摘要：本研究旨在评估桑树品种 PR-01 中的花青素提取物( MAEs ) 对N-亚硝基二乙胺(NDEA) 诱导的大鼠肝癌发生的预防作用。发现150 mg·kg - 1 MAEs治疗与模型组相比，NDEA诱导的肝结节发生率和肝细胞癌发生率显着降低58.30%和41.70%。同时，MAEs显着恢复升高的肝功能酶，抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平，升高血清白细胞介素10和干扰素-γ ，增加肝谷胱甘肽-S-转移酶和UDP-葡萄糖醛酸转移酶2B1酶活性。此外，150 mg·kg -1 MAEs补充剂增强了谷胱甘肽含量和超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性，但降低了丙二醛和硫代巴比妥酸反应物含量37.90%和44.52%。此外，MAEs预处理维持核因子红细胞2相关因子2 （Nrf2）、Kelch样ECH相关蛋白1、血红素加氧酶1和NAD（P）H：奎宁氧化还原酶1刺激并抑制TNF -α的表达，核因子-kappaB (NF- κ B) 和环氧合酶-2 (COX-2)，表明 MAE 通过减少脂质过氧化、诱导 Nrf2 介导的抗氧化酶和减弱炎症介质 COX-2 表现出有效预防肝癌的作用通过NF-κB途径。因此，桑树品种 PR-01 的 MAE 可用作抗肝癌的良好功能性膳食补充剂。
表 1。用于 qRT-PCR 分析的引物序列。
表 2。研究的实验设计。
表 3。MAEs 对 NDEA 诱导的肝癌发生大鼠体重、采食量和肝脏指数的影响。
表 4。MAEs对NDEA致肝癌大鼠血清肝酶的影响。
表 5。MAEs对NDEA诱导的肝癌发生大鼠肝脏肿瘤相关病变的影响。
表 6。MAEs对NDEA致肝癌大鼠肝脏TBARS及相关抗氧化酶活性的影响。
表 A1。桑树花青素单体的结构鉴定。
关键词
桑椹 ( Morus alba L.) 花青素提取物, N-亚硝基二乙胺,肝癌,抗氧化,抗炎
一、简介
根据组织学分类，原发性肝癌可分为肝细胞癌（HCC）、胆管癌和混合性肝癌，其中以HCC最为常见[ 1 ][ 2 ]。尽管早期 HCC 的临床诊断和治疗有显着改善，但晚期 HCC 是一种高度侵袭性的肿瘤，对常规治疗反应不佳或无反应 [ 3 ] [ 4 ]。因此，寻找预防肝癌的有效途径或措施迫在眉睫。
在过去的几十年里，饮食研究表明，经常食用水果和蔬菜可以降低患心脏病和癌症等慢性疾病的风险 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]。有色果蔬食品中含有丰富的花青素，包括花青素-3-葡萄糖苷(C3G)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(P3G)、锦葵素-3-葡萄糖苷(M3G)、牡丹苷-3-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-葡萄糖苷和delphinidin-3-galacside 等 [ 8 ] [ 9 ]。流行病学和实验室数据表明，花青素具有许多生物活性，如抑制癌细胞生长、改善免疫反应 [ 7 ] [ 10 ]、减少心血管疾病 [...11 ]，并促进抗肥胖作用 [ 12 ]。
桑椹 (Morus alba L.) 果实因其抗氧化、抗炎、保肝、抗糖尿病等药理作用而历来被用于中药中[ 13 ]。桑椹富含花青素（桑品种中花青素含量为11.20 mg·100g − 1 - 193.00 mg·100g − 1），其中C3G和氰化3-芸香苷（C3R）已被证明对依赖性地抑制A549人肺癌细胞的迁移和侵袭[ 14 ]。严等人。[ 15] 表明桑树花青素提取物通过丝裂原活化蛋白激酶和核因子红细胞 2 相关因子 2 (Nrf2) 途径改善 HepG2 细胞的氧化损伤并延长秀丽隐杆线虫的寿命。李，等人。[ 10 ]报道桑葚花青素对四氯化碳引起的肝纤维化有很强的保护作用。此外，最近研究表明，桑椹提取物可以增加肝脏抗氧化蛋白的表达，加速硝基酚的代谢和排泄，对壬基酚诱导的大鼠进行解毒[ 6 ]] . 上述研究结果表明，桑椹花青素可能具有通过抗炎、解毒和化学保护作用降低癌症风险的潜在作用。然而，桑花花青素在体内的抗癌活性和潜在的抗癌机制尚未得到很好的阐明。
在前期工作中，我们发现黑桑果中花青素含量丰富，尤其是桑树新品种PR-01，其花青素含量为193.00 mg·100g -1，是普通品种（19.00）的10.16倍。毫克・100g -1 ) [ 16 ]。因此，本研究旨在确定桑树品种PR-01果实中桑葚花青素提取物(MAEs)的成分，探讨其对N-亚硝基二乙胺(NDEA)诱导的大鼠肝癌发生的预防作用及其可能机制。
2。材料和方法
2.1。材料和化学品
新鲜成熟的桑葚品种 PR-01 果实于 2016 年 5 月从福建农林大学（中国福建）农产品质量研究所获得，并于同一天在 -80℃ 下储存。
所有化学品均从 Sigma-Aldrich（中国上海）或北京鼎国昌盛生物科技有限公司（中国北京）订购。TRIzol 试剂、用于 qPCR 的 HiScript II Q RT SuperMix（+cDNA Wiper）和 AceQTM qPCR SYBRR Green Master Mix 购自 Takara Co., Ltd.（中国大连）。兔多克隆抗体核因子-kappaB (NF-κB)、环氧合酶-2 (COX-2)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、Kelch 样 ECH 相关蛋白 1 (Keap1)、NAD(P)H：奎宁氧化还原酶 1 (NQO1)、血红素加氧酶 1 (HO-1) 和 Nrf2 购自 Santa Cruz Biotechnology 或 Cell Signaling (Danvers, MA, US)。
