从土壤中分离到一株红色色素细菌NS-17，其生理生化特性和16S rDNA分析证实该菌为粘质沙雷氏菌。从NS-17细胞中分离出的红色色素被鉴定为灵杆菌素。通过分析影响灵菌素生产的因素，建立了改进的培养基和培养条件，并采用连续发酵法，利用发酵过程中大量产生泡沫的优势。在以下条件下实现连续发酵：32℃，通风比为1:1，培养基的营养浓度是作为饲料培养基（无机盐浓度的一半）的5倍，流速为8 mL/min。首次将粘质沙雷氏菌连续发酵与泡沫浮选耦合，获得了高产灵杆菌素。培养56小时后，与分批发酵相比，细胞总收获量提高了2.33倍，灵杆菌素总量提高了2.70倍，细胞和灵杆菌素自动浓缩在流出液中。
关键词
粘质沙雷氏菌，Prodigiosin，泡沫，连续发酵，自动浓缩
1.简介
微生物的代谢物是药物最重要的来源之一，对新药的发现和开发尤为重要。绿脓杆菌素（PG）是从链霉菌属、沙雷菌属、假单胞菌属和其他属的一些物种中提取的一类天然红色素[1][2]；这些色素是一种典型的生物碱化合物，是一种次生代谢产物。该色素家族的一些成员表现出多种药物活性，如抗菌[3]、抗真菌[4]、抗疟[5][6]、抗藻类[7][8]、免疫调节[9][10]和抗肿瘤[11][12]活性，显示出重要的药用特性。
粘质沙雷氏菌是应用最广泛的PG产生菌，因为它能同时产生生物量和灵杆菌素。传统的PG生产是分批发酵，但产量不够高，而且由于发酵过程产生大量泡沫，操作人员必须添加大量消泡剂，不利于下游提取和纯化。本研究从土壤中分离出一株红色色素细菌NS-17，根据其生理生化特性和16S rDNA序列鉴定为粘质链球菌，并用LC/MS、FT-IR和NMR对其进行了表征。Willenbacher[13]和Cui[14]通过耦合发酵过程和泡沫浮选获得了较高的产品收率。为了提高PG的产量并避免需要消泡剂，粘质链球菌细胞通过发酵过程中产生的泡沫从发酵液中连续分离，并收集流出的发酵液。
2.材料和方法
2.1.菌种和培养基
用营养琼脂平板从南昌地区土壤中分离到一株红色色素细菌NS-17。NS-17在含有4 g甘油、16 g蛋白胨、4 g氯化钠和7 g氯化钾的液体培养基中于28℃下培养，并在摇动培养箱中以160 rpm摇动24小时。
2.2.NS-17的标识
使用标准程序进行形态学和生化测试[15]。通过扫描电子显微镜进行超微结构研究。
分离并测序了NS-17的16S rDNA。该序列与国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank中可用的16S序列进行了比较。用Mega程序构建了系统发育树，并应用1000个引导重采样来评估系统发育树的稳健性。
2.3.颜料的提取和分离
发酵后，通过离心收集NS-17细胞，并用蒸馏水洗涤两次。向细胞团中添加酸化乙醇（pH 3.0）以提取色素，并离心混合物。采用水和氯仿相分离法分离乙醇中的色素。用旋转蒸发法浓缩含红色素的氯仿相。通过硅胶柱色谱分离红色素，并用己烷：乙酸乙酯混合物（2:1，v/v）洗脱。浓缩色素通过使用薄层色谱（TLC）在石油醚：氯仿：甲醇的1:8:1（v/v）混合物中显影来纯化，然后用进一步的TLC（氯仿：乙酸乙酯=2:1[v/v]）再次纯化。然后收集分离的色素并将其溶解在酸化乙醇中。颜料用真空冷冻干燥器干燥。
2.4.红色颜料的特性
将纯化的色素溶解在乙醇中，pH=5.0或9.0（通过HCl/NaOH调节），以分析酸性和碱性条件下的吸收光谱，并在这两个pH值下扫描色素在波长300-700 nm处的吸光度。
使用安捷伦LC/MS测定颜料的分子质量（HPLC:1200，用甲醇：0.1%甲酸[70:30，v/v]；TOFMS:G 6220A，ESI-MS的混合物洗脱）。在Bruker Avance III 600光谱仪（300 MHz）上记录1H-和13C-NMR光谱，并使用CDCl3作为溶剂。用Nicolet 5700 FT-IR光谱仪记录颜料的FT-IR光谱。
2.5烧瓶培养条件的优化
使用纯化的灵菌素建立OD535和质量浓度之间的配方。
将培养液与酸性甲醇（pH 3.0）混合。甲醇的体积根据混合物的OD535进行调整，以确保光密度在0.2-1.0范围内。
由于NS-17在LB肉汤（生产灵杆菌素最广泛使用的培养基）中产生的色素最少，我们测试了几种报道的灵杆菌素发酵培养基[1][9][16][17][18]，并选择了以下初始培养基：甘油4 g/L、蛋白胨16 g/L、氯化钠3 g/L和氯化钾4 g/L；pH 7.0。初始培养条件如下：接种物大小：1.0%，烧瓶中100 mL培养基（250 mL），培养温度28℃，转速160 rpm。培养24小时后，测定灵杆菌素的产量。
2.6连续发酵
使用50L生物反应器在优化的烧瓶培养条件下进行连续发酵，无需添加消泡剂，泡沫到达生物反应器顶部后立即清除。根据流出泡沫的流速，提供比发酵培养基高5倍营养浓度的培养基（无机盐浓度的一半）作为进料培养基。用HCl和NH4自动调节肉汤的pH值・哦。
3.结果和讨论
3.1.菌株NS-17的鉴定
NS-17是一种革兰氏阴性、亚球形或杆状细菌菌株（图1）。营养琼脂上的NS-17菌落潮湿、粘稠、蔓延，有金属光泽，边缘不规则。该生物体可以液化明胶，并使用柠檬酸盐或乙酸盐作为唯一碳源；苯丙氨酸脱氨酶、L-阿拉伯糖发酵、果胶酸分解和H2S试验为阴性，而DNAase、V.P、脂肪酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和秦皮甲素水解试验为阳性。此外，NS-17可以使用海藻糖和D-山梨醇，但不能使用丙二酸盐或海藻酸盐。生理生化鉴定结果表明，NS-17菌为粘质链球菌。
