摘要:阿斯巴甜(L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)是一种非糖类人造甜味剂,在世界范围内被用作许多食品和饮料中的糖替代品。这项工作的目的是阐明每天摄入不同剂量的阿斯巴甜对小鼠肝组织细胞水平的急性影响。将 60 只成年雄性小鼠分为 5 组,包括对照组喂食正常饮食和自来水,而其他 4 组(每组 12 只)每天口服 1 mL 的 40、500、1000 和 1500 mg/Kg b.wt。APM 连续 5 周用管饲法溶解在蒸馏水中。使用Leica将固定在 10% 福尔马林中的肝脏样品切成 5 μ m 切片机和切片用常规苏木精和曙红 (H & E) 以及透射电子显微镜 (TEM) 染色。组织学结果显示肝组织中的细胞变化与增加的剂量成正比。肝细胞在几乎所有细胞的细胞质中都形成了脂肪滴,细胞核丢失,在 LM 水平可检测到坏死。在三联体和肝中央静脉周围以及较高剂量的细胞内间隙也产生了淋巴结节。TEM 结果表明线粒体的降解表明阿斯巴甜对肝组织的直接急性影响都与增加的剂量成正比。得出的结论是,每天摄入阿斯巴甜,即使是较低剂量,
关键词
急性 作用,阿斯巴甜,肝硬化,肝细胞,小鼠
一、简介
阿斯巴甜 (APM) 是市场上经过最严格测试的食品成分和最受欢迎的人造甜味剂,以 NutraSweet 和 Equal 品牌销售,广泛用于包装产品,例如标有“减肥”食品的标签 [ 1 ]。服用后,APM 将很快在胃肠道中代谢成三种成分,即氨基酸、天冬氨酸 (Asp) 和苯丙氨酸 (Phe) 以及甲醇 [ 2 ]。这些成分通过酶促作用在上消化道 (GIT) 内迅速释放,也可能被肠黏膜细胞吸收,在此水解成其成分,转运穿过小肠壁,最后通过全身循环。3] . 因此,血液将成为接收这些成分的站点,将它们运送到下一个站点,即肝脏。虽然天冬氨酸是由身体产生的,但苯丙氨酸是身体从食物中获取的必需氨基酸。尽管自 1965 年发现阿斯巴甜 [ 4 ]以来,人们一直在研究阿斯巴甜的安全性,但近年来它确实面临着真正的争议,即许多反对者声称它实际上对健康有害。虽然,全世界 90 多个国家都声称阿斯巴甜对人类食用是安全的 [ 5 ] [ 6 ];然而,至于 2017 年的证据不支持减肥或糖尿病的益处,一些数据发现与体重增加和心脏病风险有关 [ 7] [ 8 ] 。美国食品和药物管理局 (FDA) 官员将阿斯巴甜描述为经过最彻底测试和研究的食品添加剂之一,而该机构已批准其安全性为“明确的”,但一直是几个争议、恶作剧的主题 [ 9 ] [ 10 ]和健康恐慌[ 11 ]。
阿斯巴甜在体内的新陈代谢会产生大量有毒的甲醇,但与游离甲醇结合使用时,由于吸收增强,少量也可能令人担忧。游离甲醇存在于某些食物中,并且在加热阿斯巴甜时也会产生。经常消耗的游离甲醇可能是一个问题,因为它会在体内分解成甲醛,一种已知的致癌物质和神经毒素 [ 12] . 然而,英国食品标准局 (FDA) 指出,即使是阿斯巴甜高消费量的儿童,也没有达到甲醇的最大摄入量。他们还指出,由于众所周知吃水果和蔬菜可以增强健康,因此从这些来源摄入甲醇并不是研究的重中之重。在商业产品或加热饮料中发现的阿斯巴甜可能是癫痫发作的诱因,应在难以控制癫痫发作的情况下进行评估 [ 13 ]。
许多监管机构和健康相关组织,例如美国食品和药物管理局 (FDA);联合国粮食及农业组织、世界卫生组织 (WHO)、美国心脏协会和美国饮食协会都对阿斯巴甜持积极态度。2013 年,欧洲食品安全局 (EFSA) 对来自阿斯巴甜研究的 600 多个数据集进行了审查,发现没有理由将阿斯巴甜从市场上移除。该审查报告没有与正常或增加摄入量相关的安全问题。