2.2. 桑椹花青素提取物的制备
PR-01 桑椹花青素富集提取物如前所述 [ 17] . 冷冻桑葚果实在 ALPHA 1-2LD PLUS 冻干机（中国北京）中干燥，然后研磨并过筛以均质并储存在 -80˚C。将磨细的桑葚（3 kg）用 300 L 甲醇-盐酸（999:1）在 37°C 下在超声波功率 200 w 和频率 40 kHz 的条件下提取 30 分钟。该过程连续重复三次。然后将提取物混合并使用 RE-2000E 旋转蒸发仪（西安泰康生物科技有限公司，中国西安）蒸发成糖浆。将糖浆溶解在 1000 mL 的 0.01 mol/L HCl 中，并用 1200 mL 乙酸乙酯脱脂。水溶液经过 Amberlite XAD-7 的柱层析，用水和甲醇-甲酸 (9:1) [ 18 ] [ 19 ] 有序洗脱] . 将甲醇-甲酸洗脱溶液蒸发成糖浆并冷冻干燥，得到 403 g MAE。MAE 储存在 -80˚C 以供进一步使用。
2.3. 总花青素含量的pH差法分析
参考之前的研究 [ 20 ]，MAE 分别用 pH 1.0 和 pH 4.5 的盐酸-氯化钠稀释 10 倍。MAEs 稀释剂的吸光度分别用 755b 紫外-可见分光光度计（Xi'an Heb Biotechnology Co., Ltd, Xi'an, China）在 520 nm 和 700 nm 波长处测量。吸光度 (A) 由公式 (1) 计算：
A = (A520 nm - A700 nm) pH 1.0 - (A520 nm - A700 nm) pH 4.5 (1)
根据 Wrolstad 等人 推导出的公式计算 MAE 的总花青素含量。[ 21 ]：
总花青素含量（mg·g -1）= A × MW× D F× V× 1000ε × 1 × M(2)
其中 MW 是 cyclamine-3-glucoside (449.2) 的分子量，DF 是稀释度，ε 是摩尔吸光度 (29,600)，l 是光程 (1.0 cm)，V 是 MAEs 稀释剂的总体积 (1.0 ml), M (0.01 g) 是 MAE 的重量。
2.4. 花青素的电喷雾电离质谱 (ESI-MS) 和超高效液相色谱 (UPLC) 分析
花青素单体的定量在 LC-MS/MS（Thermo Fisher Scientific Inc., SAN JOSE, CA）上以 MRM 模式进行。LC-MS 分析使用由 LC（2010，Finnigan，USA）和 LCQ Fleet 离子阱 LC/MS（LCQ Fleet，Thermo Fisher Scientific）组成的 LC-MS 系统进行。质谱条件：正离子扫描（ESI +，m/z 200～1200），碰撞诱导解离电压为150 V；毛细管电压：3.8 kV；锥孔电压：30V 光电倍增管电压：650V；离子源温度：120˚C；脱溶剂温度：250˚C。
在 2.1 × 150 mm、1.7 μm ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（Waters，UK）上分离 MAE 中的花青素，使用带有 2996 PDA 检测器的 ACQUITY UPLC H-Class 系统（Waters，Milford，MA，USA）通过 UPLC 进行分析. 花青素标准品（Sigma-Aldrich，中国上海）用于定量测定。
2.5. 动物和实验设计
所有动物研究均按照中国国家实验动物护理指南进行，并经福建中医药大学（中国福建）实验动物中心动物伦理委员会批准。4周龄SPF级雄性Wistar大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（HU）2012-0002。所有动物均饲养在福建中医药大学实验动物中心的 SPF 屏障系统中。养殖条件如下：温度20℃～25℃，相对湿度40%～60%，昼夜交替12小时。
大鼠喂食啮齿动物饮食并随意饮用自来水。适应性喂养一周后，将大鼠随机分为五组。对照组（Control）、模型组（NDEA）、NDEA+低剂量MAEs（MAEs-75）、NDEA+高剂量（MAEs-150）和NDEA+花青素-3-葡萄糖苷（C3G-150）。动物实验设计见表1。每周测量体重。最后一次 MAEs 给药后 24 小时，通过 ip 戊巴比妥钠 (40 mg·kg -1 ) 对大鼠进行麻醉，以收集
| UniProt ID | 基因符号 | 正向引物 (5'-3') | 反向引物 (5'-3') |
| AF304364.1 | Nrf2 | ACCCACCGCCTGGGTTCAGT | TGTGCCCTTGAGCTGGCGAC |
| NM_173295.1 | UGT2b1 | TTAGACCTGGAGCCTTGGGAAA | GCCGAAGATACAAGAACCGTGA |
| NM_017014.1 | 消费税 | AGAGCAGCCGCTACCTCTCAAC | CCAATGTGGACAGGTCCTCCCT |
| NM_001159613.1 | NQO1 | CCAGCAGCCCGGCCAATCTG | AGGTCCGACACGGCGACCTC |
