摘要:谷氨酸脱氢酶通过合成基于非遗传密码的 RNA 来调节作物发育、生长和生物量产量。了解 GDH 合成 RNA 酶的机制将增强超过 10 亿城市园丁、小农和资源有限的土著农民的农业创新能力。通过用矿物盐溶液的化学计量混合物处理健康土壤上生长的花生来制备不同的代谢变体。花生GDH电荷异构体经电泳纯化至均一,合成RNA酶。花生总RNA 5'-末端用[ γ - 32 P]ATP标记,作为底物进行体外反应与来自花生的另一种代谢变体的 GDH 合成的 RNA。反应产物的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳显示 tRNA、rRNA 和大部分 mRNA 降解为单核苷酸,但未与 GDH 合成的 RNA 混合的总 RNA 没有降解。当 GDH 合成的 RNA 的非同源序列片段被剪掉时,同源片段不能产生带有花生总 RNA 的 Northern 条带。因此,非同源序列部分用于识别、定位和比对 GDH 合成的 RNA 与其目标总 RNA 位点,而不依赖于遗传密码;总RNA的降解是通过非规范的酶-底物复合物中的碱基比对,然后是总 RNA 的电磁破坏,这两种 RNA 的稳定性较差。这是支持有限资源农民的作物生产努力的科学基石,因为 GDH 合成的 RNA 可快速降解作物的多余总 RNA,以应对土壤矿物质营养缺乏,从而最大限度地减少代谢能量在合成不必要的蛋白质酶,同时优化生物量代谢、作物生长和最大作物产量。GDH 合成的 RNA 对总 RNA 的体外水解是从细胞、组织和整个生物体中清除病态总 RNA 的改变游戏规则的原型研发方法。
关键词
花生,资源有限的农民,化学计量盐混合物, GDH 同工酶纯化,基于非遗传密码的 RNA ,电泳, DNA:RNA 杂种
一、简介
作物谷氨酸脱氢酶 (GDH, EC 1.4.1.2) 合成 RNA 不依赖于模板,因为它响应于亲核试剂和亲电子试剂而异构化,包括中间代谢物、异生物质、杀虫剂、矿物质营养素、N-(羧甲基)壳聚糖、甲硫氨酸亚砜亚胺、生长素、有毒金属离子和核苷酸 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]。GDH 的 RNA 合成活性及其对生化途径的协调最初被描述为信号整合和识别现象 [ 4]。后来,一方面比较 GDH 合成的大量 RNA 的核苷酸序列与作物产量,另一方面比较它们对无机盐处理的化学计量混合物的反应,揭示了 RNA [ 5 ] [ 6 ] 的核糖核酸酶活性。GDH 合成的 RNA(基于非遗传密码的 RNA)的酶学特性部分是由于它比总 RNA 更热稳定 [ 7 ]。酶机制可能涉及非规范的静电碱基配对化学反应 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12]。下面,我们开始介绍 GDH 合成的 RNA 降解总 RNA 的机制和机制,以及可能的研发应用。
对暴露于不同矿物质营养条件的植物的转录组学分析揭示了几种代谢途径和许多作为矿物质营养素作用目标的基因的特性 [ 13 ],但没有提出差异反应的化学/分子机制. RNA 降解活动在许多基因组中普遍存在;最普遍的机制是核酸内切酶、5' 核酸外切酶和 3' 核酸外切酶 [ 14 ] [ 15 ]。DNase 和 RNase 不受农艺非生物胁迫因素的控制。在细胞质中,双链 RNA(miRNA、siRNA、shRNA 等)被 RISH 和 RITS 蛋白复合物激活,以指导互补 RNA 的位点特异性降解 [ 16 ] [17 ]。已证明通过短 RNA 双链体进行的基因沉默可抑制植物、哺乳动物和无脊椎动物中的蛋白质表达 [ 16 ] [ 18 ] [ 19 ]。RNA 干扰现象最初被认为是保护生物体免受 RNA 病毒侵害的抗病毒机制 [ 20 ]。但RNA干扰机制的基因沉默是基于遗传密码的RNA对基于遗传密码的RNA的降解;因此,它在小农作物生产农业中的效用存在局限性。
谷氨酸脱氢酶对非生物和生物氧化还原环境(干旱、光照、农艺实践、极端温度、极端 pH 值、可变盐度、可变矿物质营养成分和浓度、可变土壤有机碳含量、病原体感染等)敏感,它动态地联系植物生长发育对土壤健康和矿物质养分组成和浓度的影响 [ 21 ] [ 22 ]。当土壤健康、矿物质浓度和成分充足时,作物的 GDH 活性反应良好,作物产量翻倍优化 [ 22 ] [ 23 ];但是当土壤退化时,作物的生长、发育和生产力通常会下降 [ 24 ] [ 25 ]] [ 26 ] [ 27 ]。健康的土壤孕育健康的作物,进而孕育健康的人类营养。确保最佳施肥到土壤的养分预算并未为分析农艺不确定性提供可接受的指导方针 [ 28 ]。鉴于养分流失和由此导致的农业生态系统退化,资源有限的农民难以实施土壤精准施肥的综合养分管理。
基于遗传密码的 RNA(rRNA、tRNA 和 mRNA)催化蛋白质的生物合成,这些标志使植物能够生长、发育和积累生物质饲料和食物。带有核糖体的 mRNA 的不同可用性是调节蛋白质生物合成速率的因素之一 [ 29 ]。因此,通过 GDH 合成的 RNA 酶调节基于遗传密码的 RNA 的丰度对于优化农业生产力非常重要。植物在具有矿物质营养限制的退化土壤中自然生长 [ 30 ]。世界上近 8 亿人或世界上 78% 的土著贫困人口——生活在农村地区,依靠退化土壤上的农作物生产将食物放在餐桌上 [ 31]。超过 5 亿小农户管理着世界上大部分的农业用地,生产着世界上大部分的粮食、植物药物和饲料。城市后院社区花园的农业生产占全球新鲜和营养食品产量的 15% ( https://www.farmers.gov/media/blog/2018/11/06/farming-city )。不到 1 公顷的农场占所有农场的 72%。相比之下,世界上只有 1% 的农场面积超过 50 公顷 [ 32 ]。随着城市人口和饥饿人数上升高达 50% [ 33],城市园丁、城市农民和 8 亿农村农民的总和表明,超过 10 亿人正在耕种土地以生产新鲜、健康的食物、创造就业机会和创收。资源有限的农民缺乏购买足够肥料、杀虫剂、灌溉技术 (http://129.114.16.46/AgroNew/index.php) 和农业机械来支持他们的作物生产工作的财力。尽管世界依赖生计、有限的资源和小农来可持续地生产新鲜、健康的粮食和饲料作物,但还没有经过科学验证的技术可以支持和鼓励小农作物生产者的农业努力。然而,