人造甜味剂阿斯巴甜对小鼠血液参数的急剧影响已显示出相当大的变化[ 14 ]。然而,在细胞水平上证明阿斯巴甜对某些身体器官、肝脏的影响的研究却很少。本研究的目的是通过光 (LM) 和透射电子显微镜 (TEM) 证明每天摄入不同剂量的阿斯巴甜对小鼠肝细胞的急性影响。
2。材料和方法
2.1。阿斯巴甜 (APM)
得到化学结构[CAS No. 22839-47-0, 同义词 NL-α-Aspartyl-L-phenylalanine1-Methyl Ester, H-Asp-Phe-OMe 和化学式 C 14 H 18 N 2 O 5 ]来自日本公司 Tokyo Chemical Industry Co (TCI),为每瓶 25 克纯度为 98% 的精细白色粉末。
2.2. 阿斯巴甜剂量的制备
制备了四种浓度:40、500、1000 和 1500 mg/Kg b.wt,方法是将正确重量的阿斯巴甜溶解在蒸馏水中,在有盖的玻璃瓶中,每次剂量足以覆盖 12 只实验小鼠。
2.3. 动物和动物护理
在该项目中遇到了来自沙特阿拉伯利雅得国王大学的 60 只雄性 Albino Swiss Webster (SW) 小鼠,体重为 2 个月大 (22 ± 2 gm)。在研究开始前,它们以每笼 6 只的形式饲养约 5 天。所有动物都可以自由获取食物和水,并在整个研究过程中保持 12:12 光照:黑暗暴露时间表,而动物群的气氛保持在 (24°C ± 2°C)。
2.4. 实验方案
60 只小鼠,每只 22 ± 2 gm,分为 5 组(G1 作为对照;而 G2、G3、G4 和 G5 分别接受 40;500、1000 和 1500 mg/Kg b.wt.)所有剂量均为准确计算并相应服务。第一个作为未治疗组,因此称为对照组,而其他四个实验组则用阿斯巴甜剂量治疗。
2.5. 动物解剖
经过 5 周的每日治疗后,每组中的两只动物进行心脏灌注,在完全麻醉下,用 0.1 M 新鲜制备的磷酸盐缓冲液 (PB) 中的 10% 福尔马林固定剂通过左心室(体内)并切断右心房以允许血液流出[ 14 ]。福尔马林固定剂通过 50 mL 大小注射器的钝头针头注射到左心室(2 只小鼠/组),以避免心脏损伤,并对 LM 和 TEM 进行公正的实验。
2.6. 实验方法
通过混合两种不同的酸性和碱性原硫酸钠盐化合物,新鲜制备 0.1 M、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液 (PB):1) Na 2 HPO 4 ∙2H 2 O 和 2) Na 2 HPO 4 [ 15 ]。每次在之前的实验中制备新鲜制备的 10% 福尔马林,将 10 gm 甲醛溶解在 100 mL 煮沸的蒸馏水中,然后与等量的 0.2 M PB 混合,使最终摩尔浓度降至 0.1 M PH 7.4 [ 16 ] . 然后将肝脏样本置于相同的固定剂中,在室温下过夜固定(固定后),并进行常规组织学方法处理 [ 17 ]。升系列乙醇(C2 H 5 OH) 酒精浓度(即 50%、70%、90%)在实验室中由新鲜的 100% 无酒精水制备,以对样品进行脱水。在整个工作中使用新鲜石蜡包埋肝脏样本。用明胶铬明矾白蛋白 (CAA) 清洗载玻片并涂上载玻片,以保证切片粘在载玻片上。从每个块上切下 5 µm 的薄切片,并使用水浴拉伸切片,然后收集到干净的载玻片上。然后对石蜡切片进行常规光学显微镜处理,然后进行 DPX 处理并使用 Olympus 光学显微镜进行检查。
2.7. 透射电子显微镜 (TEM)