| NM_182864.2 | Keap1 | TGATGGACAAACCCAACTCA | CACTGGACAGGAAACCACCT |
| NM_001004027.1 | HO-1 | AGGCTGAGAATGCCGAGTTC | TGTGGTACAAGGACGCCATC |
| NM_214022.1 | 肿瘤坏死因子-α | GGAACTGGCAGAGGAGGCGC | CCCCGCCACGAGCAGGAATG |
| NM_199267.2 | NF-κB | TGATGACATACTCCCACAAG | CAATATCCCCAGACCTAAC |
| S67722.1 | COX-2 | ACCAGCAGTTCCAGTATCAGA | AAGTGAGCAAGTCCGTGTTC |
| NM_017008.4 | GAPDH | CGGGTCAACGGATTTGGTCGTAT | AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC |
表 1。用于 qRT-PCR 分析的引物序列。
将血样和血样在 4°C 下以 3000 rpm 的速度离心 10 分钟以获得血清。从动物身上完全切除肝脏并准确称重 [ 6 ]。如前所述 [ 3 ] 测量肝结节的大小和数量。收集肝组织用于生化和组织病理学分析。
2.6. 生化检测
测定血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆红素（TBiL）、碱性磷酸酶（ALP）、血尿素氮（BUN）、肌酐水平。使用 Infinite M200 PRO Varioskan Flash（TECAN，瑞士）的商业试剂盒（南京建成生物工程工程研究所，南京，中国）的说明。测定血清甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、TNF-α、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）的水平根据制造商的说明通过ELISA试剂盒（CUSABIO Biotech Co.，Ltd.，武汉，中国）。
取 1 克肝脏，用冷 PBS，pH 7.4 冲洗，用纸巾擦干，放入 10 毫升离心管中。然后将组织匀浆以 3500 rpm 离心 15 分钟。将上清液收集在 10 mL 离心管（即 10% 肝脏匀浆）中，立即在液氮中冷冻并储存在 -20°C 直至使用 [ 6] . 使用标准市售试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京, 中国) 根据制造商的说明。血清硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）浓度采用大鼠 TBARS ELISA 试剂盒（奇艺生物科技有限公司，上海，中国）测定。用ELISA试剂盒（CUSABIO Biotech Co.，Ltd.，武汉，中国）测量肝脏匀浆中谷胱甘肽S-转移酶（GST）和UDP-葡萄糖醛酸转移酶2B1（UGT2b1）的水平。
2.7. 组织学检查
各组肝组织用冷生理盐水冲洗，处死大鼠后迅速切除。组织样品立即在 4% 磷酸盐缓冲的多聚甲醛中固定 48 小时，然后在分级乙醇系列中脱水，在二甲苯中澄清并包埋在石蜡中。根据公布的方法 [ 22 ] 用苏木精和伊红 (H&E) 对切片（4 μm 厚）进行染色。样品也被切片，Masson 的毛状体染色与之前的研究一样 [ 23 ]。对于组织学分析，用显微镜（Nikon E200，Nikon Corp.，Japan）对组织切片进行拍照。
2.8. 免疫组化分析
采用SABC免疫组化法检测肝组织炎症标志物蛋白表达。主要步骤如下：石蜡切片（4 μm 厚）脱蜡并与柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）在 37˚C 下孵育 5 分钟（两次），然后用 0.1 M PBS 洗涤 5 分钟（3次），用 3% 过氧化氢在 37°C 孵育 10 分钟，用 PBS 洗涤 5 分钟（3 次），然后在室温下置于封闭溶液中 1.5 - 3 小时。将切片与兔多克隆抗体、NF-κB、COX-2 和 TNF-α（Cell Signaling，Danvers，MA，USA）与 TBS 和 Tween 20 在 4°C 下孵育过夜。然后用 PBS 清洗切片，用 HRP 标记的羊抗兔二抗在 37°C 下孵育 1-2 小时，然后在室温下用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶孵育 30 分钟。洗涤载玻片并通过用 3, 3'-二氨基联苯胺处理 25 分钟显色来观察免疫沉淀。然后将载玻片用苏木精复染，并通过光学显微镜检测表明存在与抗体结合的抗原的棕色。对于阴性对照，使用 TBS 代替一抗。从每张载玻片的十个随机选择的切片中，计数了 500 个细胞。使用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统计算每组的阳性细胞百分比。对于阴性对照，使用 TBS 代替一抗。从每张载玻片的十个随机选择的切片中，计数了 500 个细胞。使用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统计算每组的阳性细胞百分比。对于阴性对照，使用 TBS 代替一抗。从每张载玻片的十个随机选择的切片中，计数了 500 个细胞。使用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统计算每组的阳性细胞百分比。
