚基,N端S1亚基(535个氨基酸)和C端S2亚基(627个氨基酸)。S1 亚基包含病毒中和和血清型特异性抗原决定簇,它们负责与宿主细胞结合、中和和免疫反应 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]。
为防止肉鸡、种鸡和蛋鸡感染 IB,疫苗接种计划中已包括 IB 变种,如马萨诸塞-41 (M-41)、H-120 和 D-274。然而,即使在鸡群的常规监测过程中过度接种疫苗和严格的生物安全措施后,这个问题仍然存在。还观察到未接种疫苗的鸡群中的高抗体滴度 (8.7%) 也是针对 M-41 菌株的抗体 [ 19 ],这表明巴基斯坦存在这种和可能的其他 IBV 菌株。
目前的研究是在巴基斯坦旁遮普省和信德省不同地区的分子进化遗传学分析 (MEGA) 的基础上调查流行的 IB 速发菌株。此外,目前的研究结果将有助于家禽养殖者选择合适的疫苗株,以在各自地区对IB病毒进行有效的免疫预防。
2。材料和方法
2.1。鸡胚蛋
从位于拉合尔 Raiwind 路的 Big Bird Poultry 育种公司购买 10 天龄的 100 个鸡胚。用 pyodine-乙醇 (10%) 溶液对鸡蛋的外表面进行消毒,然后转移到 37˚C 的培养箱中,直到接种病毒。
2.2. 病毒和抗血清
在 2016 年爆发期间,从旁遮普邦的拉合尔、卡苏尔、Sheikhupura 和 Gujranwala 区以及巴基斯坦卡拉奇的 Dhabeji 地区的高速公路和 Surjani 镇分离出感染性支气管炎的肉鸡的肺和气管。用感染性支气管炎病毒感染的粘膜提取无菌咽拭子的帮助。将拭子悬浮在 3 ml 无菌生理盐水(0.85% NaCl 溶液)中。将悬浮液彻底打散并以 3000 rpm 离心 10 分钟。将上清液通过0.5微米大小的注射器过滤器,单剂量0.1毫升通过尿囊途径接种到鸡胚中,并在37℃孵育72小时。收获的受 IBV 感染的羊膜尿囊液保存在 -80˚C 以供进一步研究。
2.3. 病毒中和测试 (VNT)
将等浓度 (50 ul) 的每种分离物与已知的抗血清混合并接种到 10 日龄的鸡胚中,然后在 37˚C 下孵育 72 小时。卵被单独收获,剩余的液体随后按照 Hofsad [ 20 ] 的描述进行 RT-PCR。
2.4. RNA提取
如[ 21 ]所述,从包括阳性对照在内的12个分离物中分离出病毒RNA。简而言之,将十二烷基硫酸钠(Merck-USA)(最终浓度 20% [w:v] 和蛋白酶 K(Bio world)(最终浓度 250 µg/ml)添加到尿囊液中,在 56˚C 下孵育 5 分钟30 分钟后加入 400 µl 苯酚氯仿 (100%) 异戊醇 (100%) (Thermo Fisher-USA)。混合物以 14,000 rpm 离心,沉淀物与 100 µl 乙醇 (Sigma-Aldrich USA) 混合(80%). 分离后的 RNA 重新悬浮在 40 µl 蒸馏水中,并在-50˚C下储存,直到进行 RT-PCR 分析。
2.5. 使用一步法 RT-PCR 对 IBV 进行分子检测
如[ 21 ]所述,从包括阳性对照在内的12个分离物中分离出病毒RNA。RT 反应包含 4 µl 10× PCR 缓冲液、2 µl 10 mM dNTP (Merck-USA)、1 µl 正向和反向寡核苷酸、1.5 µl 80 mM Mgcl 2 (Merck-USA) 和 9 µl RNA 溶液。加入 3 µl 无菌蒸馏水,得到总共 20 µl 反应体积。所有样品的预混液都是在不混合病毒株 RNA 的情况下制备的。将等体积 (11 µl) 的预混液加入 0.2 ml PCR 管中,将相关 RNA 混合到各自的管中,并在 42°C 下孵育 60 分钟,然后在热循环仪(ABS-美国)。
将制备的样品 cDNA 进行所需 S1 糖蛋白基因的 PCR 扩增。对于 PCR 反应,3 ul 10× PCR 缓冲液,0.5 µl 每个正向引物 ('5-CTTTTGGCACTATGTAGTGC-3') 和反向引物 ('5-ATTAGTAAAAGGYTAYAAGCCATCTG-3'),3.5 µl 80 mM MgCl 2和 1 µl Taq DNA 聚合酶 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.) 加入反应混合物中。通过添加 13 µl 无菌无核酸酶水获得反应体积。在不添加病毒株的 cDNA 和反向引物的情况下制备主混合物。将等体积 (19.5 µl) 的预混液加入 0.2 ml PCR 管中。将 5 µl 相关 cDNA、正向和反向引物混合并添加到相关试管中。将试管在热循环仪(Applied Biosystems)中孵育,在 95°C 初始变性 2 分钟,然后孵育,在 95°C 变性 30 秒,30 个循环,在 51°C 退火 30 秒,在 72°C 延伸˚C 45 秒。最终聚合在 72°C 下进行 5 分钟。
2.6. 电泳
在 1% 琼脂糖 (Bio world-USA) 凝胶中分析 PCR 产物。在 100 伏特下进行 50 分钟的电泳,并使用紫外线透射仪观察 PCR 产物和 100 bp 梯。
2.7. DNA测序
本研究采用 Sanger 测序(链终止法)方法进行 DNA 测序。通过使用分子进化遗传学分析 (MEGA) 软件版本 7.0 [ 22 ] 分析测序数据。
3. 结果
使用从本研究中使用的所有参考菌株中的刺突基因的保守区域设计的特异性引物,扩增了 840 bp 刺突糖蛋白 (S1) 的扩增子大小。共有53份样本经HA及病毒中和试验检测IBV抗体,其中43份呈阳性。表 1显示了 10 个用 HI 和 VNT 鉴定的样品的结果。
该测定通过使用类似的方案检测经典菌株和变异菌株。序列分析数据显示,接近 IBV 变体的不同大小的扩增子是由于不同位点的缺失所致。分子进化基因组分析(MEGA-ABI3730XL)用于比较测试样品和参考菌株。
3.1。IBV的刺突基因序列(信德省)
.