每组中的两只动物在牢固固定的玻璃室内使用浸有氯仿的组织布进行麻醉。然后立即解剖麻醉的动物;非常注意打开胸部以避免任何可能影响实验的出血。然后使用安装在 20 mL 尺寸注射器上的切端针头将 PH 7.4 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液 (PB) 中的近 20 mL 2.5% 戊二醛固定剂灌注到左心室。右心房被切开,让血液冲出被冲洗掉,并用固定剂代替[ 15 ]。用相同的固定剂冲洗肝脏,以保证更好的固定并消除任何细微的伪影机会。几个小1毫米3切下多块肝脏样本,并将其保存在小罐子内的相同固定剂中,以便在冰箱内过夜后固定。次日,用相同的 PB 冲洗肝脏样本(3 × 10 分钟),并在相同的 PB 中用 1% 四氧化锇 (OsO 4 ) 的二级固定剂固定 2 小时。然后用 PB 清洗样品(3 × 5 分钟),然后在摇床上用蒸馏水清洗(3 × 10 分钟)。然后使用从 30%、50% 和 70% 开始的逐渐上升的乙醇溶液对样品进行脱水,每次 20 分钟,然后在 100% 中脱水 1 小时(2 次变化)。
然后使用环氧丙烷清洗样品一小时(2 次更换),然后在 TAAB 树脂-环氧丙烷上升混合物(1:3、2:2 然后 3:1)中浸渍,然后将它们转移到新鲜的 100% TAAB 中,然后在一个烤箱在适当的塑料模具中固定在 65°C 温度下 28 小时。然后修剪样品,并使用 Reichert Ultramicrotome 通过玻璃刀切割 70 - 90 nm 之间的超薄切片。样品用雷诺染色剂染色 20 分钟,即在使用 Millipore 过滤器过滤后的 5% 酒精醋酸铀酰,在黑色的培养皿中,以避免光与染色剂的反应和在组织上形成沉淀物 [ 18] . 随后在配有牙科蜡的培养皿中用蒸馏水滴小心地冲洗样品(3 × 3 分钟)。
然后将样品移入另一个涂有牙科蜡的培养皿中,并用柠檬酸铅染色(使用安装在注射器上的 Millipore 过滤器过滤后)再染色 20 分钟。氢氧化钠 (NaOH) 颗粒用于避免在超薄样品上形成和沉淀碳酸铅。然后使用飞利浦 TEM 检查后者,并相应地拍摄肝组织的校准照片。
3. 结果
3.1。对照组织
小鼠的对照肝组织展示了覆盖整个肝脏的薄结缔组织纤维囊,其连接板是通过将肝细胞的数千个立方上皮细胞分组为壁的板状砖,产生围绕中央静脉呈放射状排列的板[图1(a)]。在一些肝细胞的细胞质内偶尔可见中央静脉周围的小空泡[图1(b)]。在实质细胞内未检测到淋巴结结节和扩散淋巴细胞。从中心到外围,肝细胞分支的辐射板形成了一种相当海绵状的结构,其中重要的微血管成分正弦波确实平行于板延伸,在它们之间留下空间以供血液自由流动。肝细胞结构健康完整,无肝细胞零星坏死。
(一)(二)
图 1。(a) 和 (b) 对照小鼠肝脏切片,中央静脉(白色箭头)、三联征、完整的血窦和围绕中央静脉呈放射状分布的肝板 (H & E ×240) [ 1 ];A 40 mg/Kg b.wt. APM 肝组织显示中央静脉(黑色长箭头)周围的早期浸润(黑色短箭头);实质组织细胞质中的小脂肪滴,细胞外基质(白色箭头)和成纤维细胞(H & E ×480)中散布白细胞 [ 2 ]。
3.2. 用 40 gm/Kg 体重剂量处理的肝组织
几乎所有肝细胞都表现出门静脉和肝实质(小叶)轻度扩张,伴有慢性炎症细胞,包括淋巴细胞和巨噬细胞。与对照相比,脂肪滴在其细胞质中的早期发育是指明显的脂肪浸润,以及中央静脉周围淋巴滤过的轻度分布[图 1 (b)]。门静脉可见轻度炎性细胞浸润。血窦表现出轻度扩张,含有红细胞的显着血管,胶原纤维沉积没有增加。