2.9。蛋白质印迹分析
根据 M-PER (R) 哺乳动物蛋白提取试剂 (Thermo Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)，在含有蛋白酶抑制剂混合物蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解缓冲液中裂解肝组织。收集蛋白质提取物并使用 BCA 试剂盒（Biotechnology Development Co.，Ltd.，Beijing，China）定量浓度。使用 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离相同量的蛋白质并转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜上。在室温下用 5% 脱脂牛奶封闭 1 小时后，将膜与针对 Nrf2 (1:2000)、NQO1 (1:1000)、HO-1 (1:2000)、Keap1 (1:500) 的各种抗体一起孵育、NF-κB (1:4000)、COX-2 (1:500)、TNF-α (1:1000) 和 β-actin (1:2000)，购自 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) 或 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 在 4°C 下过夜。然后洗涤膜并在室温下暴露于 HRP 偶联的二抗 (1:10,000) 1 小时。通过增强的化学发光溶液（CUSABIO Biotech Co.，Ltd.，武汉，中国）检测免疫反应条带，并使用 Bio-Rad Chemi Doc XRS 成像系统暴露于 X 射线胶片。使用 Quantity One 软件对免疫反应条带进行可视化和量化，并标准化为 β-肌动蛋白。
2.10。实时荧光定量 PCR 分析
根据制造商的说明，使用 TRIzol 试剂（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific Inc.，Beijing，China）从肝组织中提取总 RNA。使用 SYBR Green Kit（Takara Biomedical Technology Co.，Ltd.，北京，中国）在 ABI Step One RT-PCR 系统上进行实时 PCR。使用 Primer Premier 5 和 Beacon Designer 8.1 设计的引物列于表 2中。
2.11。统计分析
数据以平均标准差 (SD) 表示。研究数据采用SPSS 21.0统计软件包处理。通过 Tukey 多重比较或学生 t 检验的单向方差分析 (ANOVA) 进行统计分析。P 值 <0.05 被认为具有统计学意义。GraphPad Prism 6.01 用于图形评估。
3。结果与讨论
3.1。PR-01 桑椹花青素提取物成分分析
PR-01桑椹花青素富集提取物的总花青素含量为（718±8.9）mg·100g -1。UPLC-ESI-MS分析表明，天竺葵素3-葡萄糖苷（P3G）、C3R和C3G是主要的花青素（图1 ），这与宋[ 17 ]和黄[ 24 ]的报道一致。UPLC分析
| 团体 | 动物数量 | 知识产权管理 | 灌胃给药 |
| 每周二和周五上午 8:30 从 2 周到 12 周 | 每天上午 10:00 从 1 周到 18 周 | ||
| 控制 | 10 | 生理盐水 | 蒸馏水 |
| NDEA | 12 | 25 毫克/公斤 | 蒸馏水 |
| C3G-150 | 12 | 25 毫克/公斤 | 150 毫克/公斤 C3G |
| 低剂量 MAE (MAEs-75) | 12 | 25 毫克/公斤 | 75 mg/kg MAE |
| 高剂量 MAE (MAEs-150) | 12 | 25 毫克/公斤 | 150 mg/kg MAE |
表 2。研究的实验设计。
ip，腹腔注射；C3G，花青素-3-葡萄糖苷；MAEs，桑葚花青素提取物；NDEA，N-亚硝基二乙胺。MAEs干预组的灌胃剂量通过C3G含量计算。MAEs和C3G溶解在蒸馏水中。
图 1。PR-01桑椹花青素富集提取物的质谱图和色谱图。(A) MAE 的 ESI-MS；(B) MAE 的色谱图。三个峰对应于 (1) 天竺葵素 3-葡萄糖苷；(2) C3G；(3) C3R。
结果表明，MAE中P3G、C3R和C3G的含量分别为（75.4±6.5）mg·g -1、（105.8±4.1）mg·g -1和（593.0±12.6）mg·g -1。MAEs 的质谱图如图 1所示，而 MAEs 的化学成分表征如表A1 所示。
3.2. 体重、食物摄入量和肝脏指数的变化
如表 3所示，NDEA 组大鼠 NDEA 后体重较对照组明显降低（P < 0.01），而 MAEs 和 C3G-150 组大鼠体重增加相似（P > 0.05)。在日均采食量方面，NDEA组采食量低于对照组（P < 0.01）。然而，经 MAEs 和 C3G 处理后，日采食量显着高于 NDEA 组（P < 0.05）。与NDEA组相比，MAEs-75组和MAEs-150组在MAEs治疗后肝脏相对重量分别显着降低23.64%和28.37%（P < 0.01）。
3.3. 肝功能生物标志物的变化