GDH 是一种根据作物的生物量代谢需求差异控制总 RNA 浓度的机制 [ 1 ] [ 22 ]。GDH 是多同工酶。它通过色谱法纯化为多肽 [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] 或通过电泳纯化为完整的、有活性的、未降解的同工酶 [ 37 ];不依赖模板的 RNA 合成活性是活性未降解、非变性同工酶的独有功能 [ 1 ] [ 22 ]。我们为 GDH 合成的 RNA 降解基于遗传密码的 RNA [ 7 ] 提供了定性证据。]。在下文中,我们将体外和体内总 RNA 的降解描述为 GDH 同工酶控制在矿物营养有限土壤的非生物胁迫环境中栽培的花生生长、分化和营养生物量积累的机制,这类似于和模仿有限的资源 农民的农场地块。
2。材料和方法
2.1。用矿物盐溶液的化学计量混合物处理花生
将花生 (Arachis hypogaea L. Cv. Virginia) 种子种植在 120 × 120 × 30 厘米(宽 × 长 × 深)的盒子(高架床)中,每个盒子都填充有混合两袋(18 公斤)表层土壤制备的健康土壤(Landscapers Pride,美国德克萨斯州新韦弗利)和三袋(2.8 立方英尺)的专业种植混合物(Sungro Horticulture,贝尔维尤,华盛顿,美国)。在美国德克萨斯州沃勒县的大学农场,每张高架床都安装在田间的平地上,上面铺有防杂草的塑料垫。2014年5月下旬,在50张高架床中,每张种植约30粒种子。从50张床中选出22粒发芽率为100%,且花生苗生长旺盛,生长速度大致相同。前两张床作为未处理的对照。如表1中所述,重复进行处理[ 39 ]。应用的矿物盐组合物基于化学计量组合,以模拟 GDH 同工酶 [ 38 ] 的二项式亚基多肽组合物,并以摩尔比与花生中的靶分子相互作用。每隔一天给所有的盒子均匀浇水。壳聚糖和矿物质溶液(每床 5 L)施用 3 次:第一次在种子发芽后 3 周,第二次在开花时,最后一次在开花后。当叶子变黄变干(花生成熟)时,收获豆荚,每箱称重并立即用手去壳,并将籽粒(种子)储存在-30˚C。重复的种子收获不合并,而是分开储存。
2.2. GDH的纯化
使用含有 RNase A [ 1 ] [ 22 ]的 0.1 M Tris-HCl 缓冲液从花生种子 (30 g) 中提取 GDH 同工酶。种子来自对照或矿物盐处理的高架床。硫酸铵盐析步骤后,透析
治疗 |
N (1 L 25 mM NH 4 Cl) |
N + P + K + S(1 L 25 mM NH 4 Cl、20 mM Na 3 PO 4、4 mM KCl,加 50 mM Na 2 SO 4) |
K (1 L 4 mM KCl) |
S (1 L 50 mM Na 2 SO 4 ) |
P + S(1 L 20 mM Na 3 PO 4,加 50 mM Na 2 SO 4) |
P (1 L 20 mM Na 3 PO 4 ) |
N + S(1 L 25 mM NH 4 Cl 加 50 mM Na 2 SO 4) |
N + P + K(1 L 25 mM NH 4 Cl、20 mM Na 3 PO 4和 4 mM KCl) |
P + K(1 L 20 mM Na 3 PO 4,加 4 mM KCl) |
对照(未处理) |
0.1% N-羧甲基壳聚糖溶液。 |
表 1。一些矿物盐的化学计量混合物,通过 GDH 合成的 RNA 酶的活性产生花生的代谢变体。用矿物盐和 N-羧甲基壳聚糖的化学计量混合物溶液对生长在温室高架床中的花生施肥。
为了去除硫酸铵,粗提物经过 Rotofor (Bio-Rad) 等电聚焦 [ 3 ]。确定级分的 pI 值,然后进行透析以去除两性电解质(Bio-Rad 的 Bio-Lyte 3/10)。将 Rotofor 级分 (0.2 mL) 加载到双份天然 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳(Bio-Rad protean II xi 细胞)。天然凝胶电泳后,一张凝胶用吩嗪硫酸甲酯-谷氨酸-NAD + -溴化四唑溶液染色[ 40] 以定位 GDH 同工酶的位置。照片记录了凝胶景观中的 GDH 同工酶分布模式。使用染色凝胶作为灯箱上的指导/模板,从重复的电泳凝胶中切除 GDH 同工酶的位置 [ 37 ] [ 41 ]。GDH 同工酶在 0.05M Trizma 溶液中使用 Bio-Rad 全凝胶洗脱器在冰箱中的零度以下温度下从切除的凝胶块中电洗脱 [ 41 ]。不合并来自整个凝胶洗脱器的级分。为了纯化足够的同工酶用于 RNA 的合成,进行了多次冷冻电泳。每个处理过的花生的所有批次的纯化 GDH 电荷异构体具有相同的 GDH 亚基多肽分布。
2.3. RNA酶的合成
在含有四种NTP(每种 0.6 mM)、CaCl 2 (3.5 mM)、NH 4 Cl ( 0.875 mM)、α-酮戊二酸 (10.0 mM)、NADH (0.225 mM)、5 单位 RNase 抑制剂、1 单位 DNase-1 和 5 µg 放线菌素 D。加入 0.2 mL 全凝胶洗脱的 GDH 电荷开始反应每毫升含有 9 - 20 µg 蛋白质的异构体。用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液 pH 8.0 使反应的最终体积达到 0.4 mL。反应在 16˚C 下孵育过夜,并通过苯酚-氯仿 (pH 5.5) 去除蛋白质来停止 [ 42]。RNA(酶)用乙醇沉淀,溶解在最小体积的分子生物学质量的水中;使用前储存于-20˚C。RNA 酶的产量和质量通过光度法和琼脂糖凝胶电泳来确定,使用 RNA 分子量标记和花生总 RNA 作为标准。琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色,并用照片记录 RNA 产量/分布模式。一式两份进行测定(从收获的重复种子中)以验证结果的再现性。每个实验处理的花生重复种子收获的 GDH 同工酶模式相似。然后将每个实验处理产生相似/相同 GDH 模式的重复种子产量组合用于其他下游分析。
2.4. 总 RNA
使用酸性苯酚/氯仿 (pH 4.5) 方法 [ 42 ]从对照箱或矿物盐处理箱中收获的花生种子 (15 g) 中提取总 RNA 。
2.5. 总 RNA 作为底物的末端标记
花生总 RNA (~5 µg) 用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化;并使用 1 µL T4 多核苷酸激酶(Kinase-Max 试剂盒,Ambion, Austin, TX, USA)标记 1 µL [ɣ 32 -P] ATP (700 Ci/mmol) (ICN Biochemicals, OH, USA) (10单位/µL) 和 2 µL 10X 激酶缓冲液添加到反应混合物中,使总体积达到 20 µl。反应在 37°C 下孵育 1 小时,加入 EDTA 使反应浓度达到 1 mM,然后加热至 95°C 3 分钟。标记的 RNA 没有进一步纯化。