3.3. 用剂量 500 gm/Kg 体重治疗的肝组织
与最低剂量相比,病变的严重程度有所增加,通过中央静脉周围的炎症细胞浸润,形成向肝实质延伸的巨细胞(小叶浸润)。中央静脉周围白细胞浸润显着增加,早期淋巴滤泡发育,而脂肪滴在此阶段也继续增加。门静脉有轻度炎性细胞浸润和血管扩张;以及在中央静脉周围形成各种 WBC(图 2 (a) 和图 2 (b))。
3.4. 用剂量 1000 gm/Kg 体重治疗的肝组织
随着脂肪滴的进一步增加,影响的严重程度随着剂量的增加而增加;肝细胞的早期坏死始于一些肝细胞的细胞核丢失和细胞内基质的早期增加。门静脉内的静脉轻度扩张,伴有微细小管模式的一些脂肪变化以及无胆管周围的炎症细胞非常少[图3(a)]。
3.5. 用剂量 1500 gm/Kg 体重治疗的肝组织
中央静脉周围和细胞内基质之间的淋巴滤泡明显增加(图3(b))。进一步的 WBC 浸润
(一)(二)
图 2。(a) 和 (b) 第 II 组 (500 mg/Kg b.wt. APM) (a)。表明白细胞浸润增加,尤其是中央静脉 (cv) 周围的白细胞浸润和早期淋巴滤泡的发育(白色箭头)。还要注意双核肝细胞的增加和某些肝细胞的细胞核增大(弯曲箭头)(H & E ×480)[ 3 ];WBC 浸润增加,尤其是门静脉周围(黑色长箭头)以及早期受损肝细胞的发育(白色小箭头)[H & E ×550] [ 4 ]。
(一)(二)
图 3。(a) 和 (b) 第 III 组 (1000 mg/Kg b.wt. APM) 显示 WBC 在三联征和无胆管周围的一些炎症细胞浸润。肝细胞早期坏死,部分肝细胞核缺失,细胞内基质(白色箭头)和细胞质脂肪滴早期增加(H & E ×480);(b):IV 组 (1500 mg/Kg b.wt. APM) 显示中央静脉周围和细胞内基质之间的扩散淋巴滤泡发育(白色箭头)。一些坏死的肝细胞核丢失(弯曲箭头)和中央静脉内皮上皮的一些损伤(黑色箭头)。
中央静脉和细胞内基质之间通过细胞核丢失可见坏死肝细胞增多。与早期阶段相比,可以检测到细胞质内脂肪滴的进一步增加和肝实质细胞内基质的早期增加以及中央静脉内皮层的偶尔损伤。门静脉显示扩张的静脉含有红细胞和其他血管周围的一些炎症细胞。一些偶发性凋亡细胞丢失其细胞核,即静脉周围的嗜酸性小球也很明显。
3.6. 对照小鼠肝细胞的超微结构
对照小鼠肝细胞的超微结构外观显示核膜和细胞质膜的整合结构,每个单独的肝细胞显示单个圆形核,通常位于中央。染色质呈颗粒状,在细胞核周围有凝聚的异染色质,核仁更均匀,电子密度高,粗面内质网(RER)通常与核膜平行排列,而线粒体呈圆形拉长并与RER相关。肝细胞的线粒体具有典型的同质群体,具有经典的超微结构,包含很少的嵴和致密的基质。不同大小的细胞质空泡分布在整个细胞质中(图4(a))。
3.6.1. 用 40 mg/Kg 体重 APM 治疗的小鼠肝组织
与对照相比,出现了一些超微结构变化。在一些具有最低剂量 APM(40 mg/Kg 体重)的肝细胞中通过松散的细胞质结构观察到了早期解体迹象,而细胞质细胞器(即线粒体、RER、高尔基体)以及内含物(即糖原分子)在此时仍然完好无损阶段。这
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图 4。(a) 和 (b) 具有完全整合的肝组织结构、球形核、完整的核膜和完整的内部细胞质细胞器的对照小鼠的电子显微照片。两个相邻的肝细胞在细胞质内可见散在的糖原颗粒;(b):用 40 mg/Kg b.wt 处理的肝细胞的一部分细胞质显示出一些早期崩解迹象 (×4000)。
