摘要：本研究的目的是评估在体外获能精子培养基 (IVCSM) 中添加牛至提取物的效果。 本研究调查了不同浓度（分别为 0.3、0.6、1.2 μg/ml 和 25.0、50.0、100.0 μg/ml）的欧芹提取物在IVCSM中的抗氧化和抗菌作用。当添加O. vulgare提取物作为抗氧化剂来源 (1.2 μg/ml)时，发现精液质量参数（例如总活力、活精子和活获能精子）显着提高。用O. vulgare治疗精子以最高浓度 (100 μg/ml) 提取 2 小时，不使用抗生素改善精子特征。综上所述，在获能培养基中用普通小麦提取物培养精子对公羊精子的特性具有有益的影响。
关键词
羊,精子,牛至,体外
一、简介
在全球范围内，绵羊是重要的牲畜，提供动物蛋白和牛奶，这对于它们满足人类营养需求和提供粮食安全的能力至关重要。因此，有必要使用适当的现代技术（包括体外胚胎生产 (IVEP) 技术）来提高生产力。未来，IVP 系统可以通过加速绵羊育种和增强生产效能，在绵羊生产中发挥关键作用 [ 1 ]。体外胚胎生产是一个多步骤过程，包括：1) 卵母细胞的体外成熟 (IVM)，2) 体外受精 (IVF)，和 3) 受精卵的体外培养 (IVC) 直至囊胚期 [ 2] . 除了 IVP 技术在绵羊育种中的潜在用途外，胚胎还需要用于克隆和转基因动物生产等其他目的 [ 3 ]。尽管IVP领域取得了实质性进展，但体外胚胎发育率仍低于体内[ 4 ] [ 5 ]。
Mahfouz 等人。(2010) [ 6 ] 证明，精子膜的质量（运动性、活力）和功能完整性在处理过程中都会逐渐下降。众所周知，在精子获能过程中会产生活性氧 (ROS) [ 7 ] [ 8 ]。Evans 和 Maxwell, (1987) [ 9 ] 表明公羊精子细胞膜易受 ROS 引起的氧化损伤，因为它们含有大量的多不饱和脂肪酸。Lamirande 和 Flaherty (2012) [ 10 ] 表明过量的 ROS 会影响精子的遗传和功能完整性。氧化应激 (OS) 导致精子质量和受精率降低 [ 9 ] [ 11]，降低精子活力 [ 12 ] 并降低新陈代谢活动、寿命和活力 [ 13 ]。许多不同的抗氧化剂来源已使体外精子免受 OS 的风险[ 14 ]。
在最近的研究中，不同的植物提取物被用于提高公羊精液质量 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]。体外的高氧浓度会导致 ROS 生成升高，进而导致 OS 升高 [ 18 ]。事实上，高水平的 ROS 通过破坏线粒体膜导致细胞色素的释放和蛋白水解酶级联的激活而导致脱氧核糖核酸损伤 [ 19 ]。最近，Kitagawa 等人。(2004) [ 20 ] 和 Rocha-Frigoni 等人。(2016) [ 21]证实IVP期间活性氧（ROS）水平的增加会诱导胚胎细胞发生氧化应激，导致胚胎发育较弱和胚胎无法存活。有许多研究表明，具有高抗氧化活性的香料和草药已被用于精液加工 [ 22 ] [ 23 ]。
O. vulgare 是唇形科 (Labiatae) [ 24 ]植物科的成员。O. vulgare L. 被广泛认为是一种健康和美味的草本植物，含有大量的药用活性化合物，以及酚苷、黄酮类化合物、单宁、甾醇和大量的萜类化合物 [ 25 ]。O. vulgare 是产生天然抗氧化剂的首选香料植物 [ 26 ]。先前的研究表明，O. vulgare 具有重要的化学和生物活性，包括抗菌、抗真菌和抗基因毒性作用 [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32] . 此外，最近的几项研究表明，O. vulgare 是用于治疗许多疾病的最重要的药用植物之一，因为它富含矿物质和维生素，并且含有高比例的植物雌激素 [ 33 ] [ 34 ]。Sedigheh 等人。(2015) [ 35 ] 研究了 O. vulgare、促黄体激素释放激素 (LHRH)-A2 和 estradiol-17β 对未成熟毛腹毛螟的促性腺激素细胞超微结构和卵巢卵子发生的影响，发现用O. vulgare 雌二醇 17β 处理后。此外，O. vulgare 提取物影响怀孕大鼠的早期胚胎阶段 [ 36] . 此外，使用 O. vulgare 作为膳食补充剂可以提高母猪的繁殖能力 [ 37 ]。在植入前对小鼠胚胎进行体内处理时，用高剂量的 O. vulgare 提取物未显示出毒性作用 [ 38 ]。卢诺等人。(2014) [ 39 ] 还使用 O. vulgare 提取物作为公猪精子冷冻保存中的抗氧化剂来源，发现它对改善精子功能、受精能力、防止冷冻公猪精子的脂质过氧化和 DNA 氧化具有有益作用。