NDEA 会导致肝损伤，因此会在其选定的剂量下释放肝酶 [ 25 ]。过去的研究表明，桑椹水提取物可作为肝脏保护剂[ 4 ] [ 25 ]。在这项研究中，ALT、AST、TBiL、ALP 和 GGT 的活性升高表明与对照动物相比，单独使用 NDEA 治疗的动物肝功能较差（表 4），如 Latief 等人报道的那样。[ 26 ]。MAEs 治疗后，上述升高的肝功能酶水平在 MAEs-75 和 MAEs-150 组动物中显着恢复，表明 MAEs 具有护肝功效。用更高剂量的 MAE (150 mg·kg -1 ) 进行预处理) 还将 NDEA 诱导的血清 BUN 和肌酐增加至正常水平（表 4）。此外，NDEA 组血清 CEA 和 AFP 水平明显高于对照组（P < 0.05），而 75 mg·kg -1 MAEs 和 150 mg·kg -1 MAEs 处理显着降低血清 CEA 和AFP水平较NDEA组分别降低25.99%、39.32%、32.57%和49.24%（表4，P<0.05）。用更高剂量的 MAE (150 mg·kg -1 ) 预处理似乎更有效地抑制 NDEA 诱导的
| 团体 | 初始体重 (g) | 最终体重 (g) | 体重增加（克） | 采食量（克/天/大鼠） | 相对肝脏重量# |
| 控制 | 141.25 ± 4.87一个 | 592.42 ± 28.54一个 | 451.17 ± 28.98一个 | 27.06 ± 3.48一个 | 2.92 ± 0.43 b |
| NDEA | 141.42 ± 4.34一个 | 514.83±38.32 ℃ | 373.42±38.11 ℃ | 21.99 ± 1.45摄氏度 | 4.23 ± 0.64一个 |
| C3G-150 | 141.92 ± 7.97一个 | 公元前 531.33 ± 64.91 | 公元前389.42 ± 64.40 | 24.92 ± 2.03 b | 3.79 ± 0.62一个 |
| MAEs-75 | 141.92 ± 6.52一个 | 554.42 ± 42.68 b | 413.08 ± 43.53 b | 25.28 ± 2.34抗体 | 3.23 ± 0.49 b |
| MAEs-150 | 141.08 ± 7.47一个 | 556.00 ± 21.86 b | 414.75 ± 25.21 b | 25.08 ± 3.50抗体 | 3.03 ± 0.38 b |
表 3。MAEs 对 NDEA 诱导的肝癌发生大鼠体重、采食量和肝脏指数的影响。
注意：#相对肝脏重量等于肝脏重量/体重 × 100。数值表示为平均值 ± SD (n = 8 - 10)。品种内不同上标字母（a、b、c、d、e）的值存在显着差异。
| 团体 | 控制 | NDEA | C3G-150 | MAEs-75 | MAEs-150 |
| ALT (U/L) | 40.70 ± 8.85天 | 85.63 ± 17.78一个 | 61.50 ± 19.63 b | 公元前54.80 ± 11.67 | 46.10±11.14 cd |
| AST (U/L) | 83.10±12.71 ℃ | 173.13 ± 47.09一个 | 113.80 ± 23.70 b | 98.10 ± 21.56公元前 | 93.20 ± 13.50摄氏度 |
| TBiL (毫克/分升) | 2.32±0.26 ℃ | 4.45 ± 0.76一个 | 3.02 ± 0.41 b | 2.89 ± 0.31 b | 2.30±0.17 ℃ |
| 碱性磷酸酶 (U/L) | 58.60 ± 9.16 b | 90.63 ± 14.93 | 78.10 ± 22.81一个 | 60.20 ± 17.03 b | 53.80 ± 9.37 b |
| GGT (U/L) | 30.26 ± 3.62天 | 115.43 ± 14.37一个 | 68.24±6.08 ℃ | 50.55±3.25 ℃ | 39.32±6.54 cd |
| BUN (毫摩尔/升) | 5.40 ± 1.07 b | 8.87 ± 1.13一个 | 7.12 ± 2.67 b | 6.02 ± 2.26 b | 5.81 ± 1.51 b |
| 肌酐(μmol/L) | 23.96 ± 9.58 e | 68.36 ± 9.86一个 | 公元前47.15 ± 10.54 | 33.50 ± 8.85德 | 31.43 ± 14.44德 |
| CEA (纳克/毫升) | 2.16 ± 0.44天 | 7.35 ± 0.57一个 | 6.76 ± 1.18抗体 | 5.44 ± 1.85公元前 | 4.46±1.87 ℃ |
| 法新社（纳克/毫升） | 22.27 ± 6.18摄氏度 | 67.54 ± 6.91一个 | 53.47 ± 16.69一个 | 45.54 ± 17.76 b | 公元前34.28 ± 13.2 |
表 4。MAEs对NDEA致肝癌大鼠血清肝酶的影响。
品种内具有不同上标字母（a、b、c、d、e）的值显着不同。
大鼠肝损伤。
3.4. 肝脏样本的组织病理学研究
作为最重要的环境肝毒素和致癌物之一，NDEA 会导致严重的肝损伤，导致小叶结构的严重改变并阻碍肝功能 [ 26 ]。实验期间， NDEA组2只大鼠在第16周和第18周死于严重的肝肿瘤发病。在其他组动物中没有看到死亡。本研究结果表明，低剂量多次注射 NDEA (25 mg·kg -1NDEA 组每周 2 次）显着增加结节发生率和表观 HCC 发生率（分别为 100.0%、50.0%），且 NDEA 组 18 周死亡率仅较低（16.7%），表明成功诱导肝癌模型. 但与NDEA组动物相比，MAEs和C3G-150组大鼠肝结节发生率、最大直径、平均数显着降低（表5，P<0.05）。特别是，与 NDEA 组动物 (100%) 相比，在 C3G 之前处理 150 mg·kg -1 MAE 显示结节发生率 (41.7%) 显着降低。