内皮细胞没有显示出损伤的超微结构迹象(图4(a))。有时,检测到一些 WBC(淋巴细胞)显示出超微结构变化,即由于线粒体破裂导致的液泡积聚(图 4(b))。
3.6.2. 用更高剂量 (500 - 1500 mg/Kg 体重 APM) 治疗的肝组织
几乎所有肝细胞的早期解体迹象都通过脂褐质和脂肪滴以及一些破裂的线粒体的发展而明显。这些迹象是肝细胞特有的,剂量为 500 - 1500 mg/Kg b.wt(图 5 (a) 和图 5(b))。500 mg/Kg 体重处理的小鼠,核周围的细胞质细胞器具有完整的结构,核膜完整;然而,细胞质的外缘显示线粒体受损和脂肪滴发育。用 1000 mg/Kg 体重的 APM 处理的肝细胞的细胞质显示,除了各种大小的破裂线粒体外,在靠近仍然完整的核膜的地方形成了小尺寸的脂肪滴簇。在最高剂量时,肝细胞的细胞质主要含有增加的脂肪滴和更多的线粒体,而 RER 和糖原分子不受影响(图 6 (a) 和图 6(b))。在这个阶段,只有一些细胞核在其核膜中表现出不规则性,而糖原分子仍然不受影响。
4。讨论
现在几乎不可能做到完全不含甜味剂和/或其他添加剂的饮食[ 19 ]。从工业目的来看,由于生活方式的发展,添加剂已不可避免地成为完成一些任务的必需品,即延长保质期和改善风味、颜色和质地或使食品变甜(天然营养和人工非营养),其中包括抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、着色剂、香料、乳化剂和甜味剂 [ 20 ]。这导致在我们的日常生活中扩大使用一些日常食用的食物,即 APM
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图 5。(a) 和 (b) 用 500 mg/Kg b.wt 处理的肝细胞的细胞质显示核周边缘的细胞质细胞器的超结构,其具有完整的核膜结构;然而,外缘显示出对线粒体的损害和脂肪滴(FD)的发展。
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图 6。(a) 和 (b) 用 1500 mg/Kg 体重的阿斯巴甜处理的肝细胞的细胞质切片。注意脂肪滴和一些线粒体的分解,而 RER 和糖原分子不受影响。然而,细胞核表现出不规则,而其膜。
反过来,对人类健康造成额外风险。结果和结论相互矛盾,导致两个不同的对立学校,其中一个支持 APM 的安全消费,而另一个反对。然而,后者受两个主要因素的支配,即进行这些研究的各种场景以及每年发财的制造商的商业贪婪。无论如何,它已被宣布安全并被医生推荐给几乎世界各地的糖尿病患者。
Schlatter 和合著者对 7 只喂食阿斯巴甜和牛奶的婴儿猴子进行的一项早期研究表明,高剂量组没有摄入预期水平的 APM,从而得出结论,高剂量组实际上摄入的阿斯巴甜大约与中等剂量组一样多-剂量组 [ 21] . 幸运的是,这可能表明身体有能力吸收一定限度的 APM 剂量,而更高的剂量可能会以某种方式从身体排出或/和变得无害。在光镜水平下,肝细胞中细胞质的空泡状外观是指脂肪滴在细胞质中的积累以及对一些线粒体的损害,在本研究中,这似乎是剂量依赖性的。其他细胞器即核膜、糖原液滴、光滑内质网(SER)和粗面内质网(RER)、高尔基体几乎完好无损。线粒体退化可能已经发生,这被解释为缺乏能量[ 18 ]。