没有关于在羊精子体外获能精子培养基 (IVCSM) 中使用 O. vulgare 提取物作为抗氧化剂和抗菌剂来源的报道。因此，这项研究是第一份研究 O. vulgare 在补充获能培养基中对绵羊精子的影响的报告。
2。材料和方法
2.1。化学品和试剂
本研究中使用的所有化学品均购自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。无菌塑料培养皿和 Millipore 膜过滤器注射器购自 Nunclon, Nalge Nunc International, Roskide, Denmark。
2.2. 实验设计
用双蒸水 (1 mg/ml) 稀释 O. vulgare 储备溶液，并在 4°C 下储存直至使用。将O. vulgare 提取物以不同浓度添加到精子获能培养基中。因此，从肥沃的健康公羊中采集新鲜精液，并分为六个治疗组和一个对照组，指定为第一组 (G1)。在前三个处理组（G2、G3 和 G4）中加入不同浓度（0.3、0.6 和 1.2 μg/ml）的 O. vulgare 提取物作为抗氧化剂来源，以及更高浓度（25.0、50.0、和 100.0 μg/ml) 被添加到其他三个治疗组（G5、G6 和 G7）中，以评估其作为抗菌剂的用途。
2.3. O. vulgare 提取物的制备
开花的 O. vulgare 植物（图 1）是从沙特阿拉伯的麦地那收集的。植物材料的分类学鉴定由高级植物分类学家（沙特阿拉伯利雅得沙特国王大学植物标本室部的 Mona Al Wahaibi 博士）确认。根据 Braho 等人的方法制备提取物。（2013 年）[ 40 ]。将获得的提取物保存在无菌样品管中，并在 -20°C 下储存直至使用。
2.4. 精子获能
从确认有生育能力的公羊中收集新鲜精液。对于体外获能，精子在 38.5˚C 下用 5% CO 2加湿空气在 Brackett 和 Oliphant (BO) 培养基 [ 41 ]中孵育 2 小时，如实验设计所示。获能后，使用苯胺黑-伊红染色评估精子。对每种处理的精子计数死/活和获能/非获能精子。这种方法是基于死精子的膜通透性增加，导致头部部分或完全紫色染色，而活精子的低通透性排除了伊红，因此它们的头部保持白色 [ 42] 精子分为以下四类（图2）：
1）活获能精子（LCS）——淡玫瑰色的顶体后区和白色的“顶体区”。
2）活未获能精子（LUCS）——整个精子头部呈淡白色，有顶体区。
图 1。从田间采集后的野生马郁兰 (O. vulgare) 植物。
图 2。不同类型的精子在培养基中体外获能后补充 O. vulgare 提取物。
3) 死获能精子(DCS)——顶体后部呈黑色，顶体呈粉红色。
4) 死亡的未获能精子（DUCS）——顶体后的深色区域带有顶体区域。
2.5. 统计分析
在不同的日子进行实验的重复。使用 IBM SPSS 统计程序 for windows，版本 23.0（IBM 公司。Armonk，NY，USA）将所有数据的统计分析作为完全随机设计进行分析。使用单向方差分析（One Way ANOVA）对组进行比较。通过使用邓肯的多重范围检验，在 P ≤ 0.05 水平上认为统计学差异显着。结果表示为平均值±SEM（平均值的标准误差）。
3. 结果
3.1。O. vulgare 提取物作为抗氧化剂对绵羊精子体外获能的影响
所有处理产生显着不同的活、死、活未获能、死获能和精子活力参数（表1）。在精子获能培养基中用 1.2 µg/ml O. vulgare 提取物处理，活的、活获能的、活的未获能的和最能运动的绵羊精子的比率最高，其次是 0.6 µg/ml 处理。如表 1所示，相同浓度还给出了死、死获能和死未获能精子的最低平均值。
3.2. O. vulgare 提取物浓度作为抗菌剂对绵羊精子体外获能的影响
在补充有不同浓度的普通野草提取物的获能培养基中孵育 2 小时后的精子活力、活力和获能如表 2所示。活精子 (269.00 ± 2.309) 和活获能 (127.67 ± 1.453) 精子的平均数和活动精子的百分比 (90.00 ±