2.6. GDH 合成的 RNA 对总 RNA 的体外水解
GDH电荷异构体合成的RNA(酶)按pI值升序排列成7组(极酸性、酸性、弱酸性、中性、弱碱性、碱性和极碱性)。将不同处理花生的标记总 RNA(底物)(2.5 µg)添加到来自另一处理花生的 20 µg GDH 合成 RNA(酶)中,用 0.1 M Tris-HCl 使总体积达到 49 µL缓冲溶液 pH 8。 将 1 µL 三磷酸核糖核苷 (riboNTP) 混合物(每种 riboNTP 0.6 mM)加入冰上的反应混合物中。每个实验花生的 7 组 GDH 合成的 RNA 酶中的每一个都用于水解。反应如前所述进行热循环[ 7] :预热(96˚C,30 秒),然后进行 40 个冷却(5˚C,1 分钟)和温热(37˚C,2 分钟)循环(除非另有说明)。在热循环结束时,反应保持在 5°C。制备了两个不含 GDH 合成 RNA 的对照,每个对照含有 2.5 µg 标记的总 RNA 和 1 µL riboNTP 混合物,最终体积为 50 µL,使用 0.1 M Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.0。其中一个对照与实验反应一起进行热循环,另一个没有进行热循环,但将其留在冰上。
开发了两种用于分级降解产物的方法。第一种是琼脂糖凝胶电泳,第二种是聚丙烯酰胺凝胶电泳。任何未降解的总 RNA、降解的总 RNA 和过量的未反应32 P-ATP 通过对每种水解反应溶液 5 µL 进行简短(30 - 45 分钟,70 伏,TAE 缓冲液)琼脂糖凝胶(3.0%)电泳显示. 如前所述 [ 23 ] 将电泳的琼脂糖凝胶电转印迹(Bio-Rad 半干亚细胞)到 BrightStar Plus 尼龙膜(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上,并对膜进行放射自显影。
任何未降解的总 RNA 和降解的总 RNA 都转化为 RNA:DNA 杂交体,然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。向水解 RNA 溶液 (15.0 µL) 添加以下 Display Systems Biotech, Vista, CA 试剂:锚定引物 (5' T n V 12.5 µM) 2.0 µL, 10X cDNA 缓冲液 1 (2.5 µL), dNTP mix (5 mM 每个)5.0 µL,displayTHERMO-RT (100 U/µL) 1.0 µL。反应在 42°C 下孵育 2 小时。然后将试管置于冰上。聚丙烯酰胺凝胶 (10%) 由 29:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺混合物在 1XTBE 和 7 M 尿素中制成 [ 43 ]。将第一链反应产物 (10 µL) 上样到 1X 甘油上样缓冲液中 [ 43] 并在垂直 Bio-Rad Protean II ix 池中,在室温下,1× TBE 缓冲液和恒定 20 mA 下电泳 45 分钟。将电泳后的凝胶干燥(Bio-Rad 凝胶干燥器),并对凝胶进行放射自显影。
2.7. GDH 合成 RNA 的 cDNA 的制备
使用随机六聚体引物,用全凝胶洗脱的 GDH 电荷异构体合成 2 μg 每种产物 RNA,合成 cDNA。限制性片段 PCR 扩增;适配器连接;测序凝胶分级分离;和 cDNA 片段的纯化 [ 38] 根据 Display Systems Biotech, Vista, CA, USA 的方法进行。将选定的 cDNA 片段亚克隆到 pCR4-TOPO 载体中并转化到 TOP10 One Shot 化学活性大肠杆菌(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,然后在选择性平板上过夜生长。每板最多挑出十个阳性转化菌落,并在含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中培养过夜。用质粒试剂盒(Novagen,Madison,WI)纯化质粒DNA。Genemed Synthesis, Inc. (South San Francisco, CA, USA) 和 Functional Biosciences, Inc. (Madison, WI, USA) 用 T3 和 T7 引物对插入的 cDNA 进行测序。鉴定与基于遗传密码的 RNA(mRNA、tRNA、和 rRNAs) cDNA 序列被用作查询以搜索 NCBI 核苷酸-核苷酸 (不包括 EST) BLAST (blastn) 和非冗余蛋白质翻译 (blastx) 数据库。选择与正确分子量的基于遗传密码的 RNA 的比对分数最高的互补 DNA 作为 Northern 探针。
2.8. 将 cDNA 标记为 Northern Probe
用作 Northern 探针的 cDNA 与编码初级代谢酶(淀粉合酶、细胞色素 P450 还原酶、乙酰辅酶 A 羧化酶、类黄酮生物合成酶等)和花生 rRNA 的 mRNA 同源 [ 38 ]。为了标记 cDNA 探针,使用 M13 正向和 M13 反向引物(各 2 µM)通过 PCR 从相应的质粒(15 ng)中扩增 cDNA 插入片段,[ 32P]-dATP (6000 Ci/mmol, 20 mCi/mL)、dCTP/dGTP/TTP 混合 50 mM、(2 µL) 和 Taq 聚合酶 (1U),最终体积为 50 µL。根据 Display Systems Biotech (Vista, CA, USA) 'touch-down' PCR 程序进行扩增(变性:94˚C,1 分钟。前 10 个循环:94˚C,30 秒;退火:60˚C,第一个循环 30 秒,然后每个循环将温度降低 0.5°C,直到 10 个循环后达到 55°C 的退火温度;延长:72°C,1 分钟。继续另外 25 个循环,94°C,30 秒;55°C,30 秒;72°C,1 分钟;最终延伸 72°C,5 分钟)。
2.9。寡核苷酸探针的化学合成和标记