16S rDNA与粘质链球菌的相似性最高，与粘质肠球菌L1（EF 208031）和粘质肠杆菌SA1（HM 136580）的相似性均为99%。NS-17与其他一些粘质链球菌菌株之间存在密切的进化关系（图2）。
图1.菌株NS-17（×5.0k）细胞的扫描电子显微图。
图2.基于16S rDNA基因序列的NS-17菌株的系统发育树。分支处的数字表示引导值（1000引导重采样）。括号中显示了每个参考物种的GenBank登录号。
结果表明，NS-17是粘质链球菌的一员，因此命名为粘质链霉菌NS-17。
3.2.颜料特性
将纯化的粘质沙雷氏菌NS-17菌株在摇瓶中发酵，以产生色素。经柱层析分离，薄层色谱纯化，得到红色素。
色素的紫外可见光谱（图3）与灵杆菌素[2]的典型光谱相似。TOFMS分析结果如图4所示。色素的[M+H]为324.2072，对应于灵杆菌素的分子式C20H25N3O。
KBr中色素的FT-IR吸收率为νmax 3406.91、2928.02、2852.17、1624.86、1539.83、1454.07、1240.98、1117.75、1071.29、960.33和772.16。吸收率对应于以下组：芳香族NH（3406.91）、CH2（2928.02和2852.17C）、C=C（1624.86,960.33 and 772.16）、吡咯骨架（1539.83 and 1454.07）、C-O-C（1240.98,1117.75 and 1071.29）。
该色素的NMR化学位移如下：1H-NMR（CDCl3，600 MHz，ppm）δ0.905（3H，m），1.294（2H，s），1.311（2H
图3.颜料的紫外-可见光谱。
图4.颜料的TOFMS。
（1H，brd）、6.921（1H）、6.965（1H；和13C-NMR（CDCl3，151 MHz，ppm）δ13.74、16.96、22.54、25.48、29.71、31.52、52.47、85.86、108.69、109.75、112.32、120.26、122.77、123.62、124.09、130.82、136.22、138.01、157.63和162.83。
UV Vis、TOFMS、FT-IR和NMR分析表明，从NS-17中分离出的红色素为PG。色素结构如图5所示。
3.3.烧瓶培养
菌株NS-17在LB肉汤中产生最少的红色素，对补充吐温-80和油的反应较弱，并且在30℃-32℃的温度下表现出高产量的灵杆菌素，这与大多数报道的粘质链球菌菌株[2][3][19]不同。单因素实验的结果如表1所示，最大值以粗体显示。根据表1中的顺序进行实验，并在前面的步骤中优化因子。
在考察的因素和浓度下，NS-17生产灵杆菌素的最佳条件为：麦芽糖6g/L；蛋白胨12 g/L；氯化钠1 g/L；氯化钾2 g/L；吐温-80 1%（w/v）；大豆油4%（w/v）；介质pH值8；接种物大小≥ 1.5%; 250 mL烧瓶中的介质体积≤ 50毫升；旋转速率≥ 190转/分；培养温度32℃。图6显示了在接种量为1.5%、培养基体积为50 mL、转速为190 rpm的条件下，根据时间计算的灵菌素产量。在培养的32小时内，灵杆菌肽的浓度达到了相对较高的值（60.51 mg/L），培养液的pH值稳定在8.0左右，这对于生产灵杆菌肽是有利的[19][20][21]。
在介质体积和转速的研究中，供氧显著影响了灵杆菌素的浓度。充足的氧气补充是灵杆菌素发酵的必要条件。
3.4.连续发酵
在生物反应器（中国东方生物有限公司GUJS-50L）中，以250 rpm的转速和1:1的通风比，在优化的烧瓶培养条件下，用5 g/L丙氧基化甘油作为消泡剂，重复控制生长培养三次。第1组在与对照组相同的条件下进行三次，但没有消泡剂，第2组进行
图5.与NS-17隔离的PG的结构。
| 1. Carbon sources | Carbon sources | Glycerol | Soybean oil | Amidulin | Sucrose | Maltose | Tween-80 | Glucose |
| PG (mg/L) | 12.79 | 9.49 | 10.71 | 12.71 | 16.63 | 11.37 | 7.34 | |
| 2. Maltose | concentration (g/L) | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | |
| PG (mg/L) | 11.097 | 16.14 | 25.01 | 23.09 | 22.93 | 23.20 | ||
| 3. Nitrogen sources | Nitrogen sources | Ammonium sulfate | Ammonium oxalate | Peptone | Gelatin | Bean flour | ||
| PG (mg/L) | 0.81 | 0.95 | 23.77 | 0.91 | 1.08 | |||
| 4. Peptone | concentration (g/L) | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 | 24 | |