脂肪分解成产生能量的化学物质是肝脏通过线粒体机制的强制性代谢结果。当线粒体因阿斯巴甜中毒而出现缺陷时,脂肪就不能被加工成能量储存器。由于脂肪直接在细胞的胞质溶胶中积累,脂肪的形成不依赖于线粒体功能 [ 22 ]。] . 因此,随着脂肪细胞(脂肪细胞)在肝细胞中的储存,尽管需要多么严重地为身体提供能量,但仍无法摆脱它们。这些受害者实际上无法让他们体内的脂肪饿死,也无法将它们从肝脏中取出,因为他们的线粒体功能能力受损,导致情况变得更糟,因为线粒体 DNA 将受到严重损害。作为甲基自由基强制代谢的直接结果而发生的甲醇/甲醛中毒是最常见的遗传损伤形式,由 DNA 菌株的甲醛交联引起。线粒体 DNA 比核 DNA 脆弱数千倍,并且缺乏保护核 DNA 完整性的出色修复机制。23 ] [ 24 ]。
此外,它会产生不充分和不完全的能量代谢,从而导致高度破坏性的自由基产生,其中甲醇/甲醛中毒为此而著称 [ 25 ]。所有这些代谢物都会影响线粒体的功能,最终导致肝细胞有缺陷。从长远来看,这种缺陷会导致脂肪滴的积累、空泡形成,甚至可能导致肝硬化。本研究中的脂肪滴可能代表这些缺陷的开始,这些缺陷已通过 TEM 显微照片得到证实。
本研究中的结果揭示了 APM 对小鼠肝脏组织的短期影响,小鼠肝脏的组织学结构显示肝细胞呈条索状排列,类似于在许多其他哺乳动物中发现的情况 [ 26 ]。在实验动物的肝组织中已经诱导了一些形态学变化。给予低剂量(40 mg/Kg b.wt)和 3 个高剂量(500 - 1500 mg/Kg b.wt)APM 的小鼠肝脏切片的组织学检查显示,门静脉三联体浸润有单核炎症细胞,主要是淋巴细胞和巨噬细胞。这一发现与用糖精治疗的大鼠 [ 27 ] 和 [ 28 ] 一致。] 在老鼠身上。然而,后者使用不同的剂量(65 和 260 mg/Kg b.wt)和更长时间(30 周),但发现了相似的结果,即肝细胞肥大,细胞质中的过度空泡化。尽管使用的剂量不同,但目前结果中的轻微细胞变化可能表明与以前的工作相比肝细胞的早期变化。也可以解释为肝细胞中的细胞变化可能与剂量和时间有关。这与肝脏在 APM 代谢中的作用相一致,导致细胞代谢紊乱并导致形态异常。
在急性酒精性肝病(酒精性肝肝炎)中,肝活检的细胞质中有大的脂肪滴。在几乎所有剂量的小鼠肝脏中,显着的脂肪肝浸润与酒精性肝病相似 [ 29 ]。这些脂滴可能聚集并变得非常大或丰富,储存脂肪的细胞类似于脂肪细胞 [ 22 ]。例如,在光学显微镜切片中看到的液泡表明脂肪滴的形成,这些脂肪滴可能在组织加工过程中溶解出来,留下空洞。类似地,在“脂肪性肝炎”中,由于摄入阿斯巴甜导致肝细胞中脂肪的积累,其特征是集中在线粒体中 [ 30] . 线粒体是细胞的能量炉,阿斯巴甜代谢导致线粒体内产生更多毒性衍生物、甲醛和甲酸。与所有 NutraSweet 中毒一样,甲醛和甲酸会立即攻击它们产生的组织,因此随着免疫系统对“脂肪性肝炎”的反应,可能会同时产生一种新的“抗线粒体抗体肝炎”瘟疫。退化的组织 [ 31 ]
尽管所进行的实验方法有所不同 总之,肝细胞中细胞质细胞器的破坏、脂肪滴的积累、线粒体内的空泡化或线粒体破裂可能是由于 APM 通过血液的毒性作用。这将导致肝脏作为体内过滤器官的功能障碍,最终可能导致肝硬化和其他肝脏疾病。
5. 结论
结论是,所有剂量的 APM 对肝细胞都有急性影响,因此对肝脏的一般功能有影响,即对肝细胞的剂量依赖性破坏、淋巴细胞的发展和肝细胞的坏死可能反过来导致对肝脏的进一步损害从长远来看。需要进一步的长期实验来研究 APM 对体内这两种重要组织的破坏作用。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
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