每个 GDH 合成的 RNA 的同源部分从非同源的 3' 和 5' 末端剪下,寡核苷酸的互补链由美国德克萨斯州伍德兰的 Sigma Life Science 化学合成。寡核苷酸 (1.0 pmol) 用 1 µL [γ 32 P] ATP (7000 Ci/mmol) (ICN Biochemicals, OH, USA) 使用 1 µL T4 多核苷酸激酶 (Kinase-Max 试剂盒, Ambion, Austin, TX ) 进行标记, USA) (10 units/µL) 和 2 µL 10× 激酶缓冲液添加到反应混合物中,使总体积达到 20 µl,加入分子生物学质量的水。反应在 37°C 下孵育 1 小时,加入 EDTA 使反应浓度达到 1 mM,然后加热至 95°C 3 分钟。过量未反应 [ 32P] ATP 通过 Ambion NucAway 离心柱对反应溶液进行色谱法去除。
2.10。北方印迹
上样来自对照和矿物盐处理的花生的等量 (15 µg) 总 RNA,在 2% 琼脂糖凝胶上进行短暂电泳,用溴化乙锭染色,并拍照以验证 RNA 质量。如前所述 [ 44 ],将 RNA 从电泳凝胶电转移到 Brightstar-Plus 尼龙膜(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上。
固定 RNA 的尼龙膜与 ULTRAhyb 缓冲液预杂交,并与32 P 标记的 cDNA 插入片段或相应的 Sigma 合成的寡核苷酸作为探针杂交,在 68°C 下过夜 [ 23 ] [ 44] 标记的 cDNA 溶液首先在沸水浴中加热 10 分钟,然后加入预杂交膜。杂交后,用 NorthernMax(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)低严格性洗涤溶液洗涤膜(20 分钟,68°C),然后用 NorthernMax 高严格性洗涤溶液(15 分钟,60°C)洗涤。通过在-80˚C 的增感屏内暴露于 X 射线胶片对膜进行放射自显影。使用 UN-SCAN-IT 凝胶数字化软件 (Silk Scientific, Inc., Orem, Utah) 将北带强度数字化。
3. 结果
3.1。P + K 处理花生的 GDH 合成 RNA 对 KCl 处理花生总 RNA 的体外降解
所有 GDH 电荷异构体合成的 RNA 酶 (a) 非常酸 (pI 4.5 ± 0.2); (b) 酸 (pI 5.0 ± 0.2);(c) 弱酸性 (pI 6.0 ± 0.4);(d) 中性 (pI 7.0 ± 0.4);(e) 弱碱性(pI 8.0 ± 0.3);(f) 碱性(pI 8.4 ± 0.2);(g) P + K 处理的花生的强碱性 (pI 8.6 ± 0.1) 水解了 KCl- 总 RNA (底物) 的所有低分子量成分 (tRNA、5S、16S 和 28S rRNA 以及许多 mRNA)与未用 GDH 合成的 RNA 处理的总 RNA 样品相比,将花生处理成几乎单核苷酸(图 1(一个))。这是唯一能在体外降解总 RNA 的 RNA 酶。从琼脂糖凝胶孔源处的少量未降解总 RNA 来看,由 GDH 酸电荷异构体合成的 RNA 在总 RNA 降解方面比其他 RNA 更有效。当 RNA 解除编码功能时,它就变成了一种成熟的酶 [ 7 ]。
大部分全长 RNA:总 RNA(底物)的 DNA 杂合体也卡在了原点(图 2(A));而降解中间体(带 2、3、4、5 和 6)也被聚丙烯酰胺凝胶捕获(图 2 (A))。以未降解的总 RNA 为基线(图 2(A)),总RNA降解产物的数字定量显示,酸性GDH异构体合成的RNA酶比GDH的中性电荷异构体合成的酶活性高约2-5倍。然而,由 GDH 的中性 (pI 7.0 ± 0.4)、弱碱性 (pI 8.0 ± 0.1) 和碱性 (pI 8.4 ± 0.2) 电荷异构体合成的 RNA 酶也不同程度地降解总 RNA。琼脂糖凝胶没有捕获中间降解产物(图 1)。GDH 合成的 RNA 是唯一能在体外降解总 RNA 的酶。总 RNA 中间降解带的存在表明在降解反应中形成了酶-底物复合物。
3.2. P + K 处理花生的 GDH 合成 RNA 对对照花生总 RNA 的体外降解
(a) 非常酸 (pI 4.5 ± 0.2) 合成的 RNA 酶;(b) 酸 (pI 5.0 ± 0.2);(c) 弱酸性 (pI 6.0 ± 0.3);(e) 弱碱性(pI 8.0 ± 0.3);(f) 碱性(pI 8.4 ± 0.2);(g) P + K 处理的花生 GDH 的强碱性 (pI 8.6 ± 0.2) 电荷异构体水解了总 RNA 的所有低分子量成分 (tRNA、5S、16S 和 28S rRNA 以及一些 mRNA) (与未用 GDH 合成的 RNA 处理的总 RNA 样品相比,对照花生几乎变成单核苷酸(图 1(乙))。最活跃的 RNA 酶是那些由强酸和酸电荷异构体合成的酶。这是唯一能在体外降解总 RNA 的 RNA 酶。由 GDH 的弱酸性 (pI 6.0 ± 0.4) 和中性 (pI 7.0 ± 0.4) 电荷异构体合成的 RNA 酶对总 RNA 的降解活性较低,从它们未降解的总 RNA 与那些的相似性来看。
图 1。体外总 RNA 降解产物(琼脂糖凝胶电泳)。微管中的 GDH 电荷异构体 (a) 非常酸性 (pI 4.5);(b) 酸性 (pI 5.0);(c) 弱酸性(pI 6.0);(d) 中性(pI 7.0);(e) 弱碱性(pI 8.0);(f) 碱性(pI 8.4);(g)强碱性(pI 8.6)通过电泳从P+K处理的花生中纯化,并用于合成RNA酶。花生总 RNA 5' 末端用 [γ 32P]-ATP。KCl 处理的花生 (A) 的标记总 RNA (20 µg);将对照花生 (B) 添加到含有由每种 GDH 电荷异构体在 0.05 M Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.0 中合成的 RNA 酶的每个微管中。微管 (h) 和 (i) 在 0.05 M Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.0 中含有 20 µg 标记的总 RNA,但不含 GDH 合成的 RNA 酶。管 (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g) 和 (h) 进行热循环,但管 (i) 留在冰上。反应结束后,每个反应取 5 µL 通过 3% 琼脂糖凝胶进行短暂电泳。将电泳凝胶转染到尼龙膜上,并对膜进行放射自显影。DP是指降解产物。
