摘要:目的:在病理组织抗酸染色实验中,采用硫酸和盐酸对染色结果进行评价,以获得最佳染色方法。方法:采用硫酸分化液和盐酸分化液,比较已知含有结核分枝杆菌的病理组织石蜡切片的染色效果。结果:用0.5%盐酸分化液,分化时间为6s时,染色效果优于硫酸分化液。
关键词
耐酸染色、硫酸、分化液、染色效果、盐酸
1.简介
结核病是一种全身性慢性传染病。近年来,其发病率在全世界呈上升趋势,引起了世界卫生组织的关注[1][2][3]。结核分枝杆菌(TB)是导致这种疾病的病原体,主要侵犯肺部、淋巴结和肾脏。在显微镜下,大多数是细长弯曲的杆,长度不均匀,分散的单杆或平行簇,有时分支[4][5][6]。目前常用的结核病检测方法有Ziehl Neelsen抗酸染色、实时荧光定量PCR和ISH等。虽然目前组织病理学已发展到分子病理学,但许多疾病可以通过免疫组织化学和分子生物学技术进行诊断,抗酸染色在临床病理诊断中仍占有重要地位,其优点是高效、经济[7]。结果表明,抗酸杆菌的传统染色方法是Ziehl-Neelsen法,即用碱性品红和苯酚进行染色,然后Wade Fite在此基础上进行了改进。本文采用硫酸溶液和盐酸溶液对耐酸杆菌进行区分,使染色结果更清晰,对比度更尖锐。
2.实验方法
实验材料:收集2018年12月至2020年11月中山大学第七附属医院病理科病例,选取10例已知含有结核分枝杆菌的病理组织,经固定脱水制成组织蜡块。
主要仪器设备:脱水机(HP300,中国达科他州)、医用冰箱(HYC-356,青岛海尔)、切片机(RM2235,德国徕卡)、烤箱(BPG-9070A,上海恒科仪器有限公司)、湿箱。
实验试剂:TO生物透明剂、苯酚碱性品红、0.5%硫酸溶液、0.5%盐酸溶液、迈尔苏木精、二甲苯、中性胶。
实验方法:将10例蜡块连续切成2片,随机分为A组和C组,分别用0.5%盐酸溶液和0.5%硫酸溶液对应A组和C组。
耐酸染色的实验步骤
1) 将病理石蜡切片,厚度为5 um,放入烤箱中烤60分钟;
2) 将切片放入两个TO生物透明剂筒中,每个筒脱蜡20分钟;
3) 用吸水纸轻轻吸收玻片上的活性剂,将其放入80℃的热水中,上下提起10次以上;
4) 用自来水冲洗10分钟;
5) 加入苯酚碱性品红20分钟,放入培养箱中,注意不要干燥;
6) 将0.5%盐酸溶液和0.5%硫酸溶液分别滴入A组和C组6秒;
7) 用自来水冲洗10分钟;
8) 迈耶苏木素染色1分钟;宠物名红宝石水冲洗10分钟;烘箱干燥20分钟,透明二甲苯,用中性胶密封。
3.评分标准
双盲计分,得10分;抗酸杆菌阳性染色程度强,结构清晰,与周围组织对比强烈,背景干净,每项指标10分;切片组织染色效果一般,但不影响诊断,扣1-3分;切片组织染色效果差,结构模糊,对诊断有一定影响的,扣4-7分;如果染色效果很差,组织结构无法识别,严重影响诊断结果,扣8-10分。
4.统计处理
所有统计处理均在SPSS13.0软件中进行。用方差齐性分析A组和C组的得分,并用T检验选择两个独立样本进行比较。检验水平为α=0.05,P<0.05被视为具有统计学意义的标准。
5.结果
A组得分(9.20+0.79);C组得分(0.50+0.53);0.5%盐酸溶液的耐酸染色效果明显优于0.5%硫酸溶液,阳性度强,结构清晰,背景干净,差异有统计学意义(t=−10.077,P<0.005)(图1和图2)。
6.讨论
抗酸杆菌的细胞壁含有脂类,糖脂与酚碱性品红结合形成化合物,形成蜡状外壳。这
图1.A组中0.5%盐酸分化液分化6s,箭头为结核分枝杆菌(标度100μm)。
图2 C组:0.5%硫酸分化液,分化6s(刻度100μm)。
化合物与细菌结合后能抵抗酸的脱色,使耐酸杆菌呈红色。苯酚作为媒染剂,能促进细菌与碱性品红的结合,有助于碱性品红溶解。盐酸和硫酸是分化溶液,可以对其他组织进行脱色,而不会对染色后的抗酸细菌进行脱色[8][9]。结核呈小杆状,抗酸染色,需在100×高倍显微镜下观察。有时,肺结核病灶很少见。因此,染色的阳性程度和清晰的背景对比度对临床诊断至关重要。在本实验中,作者做了以下改进:
1) 常规石蜡切片为3um,但结核分枝杆菌染色厚度为5um。由于切片太薄,结核分枝杆菌会被切碎,在显微镜下会变成碎屑,不利于观察和判断;
2) 在本实验中,对生物剂松节油进行脱蜡,然后用温水清洗。与传统的二甲苯脱蜡法相比,它能更好地保存结核分枝杆菌。抗酸杆菌的耐酸性来自其脂质细胞壁。二甲苯和乙醇可以溶解脂质,破坏细胞壁,导致抗酸杆菌减少甚至消失。
3) 选择合适的鉴别溶液,严格控制鉴别时间。在传统操作中,硫酸溶液常被用作抗酸菌染色试剂盒中的分化剂。然而,在实际操作中,发现分化时间不易控制,整个病理切片仅分化几秒钟后就变白,显微镜下观察到的抗酸菌阳性率极低。因此,本实验使用0.5%盐酸分化液,时间控制在6s,以便在显微镜下观察分化状态,获得最佳的抗酸菌染色程度。
7.结论
与A组和C组的实验结果相比,发现用0.5%硫酸溶液鉴别组织切片的时间太快,而且很难掌握操作,常常导致分化过度,阳性程度减弱,甚至影响诊断结果。用0.5%盐酸溶液进行分化,时间易于控制,有足够的时间在显微镜下观察分化程度,并在适当的时间停止,使染色阳性程度更强,组织结构对比清晰,更有利于显微镜诊断。
利益冲突
作者声明,本论文的出版不存在利益冲突。
工具书类
[1] Li,X.,Qing,Q.和Li,D.F.(2015)荧光染色和钐-尼罗河染色在检测结核分枝杆菌中的效果评估。国际实验室医学杂志,36745-746。
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[5] Kevin,Z,Hu,Z.J.和Zhang,C.L.等(2016)基底膜染色方法比较及其在胃发育不良和胃腺癌中的应用。中国组织化学与细胞化学杂志,25169-173。
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[7] Yang,Q.L.(1991)硫酸-乙醇法合成硫酸二乙酯。辽宁化工,22,22-24。