摘要：目的：在病理组织抗酸染色实验中，采用硫酸和盐酸对染色结果进行评价，以获得最佳染色方法。方法：采用硫酸分化液和盐酸分化液，比较已知含有结核分枝杆菌的病理组织石蜡切片的染色效果。结果：用0.5%盐酸分化液，分化时间为6s时，染色效果优于硫酸分化液。
关键词
耐酸染色、硫酸、分化液、染色效果、盐酸
1.简介
结核病是一种全身性慢性传染病。近年来，其发病率在全世界呈上升趋势，引起了世界卫生组织的关注[1][2][3]。结核分枝杆菌（TB）是导致这种疾病的病原体，主要侵犯肺部、淋巴结和肾脏。在显微镜下，大多数是细长弯曲的杆，长度不均匀，分散的单杆或平行簇，有时分支[4][5][6]。目前常用的结核病检测方法有Ziehl Neelsen抗酸染色、实时荧光定量PCR和ISH等。虽然目前组织病理学已发展到分子病理学，但许多疾病可以通过免疫组织化学和分子生物学技术进行诊断，抗酸染色在临床病理诊断中仍占有重要地位，其优点是高效、经济[7]。结果表明，抗酸杆菌的传统染色方法是Ziehl-Neelsen法，即用碱性品红和苯酚进行染色，然后Wade Fite在此基础上进行了改进。本文采用硫酸溶液和盐酸溶液对耐酸杆菌进行区分，使染色结果更清晰，对比度更尖锐。
2.实验方法
实验材料：收集2018年12月至2020年11月中山大学第七附属医院病理科病例，选取10例已知含有结核分枝杆菌的病理组织，经固定脱水制成组织蜡块。
主要仪器设备：脱水机（HP300，中国达科他州）、医用冰箱（HYC-356，青岛海尔）、切片机（RM2235，德国徕卡）、烤箱（BPG-9070A，上海恒科仪器有限公司）、湿箱。
实验试剂：TO生物透明剂、苯酚碱性品红、0.5%硫酸溶液、0.5%盐酸溶液、迈尔苏木精、二甲苯、中性胶。
实验方法：将10例蜡块连续切成2片，随机分为A组和C组，分别用0.5%盐酸溶液和0.5%硫酸溶液对应A组和C组。
耐酸染色的实验步骤
1） 将病理石蜡切片，厚度为5 um，放入烤箱中烤60分钟；
2） 将切片放入两个TO生物透明剂筒中，每个筒脱蜡20分钟；
3） 用吸水纸轻轻吸收玻片上的活性剂，将其放入80℃的热水中，上下提起10次以上；
4） 用自来水冲洗10分钟；
5） 加入苯酚碱性品红20分钟，放入培养箱中，注意不要干燥；
6） 将0.5%盐酸溶液和0.5%硫酸溶液分别滴入A组和C组6秒；
7） 用自来水冲洗10分钟；
8） 迈耶苏木素染色1分钟；宠物名红宝石水冲洗10分钟；烘箱干燥20分钟，透明二甲苯，用中性胶密封。
3.评分标准
双盲计分，得10分；抗酸杆菌阳性染色程度强，结构清晰，与周围组织对比强烈，背景干净，每项指标10分；切片组织染色效果一般，但不影响诊断，扣1-3分；切片组织染色效果差，结构模糊，对诊断有一定影响的，扣4-7分；如果染色效果很差，组织结构无法识别，严重影响诊断结果，扣8-10分。
4.统计处理
所有统计处理均在SPSS13.0软件中进行。用方差齐性分析A组和C组的得分，并用T检验选择两个独立样本进行比较。检验水平为α=0.05，P<0.05被视为具有统计学意义的标准。
5.结果
A组得分（9.20+0.79）；C组得分（0.50+0.53）；0.5%盐酸溶液的耐酸染色效果明显优于0.5%硫酸溶液，阳性度强，结构清晰，背景干净，差异有统计学意义（t=−10.077，P<0.005）（图1和图2）。
6.讨论
抗酸杆菌的细胞壁含有脂类，糖脂与酚碱性品红结合形成化合物，形成蜡状外壳。这
图1.A组中0.5%盐酸分化液分化6s，箭头为结核分枝杆菌（标度100μm）。
图2 C组：0.5%硫酸分化液，分化6s（刻度100μm）。
化合物与细菌结合后能抵抗酸的脱色，使耐酸杆菌呈红色。苯酚作为媒染剂，能促进细菌与碱性品红的结合，有助于碱性品红溶解。盐酸和硫酸是分化溶液，可以对其他组织进行脱色，而不会对染色后的抗酸细菌进行脱色[8][9]。结核呈小杆状，抗酸染色，需在100×高倍显微镜下观察。有时，肺结核病灶很少见。因此，染色的阳性程度和清晰的背景对比度对临床诊断至关重要。在本实验中，作者做了以下改进：
1） 常规石蜡切片为3um，但结核分枝杆菌染色厚度为5um。由于切片太薄，结核分枝杆菌会被切碎，在显微镜下会变成碎屑，不利于观察和判断；
2） 在本实验中，对生物剂松节油进行脱蜡，然后用温水清洗。与传统的二甲苯脱蜡法相比，它能更好地保存结核分枝杆菌。抗酸杆菌的耐酸性来自其脂质细胞壁。二甲苯和乙醇可以溶解脂质，破坏细胞壁，导致抗酸杆菌减少甚至消失。
3） 选择合适的鉴别溶液，严格控制鉴别时间。在传统操作中，硫酸溶液常被用作抗酸菌染色试剂盒中的分化剂。然而，在实际操作中，发现分化时间不易控制，整个病理切片仅分化几秒钟后就变白，显微镜下观察到的抗酸菌阳性率极低。因此，本实验使用0.5%盐酸分化液，时间控制在6s，以便在显微镜下观察分化状态，获得最佳的抗酸菌染色程度。
7.结论
与A组和C组的实验结果相比，发现用0.5%硫酸溶液鉴别组织切片的时间太快，而且很难掌握操作，常常导致分化过度，阳性程度减弱，甚至影响诊断结果。用0.5%盐酸溶液进行分化，时间易于控制，有足够的时间在显微镜下观察分化程度，并在适当的时间停止，使染色阳性程度更强，组织结构对比清晰，更有利于显微镜诊断。
利益冲突
作者声明，本论文的出版不存在利益冲突。
工具书类
[1] Li，X.，Qing，Q.和Li，D.F.（2015）荧光染色和钐-尼罗河染色在检测结核分枝杆菌中的效果评估。国际实验室医学杂志，36745-746。
[2] Wang，D.T.和Dong，J.Q.（2012）《实用现代病理技术》。北京协和医科大学出版社，北京，133-134。
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[5] Kevin，Z，Hu，Z.J.和Zhang，C.L.等（2016）基底膜染色方法比较及其在胃发育不良和胃腺癌中的应用。中国组织化学与细胞化学杂志，25169-173。
[6] Liang，Y.J.，Ling，Q.B.和Wei，Z.（2011）《临床病理技术》。人民医学出版社，北京，116-118。
[7] Yang，Q.L.（1991）硫酸-乙醇法合成硫酸二乙酯。辽宁化工，22，22-24。