|
性状 团体 |
居住 （％） | 死的 （％） | 活容量 (%) | 活无能力 (%) | 死电容 (%) | 无能力死亡 (%) | 运动性 (%) |
| 控制 (GI) |
161.67 ± 4.91一个 (53.89) |
138.33 ± 4.91天 (46.11) |
75.00 ± 2.89一个 (25) |
86.67 ± 2.03一个 (28.89) |
123.33 ± 2.03天 (41.11) |
15.00 ± 2.89抗体 (5) |
25.00 ± 0.00一个 (25) |
| 0.3 µg/ml (G II) |
174.00 ± 0.58 b (58) |
126.00±0.58 ℃ (42) |
80.00 ± 2.89一个 (26.67) |
94.00 ± 2.31 b (31.33) |
106.33±3.76 ℃ (35.44) |
19.67 ± 3.18 b (6.5) |
32.67 ± 1.45 b (32.67) |
| 0.6 µg/ml (G III) |
188.00±1.73 ℃ (62.76) |
112.00 ± 1.73 b (37.33) |
89.00 ± 2.31 b (29.67) |
99.00 ± 0.58 b (33) |
94.33 ± 3.18 b (31.44) |
17.67 ± 1.45 b (5.89) |
40.00 ± 0.00公元前 (40) |
| 1.2 微克/毫升 (G IV) |
213.67 ± 0.88天 (71.22) |
86.33 ± 0.88一个 (28.78) |
107.00±1.12 ℃ (35.67) |
106.67±2.03 ℃ (35.56) |
80.33 ± 2.60一个 (26.68) |
6.00 ± 3.46一个 (2) |
47.33 ± 1.45天 (47.33) |
表 1。不同浓度的 O. vulgare 作为抗氧化剂对绵羊精子体外获能的影响（平均值±SEM）。
|
性状 团体 |
居住 (%) |
死的 (%) |
活容量 (%) | 活无能力 (%) | 死电容 (%) | 无能力死亡 (%) | 运动性 (%) |
| 控制 (GI) |
161.67 ± 4.91一个 (53.89) |
138.33 ± 4.91天 (46.11) |
75.00 ± 2.89一个 (25) |
86.67 ± 2.03一个 (28.89) |
123.33 ± 2.03天 (41.11) |
15.00 ± 2.89天 (5) |
25.00 ± 0.00一个 (25) |
|
25 微克/毫升 （二） |
226.33 ± 4.91 b (75.44) |
73.67±4.91 ℃ (24.56) |
107.33 ± 4.33 b (35.78) |
119.00 ± 58 b (39.67) |
65.00 ± 2.89摄氏度 (21.67) |
8.67±2.03 ℃ (2.89) |
65.00 ± 0.00 b (65) |
|
50微克/毫升 （三） |
241.67±4.91 ℃ (80.56) |
58.67 ± 4.91 b (19.44) |
110.00 ± 5.77 b (36.67) |
131.67±0.88 ℃ (43.89) |
50.67 ± 3.48 b (16.89)` |
7.67 ± 1.45 b (2.56) |
72.67±1.45 ℃ (72.67) |
|
100 微克/毫升 （四） |
269.00 ± 2.31天 (89.67) |
31.00 ± 2.31一个 (10.33) |
127.67±1.45 ℃ (42.56) |
141.33 ± 0.88天 (47.11) |
27.00 ± 1.73一个 (9) |
4.00 ± 0.58一个 (1.33) |
90.00 ± 0.00天 (90) |
表 2。O. vulgare 提取物浓度作为抗菌源对绵羊精子体外获能的影响（平均值±SEM）。
*具有不同上标（a、b、c、d）的相同列中的平均值在 p ≤ 0.05 时差异显着。
0.000) 在 IV 组 (100 µg/ml) 中显着高于其他组，而死亡和死获能精子的平均数（分别为 31.00 ± 2.309 和 27.00 ± 1.732）显着降低。然而，在表 2处理之间，死亡的未获能精子数量没有显着差异。