如表5所示，与NDEA组动物(50.0%)相比，在C3G之前处理150 mg·kg -1 MAEs显示明显HCC发病率(8.3%)显着降低。对照组大鼠肝脏表型无明显变化，而NDEA组大鼠肝脏大小和结构发生明显变化（图2）。损伤大鼠肝脏结构明显表现为细胞坏死、出血、瘢痕和肝结节样结构，大量嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和卵细胞增生明显，伴有炎性细胞浸润[ 26 ]，在NDEA的肝脏中观察到。组大鼠。然而，MAEs (75 mg·kg -1或 150 mg·kg-1 ) 和 150 mg·kg -1 C3G 给药显着降低了这些变化（图 2 (B)）。Masson 染色切片的结果表明，在 NDEA 给药后，大鼠出现肝纤维化。然而，程度
| 肝肿瘤相关病变 |
控制 (n = 10) |
NDEA (n = 10) |
C3G-150 (n = 11) |
MAEs-75 (n = 12) |
MAEs-150 (n = 12) |
|
| 肉眼可见的病变 | 结节发生率# | 0 (0) | 10 (100) | 8 (72.7) | 7 (58.3)* | 5(41.7)** |
| 最大结节直径 (mm) ▲ | —— | 18.73 ± 7.13一个 | 9.42 ± 5.54 b | 4.63±2.46 ℃ | 1.87±1.79 ℃ | |
| 平均结节数# | ND | 71.33 ± 62.11一个 | 48.10 ± 10.80 b | 17.70 ± 3.42天 | 6.13 ± 5.22天 | |
| 显微病变 | 急性心力衰竭发病率 | 0 (0.0) | 1 (10.0) | 2 (16.7) | 3 (25.0) | 2 (16.7) |
| HA发病率 | 0 (0.0) | 3 (30.0) | 4 (33.3) | 3 (25.0) | 2 (16.7) | |
| 肝癌发病率 | 0 (0.0) | 5 (50.0) | 3 (25.0) | 2 (16.7)* | 1 (8.3)** | |
| 肿瘤总发病率 | 0 (0.0) | 8 (80.0) | 7 (58.3) | 5 (41.7) | 3 (25.0)* | |
表 5。MAEs对NDEA诱导的肝癌发生大鼠肝脏肿瘤相关病变的影响。
数据是平均值±标准差或n（％）。品种内具有不同上标字母（a，b，c，d）的值显着不同。*P < 0.05 和 **P < 0.01 通过 Fisher 精确检验与 NDEA 组相比。#可见结节（直径 ≥ 1 毫米）。▲最大结节直径，平均最大结节直径。ND，检测不到；AHF，肝病灶改变；HA，肝腺瘤；HCC，肝细胞癌。
图 2。MAEs对NDEA诱导的肝癌发生大鼠肝脏病理变化的影响。(A) 肝表面；(B) 带有苏木精和 esion 的肝切片 (H & E, 200×)。嗜碱性细胞病灶（白色箭头）是肝病灶的改变。在小叶的中心是中央静脉 (CV)。PV，门静脉。(C) Masson 染色的肝切片 (200×)。
与用 MAE 或 C3G 治疗的大鼠相比，NDEA 组动物的纤维化更严重（图 2（C））。MWEs 治疗组的细胞空泡化也减少了（图 2 (C)）。
这些结果表明MAEs是预防或延缓NDEA诱导的大鼠肝癌发生的有效化学预防剂，其中高剂量MAEs效果最好，优于C3G。
3.5. MAEs对TBARS及相关抗氧化酶活性的抗氧化作用
NDEA代谢激活过程中产生的过量活性氧会干扰机体的氧化系统，导致氧化损伤和组织癌变，在肝癌的发病机制中起重要作用[ 26 ]。TBARS 浓度被用作氧化应激的标志物[ 24 ]。本研究中，与对照组相比，NDEA组肝组织TBARS水平显着升高（P<0.001）1.88倍，与早期报道一致[ 13 ][ 27 ]。与NDEA组相比，C3G-150、MAEs-75和MAEs-150组肝组织TBARS分别显着降低39.01%、40.85%和44.52%（表6 ）, P < 0.001)。有趣的是，这些结果表明，150 mg·kg -1 MAEs 处理几乎使 TBARS 恢复到正常水平。在此基础上，我们进一步检测了MAEs对抗氧化能力的影响。NDEA组抗氧化酶、GSH、GSH-Px、CAT、SOD活性显着低于对照组（P < 0.01），而MAEs和C3G显着促进这些活性（P < 0.05）。其中，150 mg·kg -1 MAEs处理的大鼠肝脏中抗氧化酶水平最高。NDEA处理后，NDEA组大鼠肝脏MDA含量明显升高，约为对照组大鼠的2.44倍（P < 0.01），MAEs处理后MDA含量显着降低（表6 ）, P < 0.05)。我们的研究结果表明, NDEA 给药改变了抗氧化状态, 导致氧化应激, 而 MAEs 可以抑制脂质过氧化并增强抗氧化能力, 因此 MAEs 对 NDEA 诱导的大鼠肝癌发生的预防作用可能与其抗氧化活性密切相关。陈等人。[ 13 ] [ 18 ] [ 27 ] 还发现桑果中的花青素和水提取物可以清除自由基，并在体外显示出浓度依赖性抗氧化活性。
3.6. MAEs 对肝脏 GST 和 UGT2b1 的影响
NDEA 的诱导增加了微粒体 I 期代谢酶