图 2。体外总 RNA 降解产物(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。微管中的 GDH 电荷异构体 (a) 非常酸性 (pI 4.5);(b) 酸性 (pI 5.0);(c) 弱酸性(pI 6.0);(d) 中性(pI 7.0);(e) 弱碱性(pI 8.0);(f) 碱性(pI 8.4);(g)强碱性(pI 8.6)通过电泳从P+K处理的花生中纯化,并用于合成RNA酶。花生总 RNA 5' 末端用 [γ 32P]-ATP。KCl 处理的花生 (A) 的标记总 RNA (20 µg);将对照花生 (B) 添加到含有由每种 GDH 电荷异构体在 0.05 M Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.0 中合成的 RNA 酶的每个微管中。微管 (h) 和 (i) 在 0.05 M Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.0 中含有 20 µg 标记的总 RNA,但不含 GDH 合成的 RNA 酶。管 (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g) 和 (h) 进行热循环,但管 (i) 留在冰上。热循环后,每个反应取 10 µL 进行第一链 cDNA 合成反应,使用随机六聚体引物和禽类逆转录酶生成 RNA:DNA 杂交体。第一链 cDNA 合成后,一半的反应溶液通过 7% 尿素聚丙烯酰胺凝胶进行短暂电泳。将电泳凝胶真空干燥,并进行放射自显影。在图 2 (A),条带编号 1 是未降解的总 RNA;2、3、4、5、6条带主要为总RNA降解产物;带7主要是过量的[ 32 P]-ATP。对于图 2 (B) 反应 (h) 和 (i),我们用完了对照花生的标记总 RNA
总 RNA 对照。
大部分全长 RNA:总 RNA(底物)的 DNA 杂合体也卡在聚丙烯酰胺凝胶的起点,但所有 GDH 合成的异构 RNA 酶(非常酸 (pI 4.5 ± 0.2)、酸性 (pI 5.0 ± 0.2)、弱酸性 (pI 6.0 ± 0.4)、中性 (pI 7.0 ± 0.4)、弱碱性 (pI 8.0 ± 0.1)、碱性 (pI 8.4 ± 0.3) 和极碱性 (pI 8.6 ± 0.1) 降解总 RNA不同程度(图2(B))。除了靠近凝胶底部的快速迁移条带(过量的32 P-ATP和低分子量寡核苷酸)外,还有中间降解产物的涂片。聚丙烯酰胺凝胶电泳(图 2(B)) 的 RNA:DNA 杂交体捕获的中间降解产物比总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳更多(图 1 (B))。总 RNA 的中间降解涂片的存在是降解机制中酶-底物复合物的证据。
在 GDH 合成的 RNA 对总 RNA 的降解中,热循环的对照 RNA 与未循环的对照 RNA 相似,并且两者都不同于降解的 RNA 模式(图 1,图 2)。因此,热循环不会降解总 RNA。总 RNA(底物)在 5' 端标记。因此,可见的降解产物是总 RNA 部分 5' 末端的降解产物;那些在 3' 末端的人对放射自显影是无敌的。这种差异检测简化了降解产物的可视化(图 1,图 2)。琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳显示降解产物的优势与过量的标记 ATP 共电泳,因此表明大多数靶 RNA 分子被降解为 5'-单核苷酸。然而,在聚丙烯酰胺凝胶上捕获的降解产物涂片(图 2)显示其中许多是高分子量寡核苷酸。标记的总 RNA 及其降解片段被转化为 RNA:DNA 杂合体(图 2),因为已知 RNA:DNA 杂合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳下会以紧密带的形式迁移 [ 45 ] [ 46 ]。
3.3. GDH 合成的 RNA 对总 RNA 的体内降解
用GDH [ 37 ] [ 44 ] [ 47 ] [ 48 ] 为所有实验花生(图3)。每个探针通过 [α- 32 P]-dATP [ 5 ] [ 7 ] [ 23 ] 的 PCR 掺入进行 cDNA 标记。每个标记的 cDNA 探针至少产生一对 Northern 条带(图 3(B)-(E) 是 GDH 合成 RNA 的典型结构特征,用于整合和区分代谢途径 [ 5 ] [ 21]。编码无机磷酸盐转运蛋白(约 1700 个碱基长)[ 47 ][ 48 ]的 mRNA(图 3(B))在对照花生中被 GDH 合成的 RNA 酶在体内降解,在用 P+S、P 、N + S、N + P + K 和 P + K 矿物盐溶液的化学计量混合物(图 3 (B))。N-、N + P + K + S-、K- 和 S 处理的花生泳道中的条带(约 1500 - 3000 个碱基长)是复合不完全分辨的多重条带
无机磷酸盐转运蛋白 BAB16885.1 |
CTGGATNGCAGTTCGGCCGTTAAGGTTGGTCTTTGTTTAAGTTCCTTGTGGAAAGCCCTGGGCTCATATTTTTGGGAACTCGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACGCAAAGGAATTGACGGGTAAT |
黄酮生物合成基因gb|EF165349.1| |
CGGCATTGATAGCGATGAGTCCTGACCGACAACGGCATTGATAGCGATGAGTCCTGACCGACAACGGCATTGATAGCGATGAGTCCTGACCGACAACGGCATTGATAGCGATGAGTCCTGACCGCAAGGCATTGATAGCGATGAGTCCTGA |
淀粉合酶 IIa:gb|ACL98483.1| |
GTTACGATTCGCCCTTATGAGTCCTGACCGAGAACCGCGTTGATGGGGATGAGTCCGGACCGCCAACGGCATTGATAACGATGAGTCTGGACGGAGCTTACTCTTTATAATGATGAGTCCTGACCGACAACGGGTTTGATAGCTATGATTCCTGACCGACTGCGGCATTGATAGCGATGAGTCTGGATGGGATATGCAGACTACCAGAACCTGATTGGCGACT |
16 S核糖体RNA基因EU982406.1;EU982414.1 |
TTAACGCGTTAGCTTCGATACTGCGTGCCAAATTGCACCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCAGTGTTGGTCCAGGTAGCTGCCTTCGCCATGGATGTTCCTCCTGATCTCTACGCATTTCACTGCTACACCAGGAATTCCGCTACCCTCTACCACACTCTAGTCGCCCAGTATCCACTGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCAGGGCTTTCACAACGGACTTAAACGACCACCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAGTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGA |
表 2。一些 GDH 合成的 RNA 的 cDNA 用作探针。同源部分用粗体表示,左边加下划线,右边加双下划线。
其中包括 1700 个碱基长的磷酸转运蛋白 mRNA。磷酸盐转运蛋白调节叶绿体和细胞质之间无机磷酸盐和磷酸丙糖的反向交换,从而控制中间体在花生柠檬酸循环中的流动 [ 21 ] [ 23 ] [ 39]。在对照花生中,以及用 P + S、P、N + S、N + P + K 和 P + K 化学计量混合物的矿物盐溶液处理的花生中,编码磷酸转运蛋白的 mRNA 被降解,叶绿体磷酸丙糖被转化转化为淀粉,并以麦芽糖的形式输出到细胞质中,用于纤维素生物合成生物量的积累。因此,与之前的观察结果一致,所有磷酸盐转运蛋白 mRNA 降解的花生都比磷酸盐转运蛋白 mRNA 未降解的花生(每公顷 6391 - 7266 千克)产生更多的豆荚产量(每公顷 9418 - 9822 千克)[ 49]。用 N + P + K + S 化学计量矿物盐混合物处理的花生产生更高的种子产量(每公顷 12,513 个),因为磷酸盐转运蛋白 mRNA 没有被降解(图 3 (B))并且颗粒结合的淀粉合酶 mRNA 仅部分降解(图3(D))因此,生物量积累和糖酵解都正常进行。这是经过生物化学验证的技术,支持和鼓励小农作物生产者的农业努力,他们在健康的土壤上种植作物并收获
图 3。花生总 RNA 和 Northern 印迹表明总 RNA 在体内降解。从用指定化学计量混合物的矿物盐溶液施肥的花生种子中提取的总 RNA (A);通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳,转印迹到尼龙膜上,然后用与编码 (B) 无机磷酸盐转运蛋白的 mRNA 同源的 GDH 合成 RNA 的32 P标记 cDNA 进行膜筛选;(C) 类黄酮生物合成酶;(D) 颗粒结合的淀粉合酶;(E) 16 S rRNA。用高度严格的溶液洗涤膜并进行放射自显影。MM 表示 Ambion RNA 千年标记。
尽管他们向作物施用了有限量的肥料,但作物产量仍然健康。GDH 合成的 RNA 酶在叶绿体中整合和区分磷酸丙糖易位和淀粉合酶途径(图 3 (B) 和图 3 (D)),从而优化生物质产量 [ 21 ] [ 39 ] 是基石超过 10 亿小农/资源有限农户的农业创新能力。与早期观察结果一致,编码黄酮类生物合成基因(长约 9000 个碱基)的 mRNA 未降解(图 3 (C))[ 49] 用化学计量的矿物盐混合物处理的园艺花生比商业生产的花生更有风味。在用 S、P + S、P 和 P + K 化学计量矿物盐混合物处理的花生中,16S rRNA 条带(1800 个碱基长)被差异降解(图 3 (E))。因此,在总 RNA 的体外降解(图 1、图 2 )中观察到的结果与 mRNA 和 rRNA 的体内降解(图 3(B)-(E))一致,因为在这两种情况下,总 RNA 都被降解了.
3.4. GDH同工酶降解总RNA的机制
所有 GDH 合成的 Northern 探针(表 2)识别它们的目标 mRNA 或 rRNA 不是基于总 RNA 的基于遗传密码的结构,而是基于同源序列比对。当剪除位于同源序列两侧的非同源 RNA 序列(表 2和表 3),并将互补寡核苷酸用作 Northern 探针时,没有识别总 RNA 靶标,也没有 Northern 条带。因此,GDH 合成的 RNA 的总 RNA 降解功能与遗传密码无关。
与 GDH 合成的探针相对应的化学合成探针(表 3)没有给出任何 Northern 条带,从而揭示了总 RNA 降解的化学机制。因此,侧翼序列的作用是将 GDH 合成的 RNA 中的同源序列引导、引导和比对到同源总 RNA 序列中的靶位点。
GDH合成的RNA(non-genetic code-based RNA)与总RNA(genetic code-based RNA)的G+C含量[ 7 ]不同。在
用于编码无机磷酸盐转运蛋白的 mRNA 寡核苷酸探针: |
CTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCAGTGTTGGTCCAGGTAGCTGCCTCGCCATGGATGTTCCTCCTGATCTCTACGCATTTCACTGCTACACCAGGAATTCCGCTACCCTCTACCAACCACTCTAGTCGCCAGTAT |
编码黄酮类生物合成基因的 mRNA 寡核苷酸探针: |
CGGTCGGACTCATGTCGGTCAGGACTCATGTCGGTCAGGACTCATGTCGGTCAGGACTCA |
用于编码淀粉合酶 IIa 的 mRNA 的寡核苷酸探针: |
ACTCATCGCTATCAATGCCGCAGTCGGTCA |
16 S rRNA 寡核苷酸探针 |
CGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT |
表 3。一些化学合成的寡核苷酸探针。
由于 G+C 含量不同,总 RNA 的电磁特性不同于 GDH 合成的 RNA。与编码磷酸转运蛋白的 mRNA 同源的 GDH 合成的 RNA 探针在 mRNA 的核苷酸残基 151-347 的范围内重复两次。与编码淀粉合酶的mRNA同源的GDH合成的探针在mRNA的核苷酸残基110-651的范围内重复四次。与 16S rRNA 同源的 GDH 合成探针与残基 418-696 核苷酸范围内的 16S rRNA 匹配一次。与编码黄酮类生物合成酶的 mRNA 同源的 GDH 合成 RNA 探针在以下范围内重复六次mRNA 的 18-157 位核苷酸残基。15 ] [ 50 ]。
当 GDH 合成的 RNA 与基于同源目标遗传密码的 RNA 对齐时(图 4),它们之间产生的电磁碰撞(静电排斥)导致基于同源遗传密码的 RNA 降解,这是较小的两种RNA稳定(图4)。去除遗传密码强加的结构限制,将 RNA 转化为成熟的 RNA 酶,其生物学功能独立于遗传密码。基于遗传密码的核酸比基于非遗传密码的核酸在热上更不稳定[ 7 ]。GDH 合成的 RNA 酶高于遗传密码。
化学合成的寡核苷酸未能与目标总 RNA 序列杂交证明碱基配对氢键不是 GDH 合成的总 RNA 比对和降解的化学机制
图 4。GDH 合成的 RNA 酶化学降解总 RNA 的示意图。