编号 | 隔离指定 |
鉴别方法 HI 和 VNT |
基因型相似性 |
1 | (鸡/Op-KRI/H120/16) | H120 | 经典的 |
2 | (鸡/Op-KRI/H120/16) | H120 | 经典的 |
3 | (鸡/Op-KRI/4/91/16) | 4/91 | 疫苗 |
4 | (鸡/Op-KRI/D274/16) | D274 | 疫苗 |
5 | (鸡/Op-KRI/D274/16) | D274 | 疫苗 |
6 | (鸡/Op-LHR/LH120/16) | H120 | 疫苗 |
7 | (鸡/Op-LHR/H120/16) | H120 | 疫苗 |
8 | (鸡/Op-LHR/H120/16) | H120 | 疫苗 |
9 | (鸡/Op-LHR/4/91/16) | 4/91 | 变体 |
10 | (鸡/Op-LHR/4/91/16) | 4/91 | 变体 |
表 1。根据结果中的 PCR、VNT 和核苷酸测序分离相似性。
3.2. IBV的刺突基因序列(旁遮普)
TCTTAGTGTACTACTACCAAAGCGCCTTTAGGCCACCTACTGGTTGGCATTTACATGGAGGTGCTTATGCCGTAGTAAATGTTTCTGAGCAAAATAGTACTGTTACTGGATCAGAATGTACTACGGGTATTATTAGTGGTGGTTACACTTTTAATGCTTCATCTGTAGCTATGACAGCACCATCTTTAGGTATGACTTGGTCTAAGATGCAGTTTTGCACGGCTTATTGTAACTTCTCTGATATTACAGTGTTTGTTACGCATTGTTATGCAAGCGGGGTTGGTAAATGCCCTTTAACAGGCCTTATTCAACAGAGTCACATTCGCATTTCTGCTATGAGAAATGGTACTTTGTTTTATAATGCTACAGTTAGTACAAATAAGTATCCCAGATTTAAGTCACTTCAATGTGTGGATAATTTCACATCTGTTTATTTAAATGGTGATCTTGTTTTTACTAGTAATCATACTATTATAGTTAAAGAAGCAGGTGTGTACTTTAAAGGGGGT.
由于 S1 糖蛋白基因不同位置的核苷酸突变、缺失和添加,序列比对结果显示了两条不同的序列。与来自旁遮普省的样本相比,来自信德省的样本具有更多数量的序列变异。参照登录号 EU822341 报告的序列,在碱基位置 83 和 94 处存在“A”缺失。在包括来自巴基斯坦信德省的 IBV 毒株在内的所有经典型毒株中都观察到了从位置 358 到 363 的六个碱基的缺失。与参考序列相比,巴基斯坦旁遮普省流行的 IBV 毒株几乎没有缺失。与研究中包括的 IBV 变体菌株的共有序列相比,发现了第 177、178 和 179 位核苷酸的缺失。图 1和图 2。
图 1。色谱图 IB 核苷酸在测序中的特异性。
在旁遮普省流行的毒株与 IBV 的 QX 和 4/91 毒株有关。该技术用于通过利用分子进化遗传学分析(MEGA)的计算工具来构建系统发育树。如图 3所示,基于序列从信德省分离的菌株与参考菌株的相似性主要与经典 IBV 相关。
图 2。来自不同本地分离株的 S1 糖蛋白基因的多序列比对,包括经典和变异参考菌株。
图 3。系统发育树显示有关 IBV 经典和变体的各种关联和联系。
4。讨论
本研究旨在监测巴基斯坦商品鸡传染性支气管炎的发病率。这种疾病对巴基斯坦 [ 19 ] 和全球 [ 8 ]的家禽生产者具有重大的经济影响。IBV 病毒也有多种血清型。在 IBV 中,全世界已鉴定出 20 多种菌株 [ 23 ]。这些新菌株的出现是由于快速重组、插入、缺失或点突变事件主要发生在 S1(刺突蛋白基因)基因中,导致马萨诸塞州和阿肯色州 IBV 菌株的产生 [ 24 ]。