| PG (mg/L) | 15.51 | 29.17 | 34.83 | 26.73 | 13.71 | 3.32 | ||
| 5. NaCl | concentration (g/L) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| PG (mg/L) | 23.24 | 33.95 | 32.82 | 33.77 | 33.13 | 26.65 | ||
| 6. KCl | concentration (g/L) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| PG (mg/L) | 27.61 | 28.64 | 33.59 | 33.24 | 32.76 | 22.09 | ||
| 7. Tween-80 | concentration (%) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| PG (mg/L) | 33.79 | 36.74 | 35.91 | 34.09 | 33.39 | 31.65 | ||
| 8. pH of medium | pH value | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| PG (mg/L) | 0.01 | 28.13 | 32.51 | 38.20 | 40.67 | 36.45 | ||
| 9. Inoculum size | Inoculum size (%) | 0.50 | 1.00 | 1.50 | 2.00 | |||
| PG (mg/L) | 20.67 | 39.68 | 41.70 | 41.89 | ||||
| 10. Volume of medium | Volume (mL) | 25 | 50 | 75 | 100 | 125 | 150 | |
| PG (mg/L) | 47.57 | 47.10 | 41.89 | 40.87 | 30.18 | 17.87 | ||
| 11. Rotational rate | Rotational rate (rpm) | 100 | 130 | 160 | 190 | 220 | ||
| PG (mg/L) | 29.43 | 35.35 | 47.14 | 49.03 | 49.43 | |||
| 12. Cultivation temperature | Temperature (˚C) | 26 | 28 | 30 | 32 | 34 | ||
| PG (mg/L) | 24.14 | 47.45 | 52.23 | 53.68 | 36.77 |
表1.单因素实验。
在与对照组相同的条件下，根据流出泡沫的流速，在不含消泡剂和营养物质浓度比以8 mL/min流速供应的发酵培养基（无机盐浓度的一半）高5倍的进料培养基的情况下，重复三次。发酵56小时后，测定细胞产量和PG。
| Group | Sample | Dry cell weight (g/L) | PG (mg/L) | Volume (L) | Total dry cell weight (g) | Total amount of PG (mg) |
| Control | Broth in bioreactor | 4.36 | 65.13 | 26.40 | 115.10 | 1719.43 |
| Efflux broth | 0 | 0 | 0 | |||
| 1 | Broth in bioreactor | 2.68 | 17.91 | 22.70 | 92.78 | 1007.53 |
| Efflux broth | 13.42 | 252.51 | 2.38 | |||
| 2 | Broth in bioreactor | 1.14 | 1.74 | 27.20 | 268.73 | 4644.63 |
| Efflux broth | 11.54 | 223.17 | 20.60 |
结果表明，外排泡沫含有大量的细胞和PG，通过补充培养基可以成功实现连续发酵。流出泡沫在收集器中自动液化，流出肉汤的重量如图6所示。生物反应器和流出肉汤中的PG浓度如图7和图8所示。
图6.不含消泡剂组的流出肉汤重量。
图7.生物反应器中的PG浓度。
图8.流出肉汤中的PG浓度。
由于泡沫收集过程易受污染，粘质链球菌的连续发酵阶段限制在72小时以内，56小时内未发生污染。
4.结论
S、 在以下条件下，从土壤中分离的粘质NS-17在烧瓶培养中产生大量PG：麦芽糖6 g/L；蛋白胨12 g/L；氯化钠1 g/L；氯化钾2 g/L；吐温-80 1%（w/v）；pH值8；接种物大小≥ 1.5%; 培养温度32℃。基于泡沫浮选法，当泡沫到达生物反应器顶部时，通过去除泡沫进行连续发酵；细胞和PG自动浓缩在泡沫中，使提取更容易，PG产量也更高。培养56小时后，细胞总收获量比分批发酵提高2.33倍，灵杆菌素总量比分批培养提高2.70倍。然而，由于污染的风险，长期培养仍然是一个挑战。
致谢
我们感谢福建省中青年教师教育科研项目（JAT160639和）的财政支持。我们感谢南昌大学魏教授在DNA测序方面的帮助和有益的讨论。
利益冲突
作者声明，本论文的出版不存在利益冲突。
工具书类
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