核糖核酸。GDH 合成的 RNA 与基于目标遗传密码的 RNA 的比对是通过同源序列相互作用,包括两种 RNA 之间非规范碱基对的形成。涉及同源序列比对的 AA、UU、GG、CC、AU、GU 等类型的非 Watson Crick 碱基对还包括已知可稳定 RNA 结构基序及其螺旋的范德华、静电和溶剂化术语安排 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12]。然而,同源 RNA 比对中的非规范碱基对形成弱于 Watson Crick 互补氢键,因此解释了在 GDH 合成的 RNA 对总 RNA 的体外降解中应用低温的选择。因此,基于非遗传密码的 RNA(GDH 合成的 RNA)降解总 RNA 证实了核酸化学 [ 51 ]。此外,主导 RNA 干扰机制的双链 RNA(miRNA、siRNA、shRNA 等)、RISH 和 RITS 蛋白复合物 [ 16 ] [ 17 ] 不参与 GDH 合成的 RNA 机制(图 4)。同源依赖性基因沉默已被描述 [ 52] 但它只关注转基因而没有解释沉默的化学机制。总 RNA 降解片段形成 RNA:DNA 杂交体的事实(图 2)表明降解机制既不是总 RNA 的脱嘌呤也不是脱嘧啶。
3.5. 支持小农的经生物化学验证的技术
mRNA、tRNA 和 rRNA 的差异降解(图 1-4)揭示了作物在资源有限的农民种植时存活的生化机制。桑切斯-卡尔德隆 [ 53 ] 和 Pang 等人。[ 54 ] 观察到土壤矿物质养分的缺乏会增加叶片和种子生物量的积累,这与 Osuji 等人的观点一致,[ 1 ] [ 22 ] [ 41] 谁报告了用化学计量的矿物盐溶液混合处理的玉米和大豆中 GDH 提高了生物量产量。小农、资源有限和土著农民缺乏财力购买足够昂贵的化肥、杀虫剂和农业机械来支持他们的作物生产工作,但有时他们仍然收获大量食物和饲料来滋养和维持为他们的家庭创造收入。他们的大部分农田退化且贫瘠。许多植物生理学研究都集中在与矿物质营养失衡相关的转录和生物量变化 [ 24 ] [ 25 ] [ 55 ] [ 56 ] [ 57]; 但是作者假设并推测转录变化优化了翻译过程以增加生物量产量。没有讨论造成 mRNA、蛋白质和酶活性差异丰度的生化机制。需要提高小农土著农民的科学农业创新能力。
因此,机制是当植物因资源有限的农民而遭受土壤矿物质营养缺乏时,植物的 GDH 合成的 RNA 酶会迅速降解多余的 mRNA、tRNA 和 rRNA(图 1-4),从而最大限度地减少代谢能量的浪费。合成不必要的蛋白质,但优化所需的氨基酸、蛋白质和酶的合成,以确保发育、营养丰富的生物质植物化学物质积累(用于植物保护)和作物的存活。这些是经过生化验证的反应,支持小农的农业创新能力。这些机制也是生物技术的基础,土著资源有限的农民、民族植物学家、传统草药学家、非洲和亚洲的替代药物从业者产生了古代药用植物和香料的代谢变体,这些变体富含支持人类健康的特定种类的药理活性植物化学物质,无需基因工程或植物育种改变。氨基酸生物合成 [5 ]和翻译是细胞中最耗能的过程[ 58 ]。生物质代谢需要蛋白质合成和核糖体亚基、tRNA 和翻译因子的产生,这些因子在转录和转录后水平受到严格控制 [ 59 ]。GDH 合成的 RNA 酶(图 1-4)快速降解多余的总 RNA,以响应作物的生物和非生物胁迫、生长和分化线索,通过直接调节蛋白质积累来实现更直接的细胞调整。其他机制 [ 13 ] - [ 20] 也控制总 RNA 活性的管家过程对作物的代谢环境不敏感。当我们对花生进行 K + N 化学计量矿物盐处理(矿物质养分缺乏/不平衡)时,花生的巨型豆荚产量为每公顷 12,780 公斤 [ 49 ],而美国花生生产者的产量为每公顷 3184 - 5936 公斤[ 60 ] 通过传统的耗时、费力的轮作和施用非活性肥料实现。这一非凡的 > 200% 的作物产量增加是 GDH 合成 RNA 酶作物产量倍增生物技术的研发应用,用于提高/优化粮食作物产量 [ 23]。花生生产是全球农业的金矿,因为花生油在世界市场上每吨的收入约为 1470 美元,是豆油的两倍多 [ 61 ]。GDH 合成的 RNA 酶作物产量翻倍生物技术有望最大限度地减少饥饿以及有限资源、小农和城市社区园丁的农业生产成本。
3.6. GDH同工酶的纯化
作为合成基于非遗传密码的 RNA 的酶,GDH 同工酶天然附着在一些 RNA 上。因此,需要在 GDH 同工酶纯化过程中用 RNase A 处理组织,以水解所有的 RNA。所有通过色谱法纯化 GDH 的方法都没有从 GDH 同工酶中去除结合的 RNA [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] [ 62 ] [ 63 ]。当 RNA 与 GDH 同工酶结合时和当 RNA 被去除时,天然聚丙烯酰胺凝胶上 GDH 同工酶的分子分布差异令人震惊,因为在 GDH 的 RNase 处理后释放了更多的酸性同工酶(图 5)。同工酶多达十个
图 5. RNase 处理前后的谷氨酸脱氢酶 (GDH) 同工酶谱。GDH 同工酶是从等重量的花生种子中分离出来的,这些种子是从 N-羧甲基壳聚糖处理过的高架床上收获的;使用不含 RNase A (5A) 和含有 RNase A (5B) 的 Tris-HCl 缓冲混合物。在每种情况下,对等体积的 GDH 进行 Rotofor 等电聚焦 (IEF) 以使其电荷异构体的垂直带。在通过透析去除尿素和两性电解质之前测定 Rotofor 级分的 pI 值。然后,将等体积的透析 Rotofor 级分 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 和 17 分级为同工酶 (1)、(2)、(3 )、(4)、(5)、(6) 和 (7) 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。图 5 (A) 是与 RNA 结合的 GDH 同工酶的天然胺化图谱;图 5 (B) 是释放的 GDH 同工酶的胺化图谱。
从同工酶带的数字化强度判断,在它们从有界 RNA 中释放出来后,折叠更加氨基化(图 5)。
GDH 是多同工酶,因此在酶学中需要纯化完整的同工酶而不是亚基多肽。通过游离溶液等电聚焦进行电泳纯化,将同工酶浓缩到 Bio-Rad Rotofor 细胞的几个小室中;由于 GDH 同工酶的高分子量,因此 Rotofor 组分的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可去除所有 RNA 和其他蛋白质 [ 1 ] [ 22 ] [ 41]; 天然聚丙烯酰胺凝胶板的温和冷冻电泳洗脱同工酶,从而确保同源酶制剂不会解离和片段化为亚基多肽。这种多维电泳程序不仅用于纯化 Arachis hypogeae GDH 同工酶,还用于纯化人体细胞(Aubrey Thompson 教授实验室)和 Zea mays [ 64 ] [ 65 ] [ 66 ] GDH 同工酶。在所有情况下,均源的 GDH 同工酶被用于制备多克隆抗体,在 Western blots 上可以整齐地检测到 GDH 同工酶和亚基多肽 [ 2 ]。