| 团体 | TBARS (nmol/mg 蛋白质) | 谷胱甘肽（毫克/克） | 谷胱甘肽-Px (U/mg) | SOD (U/mg) | 猫 (U/mg) | 丙二醛 (nmol/mg) |
| 控制 | 241.67±11.61 ℃ | 4.38 ± 0.71一个 | 387.53 ± 23.72一个 | 172.09 ± 14.28一个 | 35.89 ± 8.58一个 | 4.73±1.07 ℃ |
| NDEA | 454.74 ± 25.43一个 | 1.23 ± 0.34 e | 293.02 ± 53.17 b | 94.56±20.70 ℃ | 14.56 ± 3.10天 | 11.55 ± 3.66一个 |
| C3G-150 | 277.36 ± 30.24 b | 1.94 ± 1.03天 | 363.57 ± 28.85一个 | 127.47 ± 24.65 b | 23.26±5.35 ℃ | 8.47 ± 2.18 b |
| MAEs-75 | 公元前268.96 ± 32.90 | 2.85±0.70 ℃ | 364.78 ± 32.04一个 | 147.45 ± 36.13 b | 公元前28.21 ± 7.27 | 5.95±2.33 ℃ |
| MAEs-150 | 公元前252.30 ± 23.09 | 3.61 ± 0.25 b | 380.94 ± 37.81一个 | 170.77 ± 18.34一个 | 32.30 ± 5.55抗体 | 5.30±1.00 ℃ |
表 6。MAEs对NDEA致肝癌大鼠肝脏TBARS及相关抗氧化酶活性的影响。
数据是每组 8 个样本和至少三个独立测量值的平均值 ± SD。品种内具有不同上标字母（a、b、c、d）的值显着不同。TBARS，硫代巴比妥酸反应物质；GSH，谷胱甘肽；GSH-Px，谷胱甘肽过氧化物酶；SOD，超氧化物歧化酶；CAT，过氧化氢酶；丙二醛，丙二醛。
同时减少第二阶段解毒酶 [ 6 ] [ 28 ]。GST和UGT2b1在毒素、致癌物的解毒和排泄中发挥重要作用，可能受到Nrf2和抗氧化反应元件的积极调节[ 29 ]。在本研究中，观察到 NDEA 给药后，NDEA 组肝脏中 UGT2b1 和 GST 活性显着降低（图 1(A), P < 0.05)。而与NDEA组相比，MAEs-75和MAEs-150组大鼠肝脏中GST和UGT2b1的水平显着升高。MAEs-150组肝脏GST、UGT2b1水平明显高于C3G-150组（P < 0.05），接近正常水平。qRT-PCR 的结果还表明，NDEA 诱导了 GST 和 UGT2b1 mRNA 表达，而 MAE 抑制了这些改变（图 3（B））。这些结果表明MAEs可以通过刺激II期解毒酶的活性来抑制肿瘤的发展。
3.7. MAEs 激活 Nrf2 信号通路及其下游解毒酶
Nrf2 介导的抗氧化剂、解毒酶和抗炎信号通过 Nrf2-ARE 途径保护生物体免受氧化应激引起的细胞损伤 [ 28 ]。严等人。[ 15 ] 报道桑花花青素提取物的消耗维持了参与氧化应激调节的 Nrf2、HO-1 和 p38 MAPK 刺激。本研究结果表明，150 mg·kg -1 MAEs诱导大鼠肝脏Nrf2活化，同时刺激NQO-1、Keap1和HO-1的mRNA表达（图3（B），P < 0.05)。在 Nrf2、Keap1、HO-1 和 NQO-1 蛋白水平的测量中观察到了类似的结果。与对照组和NDEA组相比，150 mg·kg的治疗-1 MAEs引起MAEs-150组Nrf2、Keap1、HO-1和NQO-1蛋白表达发生显着变化（P < 0.05），而MAEs-75组变化不明显（图3（ C））。综合这些结果，得出的结论是，MAEs可能激活Nrf2信号通路，诱导Nrf2介导的抗氧化酶，进一步激活下游解毒GST和UGT2b1的表达，进而加速NDEA代谢物的消除，从而实现解毒的目的。
3.8. MAEs 减弱了 NDEA 诱导的炎症反应
研究表明，NDEA诱发肝癌的主要原因是肝损伤后诱发慢性炎症反应和异常修复[ 30 ][ 31 ]。哈西莫托等人。研究表明，施用野生桑树提取物可抑制角叉菜胶引起的急性炎症 [ 7 ]。如图3A所示，相对于NDEA组（85.26 pg·mL -1、97.60 pg·mL -1 ），MAEs-75（46.24 pg·mL -1）显着抑制IL-6和TNF-α水平, 50.08 pg·mL -1 ), MAEs-150 (37.93 pg·mL -1 , 36.75 pg·mL -1 ), 和 C3G-150 (62.14 pg·mL -1 , 56.62 pg·mL -1 )）。IL-6和TNF-α的抑制与MAEs（75 mg·kg -1和150 mg·kg -1 ）呈剂量依赖性关系。此外，MAEs 治疗
图 3。MAEs对Nrf2及其下游解毒酶表达的影响。(A) MAEs 对暴露于 NDEA 的大鼠肝微粒体中 GST 和 UGT2b1 水平的影响。值表示为肝微粒体 GST 和 UGT2b1 活性的浓度。GST，谷胱甘肽-S-转移酶；UGT2b1，UDP 葡萄糖醛酸转移酶 UGT2b1。(B) 对照组和治疗组GST、UGT2b1、Keap1、HO-1、Nrf2、NQO-1的mRNA相对表达量。GAPDH 用作内部对照。(C)各组大鼠肝组织中Keap1、HO-1、Nrf2和NQO-1的代表性免疫印迹和蛋白水平。品种内不同上标字母（a、b、c、d）的值在组间差异显着（P < 0.05）。
NDEA治疗后血清中抗炎细胞因子IL-10和IFN-γ增加（图4（A））。