4。讨论
健康的胚胎需要优质的卵母细胞[ 1 ]。培养系统中遇到的三个关键问题是未成熟卵母细胞的内在质量 [ 43 ] 氧化应激 [ 44 ] 和不合格的培养基 [ 45 ]。我们不知道任何关于在 IVCSM 中添加 O. vulgare 提取物对绵羊精子的影响的报道。我们的研究结果表明，在获能培养基中添加 O. vulgare 提取物对精子质量参数有积极影响，包括绵羊精子的活力、活力和获能（顶体完整性）。精子细胞获能过程中会发生各种细胞变化，包括腺苷酸环化酶的激活增加 cAMP 浓度，Ca 2+的流入 离子和活性氧 (ROS) [ 7 ] [ 10 ] 的产生。细胞膜内的高不饱和脂肪酸含量以及精浆的低抗氧化能力使得公猪精子对活性氧的有害影响特别敏感[ 46 ][ 47 ]。极端 ROS 导致脂质过氧化 [ 48 ] 导致运动性和活力丧失、精子 DNA 损伤、卵母细胞渗透不足和精子-卵母细胞融合 [ 49 ] [ 50 ]。添加了各种成分作为补充剂，以维持运动和受精能力，并保持精子膜的完整性 [ 51 ] [52 ] [ 53 ] [ 54 ] 这些成分具有抗氧化活性，还可以减少氧化过程 [ 55 ]。我们已经表明，作为抗氧化剂来源添加 O. vulgare 提取物对精子质量参数有积极影响，增加它们的活力、活力和活获能精子的数量。O. vulgare 的甲醇提取物富含酚类物质，它们占提取物的 22%，以及酚酸，例如迷迭香酸和多酚，以及其他化学物质，例如类黄酮 [ 56 ]。张等人。(2014) [ 57] 从 O. vulgare 中分离出 21 种酚类化合物。这些成分具有抗氧化活性，可作为自由基清除剂和金属螯合剂[ 58 ]。我们的结果得到了在补充提取物作为抗氧化剂后对公羊精子质量的几项研究结果的支持。莫特拉格等人。(2014) [ 16 ] 证明，在解冻后的公羊精子上添加 2%、4%、6% 和 8% 浓度的迷迭香水提取物对解冻后的公羊精子特性具有有用的影响。此外，添加 10 mg/L 的山茶提取物可提高冷冻保存超过 5 或 15 mg/L 的公羊精液的解冻后质量 [ 17] . 在绵羊精液补充剂中添加不同浓度的丁香提取物（0、35、75 和 115 μg/ml）对精液特性有有益的影响，其中 75 μg/ml 的提取物效果最好 [ 59 ]。我们的研究结果表明，用高浓度（100 μg/ml）的 O. vulgare 提取物处理绵羊精子改善了各种精子参数，这些发现与先前关于在公羊精液中添加抗氧化剂、添加迷迭香酸的研究一致(RA) 在乳糖-蛋黄缓冲液中冷冻保存的精子提高了公猪精子的解冻后质量和它们使卵母细胞受精的能力，并且在更高的浓度 (105 μM/ml) 下，穿透率提高了 [ 39 ]。此外，Malo 等人。(2012) [ 60] 发现在乳糖-蛋黄补充剂中使用高浓度的茴香提取物可以显着提高总精子活力和活力。提取物的浓度因影响提取物功效的因素不同而不同，例如植物来源、采集季节、气温、pH、溶剂类型和提取方法[ 61 ]。因此，需要进一步的研究来确定 O. vulgare 提取物中的活性化合物以及它们的哪些功能是其对精子的有益作用的原因。在精液采集过程中，很难避免包皮上的腐生细菌或周围环境中的细菌污染 [ 62 ] [ 63 ] [ 64] . Otter, (2008) [ 65 ] 从疑似不育的公羊精液样本中分离出细菌。由于粘附和凝集 [ 66 ] [ 67 ] 或通过诱导精子中段、膜和顶体的结构变化 [ 68 ] ，发现大肠杆菌对精子细胞运动有影响。几种抗生素，特别是链霉素和青霉素被添加到精液稀释剂中以控制细菌生长[ 69] . 本研究结果表明，不同浓度欧芹提取物的新鲜公羊精液顶体膜的活力、活力和完整性均显着高于对照组。水和乙醇 O. vulgare 叶提取物具有免疫刺激、细胞毒性、抗菌和抗氧化特性 [ 70 ]。根据我们的结果，O. vulgare 提取物也可能是一种很好的替代抗生素，可包含在体外胚胎生产系统的培养基中，尽管它对绵羊精子的影响需要更全面的评估。
5. 结论
在绵羊精子的成熟培养基中添加普通小麦提取物导致活精子数量增加以及获能精子数量增加。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
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