从对照未处理花生、KCl 处理和 P + K 处理花生中纯化的 GDH 同工酶是独特的并且彼此不同,但它们在天然聚丙烯酰胺凝胶上显示出同工酶的标准二项式分布模式(图 5,图 6)。同样,由对照花生、KCl 处理花生和 P + K 处理花生的 GDH 的电荷异构体合成的 RNA(图 7)是花生 GDH 合成的典型 RNA [ 23 ]。从所有实验花生中提取的总 RNA(图 3 (A))没有 RNase 污染,因为 rRNA 条带以一致的比例生动地存在。
4。讨论
GDH 合成的 RNA 酶:超越遗传密码。对照花生的 GDH 合成 RNA 对 KCl 处理花生总 RNA 的降解表明,KCl 处理、P + K 处理和对照花生是 Arachis hypogeae 的不同代谢变体,GDH 合成的 RNA 是一种简单的分析用于证明表型差异的工具。对 tRNA、5S rRNA、16S rRNA 和 26S rRNA 的差异活性也可用于在基因组的研发分析中去除 rRNA 和 tRNA
图 6. 化学计量矿物盐诱导的花生 GDH 异构化。GDH 同工酶是从等量的花生种子中分离出来的,这些种子是从 (A) P + K 处理过的;(B) 未经处理的对照;(C) KCl 处理的花生;使用带有 RNase A 的 Tris-HCl 缓冲液混合物。在每种情况下,等体积的 GDH 均经过 Rotofor 等电聚焦 (IEF) 处理,使其垂直带电荷异构体。在通过透析去除尿素和两性电解质之前测定 Rotofor 级分的 pI 值。然后,通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳将等体积的透析 Rotofor 馏分 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 和 17 分馏成同工酶的水平条带 (1)、(2) , (3), (4)。通过使用溴化四唑试剂对电泳的聚丙烯酰胺凝胶进行活性染色来观察 GDH 同工酶谱。
图 7。由 GDH 电荷异构体合成的 RNA 酶。GDH 电荷异构体 1) 非常酸性 (pI 4.5);2) 酸性 (pI 5.0); 3)弱酸性(pI 6.0);4) 中性 (pI 7.0); 5)弱碱性(pI 8.0);6)碱性(pI 8.4);7) 从天然 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶板上洗脱的极碱性 (pI 8.6) 用于在含有四种 NTP 混合物、DNase 1、RNase 抑制剂和调节剂的混合物中进行 RNA 合成。RNA 产物通过溴化乙锭染色的 2% 琼脂糖凝胶进行电泳。由 P + K-、对照和 KCl 处理的花生的 GDH 电荷异构体合成的 RNA 酶分别显示在 (A) - (C) 中。X 为 10 µg,XX 为对照花生总 RNA 的 20 µg;mm 是 Ambion RNA 千年标记。
核糖核酸。目前,只有罗氏 KAPA RiboErase 试剂盒提供了一种从一些哺乳动物总 RNA 制剂中去除 rRNA 的分子生物学方法。由 GDH 的不同电荷异构体(强酸性、酸性、弱酸性、中性、弱碱性、碱性、极碱性)合成的 RNA 在总 RNA 的降解中具有不同的活性(图 1、图 2),因为 GDH 六聚体亚基组成是不同的 [ 47 ] [ 48 ],因此他们合成的 RNA 酶的一级结构是不同的 [ 7 ]。总RNA的降解(图1、图2) 证明 GDH 合成的 RNA 酶,类似于 GDH,是一组对总 RNA 序列具有不同特异性的异构酶。异构 RNA 酶对总 RNA 成分的不同活性(图 1-4)是 GDH 在体内发挥作用以整合和区分环境氧化还原信号的生化机制 [ 4 ]。GDH 到同工酶的 Rotofor 等电分离对于直观展示异构 RNA 酶对总 RNA 的不同降解活性非常重要。
对于 GDH 合成的 RNA 对总 RNA 的降解,总 RNA(底物)在 5' 末端被标记。因此,可见的降解产物是总RNA部分的5'末端;那些在 3' 末端的人对放射自显影是无敌的。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳显示降解产物的优势与过量的标记 ATP 共同电泳,因此表明大多数靶 RNA 分子被降解为 5'-单核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶上捕获的降解产物涂片(图2) 表明 GDH 合成的 RNA 具有向底物 RNA 分子的 5' 端发展的核酸内切酶活性。这种特异性可用于进一步阐明 mRNA、rRNA、tRNA 序列组织。众所周知,mRNA 通过两种途径衰变 [ 14 ]。GDH 合成的 RNA 对多余总 RNA 的瞬时降解(图 1-7)提供了另一种研究与总 RNA 衰变机制相关的 RNA 结构组织的研发方法。琼脂糖凝胶电泳(图1) 表明总 RNA 的低分子量(26S rRNA、16S rRNA、5S rRNA 和 tRNA)部分是 GDH 合成的 RNA 酶最容易降解的目标。核糖体 RNA 和 tRNA 是调节翻译过程的主要基于遗传密码的 RNA [ 29 ] [ 67 ]。GDH 异构化调节植物生长和分化 [ 1 ] [ 2 ] [ 41 ]。因此,通过 mRNA 和 rRNA 的差异降解,GDH 合成的 RNA 酶牢牢控制翻译(蛋白质生物合成)。
GDH 合成的 RNA 酶对总 RNA 的体外降解(图 1、图 2)是用于从细胞、组织、器官、整个生物体中清除病态总 RNA 的研发方法的惊人原型演示,因为该酶超越了遗传基因。代码。
致谢
非常感谢德克萨斯州加尔维斯顿 UTMB 的 Aubrey Thompson 教授实验室对研究项目的鼓励。感谢博士。Weerasooriya、Ampim 和 Carson 就研发应用进行对话。花生研究项目由 USDA-NIFA 通过 CBR 赠款和向 Prairie View A&M 大学提供的 Evans Allen 基金资助。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
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