NF-κB、TNF-α 和 COX-2 在炎症的发展中起重要作用 [ 13 ] [ 24 ]。因此，我们进一步确定了 MAE 是否可以通过 qRT-PCR 和蛋白质印迹来逆转对炎症相关基因（TNF-α、NF-κB 和 COX-2）表达的影响。qRT-PCR 分析结果显示
图 4。MAEs对NDEA诱导的肝癌发生大鼠炎症标志物的影响。(A) 各组大鼠血清中促炎和抗炎细胞因子的标志物。(B)各组大鼠肝脏中TNF-α、NF-κB、COX-2的mRNA表达。GAPDH 用作内部对照；(C) 各组大鼠肝脏中 TNF-α、NF-κB 和 COX-2 的代表性免疫印迹及其蛋白质水平。β-肌动蛋白用作内部对照。值表示为平均值 ± SD。品种内具有不同上标字母（a、b、c、d）的值显着不同。
即，MAEs明显降低MAEs-75和MAEs-150组大鼠肝脏中TNF-α、NF-κB和COX-2 mRNA的表达，均显着高于C3G组大鼠（图4（乙））。这些结果表明，MAEs 以剂量依赖性方式降低 NDEA 诱导的 TNF-α、NF-κB 和 COX-2 mRNA 表达。在 TNF-α、NF-κB 和 COX-2 蛋白水平的测量中观察到了类似的结果。与对照组相比，NDEA 组的 TNF-α、NF-κB 和 COX-2 蛋白表达水平分别提高了 2.01 倍、4.35 倍和 2.81 倍（图 4（C）） . 然而，MAEs 的给药显着降低了 MAEs-75 和 MAEs-150 组大鼠的 TNF-α、NF-κB 和 COX-2 蛋白水平（图 4(C), P < 0.05)。此外，NDEA 处理的肝切片的免疫组织化学显示 NDEA 组中的 TNF-α、NF-κB 和 COX-2 阳性细胞。NDEA组大鼠肝脏中TNF-α、NF-κB和COX-2阳性细胞的数量比对照组大鼠高约6.16-、4.53-和15.92-倍（P < 0.001）， MAEs（75 和 150 mg·kg -1）处理后显着降低（图 5，P < 0.01）。
本研究表明，NDEA诱导的肝癌可能与大鼠的炎症反应有关，MAEs可能通过调节炎性细胞因子水平和减弱炎症反应发挥抗炎作用。
图 5。对照和实验动物肝脏中 TNF-α、COX-2 和 NF-κB 的代表性免疫组织化学染色，放大倍数为 ×200。条形图表示对照组和实验组肝脏中 TNF-α、COX-2 和 NF-κB 阳性染色细胞的平均百分比。结果表示为平均值±标准差。品种内具有不同上标字母（a、b、c、d）的值显着不同。
通过 NF-κB 抑制途径介导 COX-2。
4。结论
在体内研究中，我们提供证据表明桑树品种 PR-01 果实的 MAE 通过降低肝功能酶、减少脂质过氧化、促进抗氧化酶和增加肝 II 期解毒来预防 NDEA 诱导的肝损伤、纤维化和肝细胞癌。酶 GST 和 UGT2b1 的活性以及通过阻断 NF-κB 活化和促炎介质的释放来抑制炎症反应。这些发现为MAEs在预防肝癌方面提供了有希望的用途。
致谢
本研究得到国家重点研发计划（2017YFD0100100）、国家重点技术研发计划（2013BAD01B05）、国家自然科学基金（30600415）、科技创新平台发展计划的支持。福建农林大学（PTJH13001，PTJH12015），福建农林大学科技创新基金（CXZX2017245）。
作者贡献
JG Zheng 和 SF Liao 构思并设计了这些实验。SF Liao 和 JH Liu 进行了实验，分析了数据。SF Liao 起草了手稿。JG Zheng 和 M Xu 修改了手稿。
附录 A. 补充数据
本文档文件包含补充表A1。
桑葚（Morus alba L.）品种PR-01花青素提取物预防肝癌的评价。
| 顶峰 | 化合物 | 代码 | [MH] + (m/z) | 片段 (m/z) |
| 1 | 天竺葵素3-葡萄糖苷氯化物 | P3G | 433.09 | 271 |
| 2 | Cyanidin-3-O-葡萄糖苷氯化物 | C3G | 449.08 | 287 |
| 3 | 花青素3-芸香苷氯化物 | C3R | 595.05 | 287,449 |
表 A1。桑树花青素单体的结构鉴定。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
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https://www.wcrf.org/dietandcancer
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[ 6 ] Liu, H., Yang, J., Huang, SW, Liu, RJ, He, YJ, Zheng, DD and Liu, CH (2017) 桑葚粗提物在大鼠肝脏中诱导 Nrf2 激活和解毒酶的表达：对其的启示防止 NP 引起的毒性作用。功能食品杂志，32, 367-374。
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[ 8 ] Gopalakrishnan, R., Sundaram, J., Sattu, K., Pandi, A. 和 Thiruvengadam, D. (2013) 水飞蓟素的膳食补充剂与肝细胞癌中细胞增殖减少、细胞凋亡增加和解毒系统激活有关。分子和细胞生物化学，377、163-176。
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