如今,基于 PCR 的 IBV 诊断在诊断技术中也很常见。流行中流行的田间毒株的特征对于确定 IBV 暴露区域的疫苗接种策略是必要的。许多疫苗株如 M-41、H120、W93、H52 和 4/91 被广泛使用,但它们不能诱导针对 IBV 的有效免疫反应 [ 25] . 因此,本研究的设计重点是通过对部分 Spike 糖蛋白基因进行测序来验证诊断和进一步鉴定 IBV 菌株的分子方法。现场样品被检测为 IBV 阳性,产生 840 bp 的扩增片段,并通过对致病性基因“Spike 基因”进行测序进一步分配给特定菌株。通过分析 Spike 基因的序列,推荐 IBV 的分子特征。RT-PCR 产物循环测序在许多国家被用于鉴定 IBV 的田间毒株 [ 26 ]。为了快速识别 IBV,已经对 RT-PCR 进行了改进 [ 27] . 在靶向 Spike 蛋白基因的部分 S1 亚基时,S1 亚基包含具有在短时间内快速突变的趋势的超可变单元。仅分析 Spike 蛋白的 S1 亚基的方法足以确定 IBV 的菌株。然而,在目前的研究中,所研究的刺突蛋白区域也增加了 S2 亚基的部分序列,以便确定该区域中具有 IBV 特征的序列变异。
根据系统发育树和突变缺失模式,从旁遮普省分离的IBV毒株刺突蛋白基因(S1糖蛋白)属于变异型。系统发育树中发现的相邻毒株分别为登录号AF193423.1、JN192154.1、GQ281656.1、AY279533.1、JX173489.1,均属于IBV变异毒株。目前的研究结果证实了 Rafique 的发现,他发现从巴基斯坦分离的 IBV 菌株与 IBV 4/91 具有最大的核苷酸同源性 [ 28] . 在巴基斯坦旁遮普地区发现的 IBV 毒株与参考序列(登录号 JX173489.1 和 EU780077.2)略有不同。当前研究的结果与已报道的序列(登录号 KF856873.1、GQ281656.1 和 AY279533.1)一致。这种变异模式赋予了该地区流行的菌株具有独特的身份,虽然位于变异组中,但序列模式略有改变。
在巴基斯坦信德省发现的菌株属于 IBV 经典菌株群。系统发育树中参考数据的相邻菌株为登录号EU82234.1、KF188436.1、DQ001334.1、AJ311317.1和FJ90471641,均属于IBV经典菌株。结果与 Ahmed 的观察结果部分一致,他观察到巴基斯坦的商业肉鸡和蛋鸡鸡群对 M-41 (88%) 和 4/91 (8%) 菌株呈血清反应阳性 [ 29 ]。
血凝和病毒中和试验已常规用于不同流行病中IBV的诊断[ 29 ]。然而,由于通过针对病毒产生的IgG间接检测病毒的现象,这些技术不能准确地诊断疾病。要检测的 IgG 的交叉反应性是解释实际结果的另一个问题。相比之下,这项研究通过直接检测病毒基因组的存在与否来验证病毒的诊断。
有效的疫苗接种策略需要对流行的 IBV 毒株进行准确和真实的分析,无论是经典型还是变异型 [ 30 ]。刺突蛋白基因中的突变或缺失模式赋予菌株经典或变异的身份。目前的结果可以帮助商业农民在确认各自地区流行毒株(变种)的基础上设计疫苗策略,以有效地免疫预防 IB 病毒。此外,这项研究还可以为进一步研究该疾病的分子模式提供基础,这将在不久的将来确定针对病毒性疾病的分子诊断和免疫预防策略。
五、结论与建议
在巴基斯坦不同地区使用疫苗株进行有效的免疫预防应与本土野生禽 IBV 株同源。分离株的系统发育分析表明,从巴基斯坦信德省和旁遮普省回收的IBV毒株分子序列分别与IBV毒株H120和IBV 4/91非常相似。在疫苗中使用适当的同源毒株是针对 IB 病毒的鸟类保护性免疫预防的先决条件。抗体中和部分 IB 抗原的分子分析显示,在巴基斯坦信德省和旁遮普省仅存在两种菌株。然而,有许多疫苗血清型 M-41、H120、W93、H52 和 4/91 被用于商业家禽中针对 IBV 的免疫预防,但尽管有抗 IBV 体液反应,但并未提供保护。目前的研究探讨了 IBV 疫苗失败的原因,因为每种毒株中的 S1 糖蛋白诱导了特异性中和抗体。因此,建议根据当地流行的野生型IBV毒株选择有效免疫的疫苗。
致谢
这篇论文的作者非常感谢 Ottoman Pharma(免疫部门)的所有者 Usman Farooq Khalid 先生提供财政支持、分离感染支气管炎病毒和实验室设施,以便为家禽业的最大利益开展研究。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
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