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摘要：我们开发了一种基于 RNase H2 依赖性 PCR (rhPCR)的新型双酶化学，称为 rhAmp ® SNP 基因分型，可为 SNP 分析提供高信号和特异性。rhAmp SNP 基因分型结合了独特的双酶系统和 3' 末端封闭的 DNA-RNA 杂合引物来询问 SNP 基因座。封闭的引物与完美匹配的靶标杂交后会激活，从而消除或大大减少引物二聚体。热稳定的热启动 RNase H2 在核糖的 5' 端立即切割引物，释放封闭基团并允许引物延伸。使用突变Taq进一步提高 PCR 特异性DNA 聚合酶，导致改进的等位基因鉴别。使用通用报告系统获得信号生成，对于任何双等位基因 SNP，该系统只需要两个报告探针。选择了 1000 个随机选择的 SNP，以验证设计流程的 95% 设计率。测试了 130 个人类 SNP 目标的子样本，并实现了 98% 的调用率和 99% 的调用准确度。rhAmp SNP 基因分型分析与各种 qPCR 仪器兼容，包括 QuantStudio TM 7 Flex、CFX384 TM、IntelliQube ®和 Biomark HD TM。与 TaqMan ®相比，rhAmp SNP 基因分型为表示显示更高的信号 (Rn) 和更大的簇分离，从而产生更可靠的 SNP 基因分型性能。rhAmp SNP 基因分型解决方案适用于人类和植物的高通量 SNP 基因分型应用。

 

关键词

 

. SNP 基因分型, RNase H2 , rhPCR , rhAmp SNP 基因分型, Universal Reporter ;

 

一、简介

 

单核苷酸多态性 (SNP) 水平的遗传多样性已在科学和医学的许多分支中得到利用。SNP 已被用于确定个体对从乳腺癌到心血管疾病等多种疾病状态的易感性。此外，多态性可用于预测药物在组织内的活性。在药物遗传学中，编码药物代谢酶 (DME) 的基因中的多态性用于帮助预测药物的效力，因为特定化合物的吸收、分布、代谢和排泄 (ADME) 都可能受到遗传变异的影响。这些基因中已知的多态性称为 ADME SNP。此外，单核苷酸多态性也常被用作育种和遗传研究中的分子标记。

 

已经开发了多种不同的化学方法或测定法用于 SNP 基因分型，包括质谱法、寡核苷酸阵列、单链构象多态性和测序。一些最广泛使用的技术往往集中在基于荧光的 PCR 分析（即 5' 核酸酶、分子信标、Scorpion 引物、KASP 和 Invader）[ 1 ]。对于所有这些方法，等位基因特异性鉴别能力仅基于单一因素，即探针杂交或引物延伸。

 

在这里，我们提出了一种新的 SNP 基因分型方法，rhAmp SNP，它将等位基因特异性杂交和延伸结合到一个单一的测定中。rhAmp SNP 基因分型依赖于两种酶，RNase H2（一种核糖核酸内切酶）和一种具有增强等位基因识别能力的突变 Taq DNA 聚合酶。rhAmp SNP 基因分型引物包含单个 RNA 碱基，并被 3' 端封闭。此外，每个等位基因特异性引物都有一个独特的通用尾，该尾将序列整合到与报告序列互补的扩增子中。RNase H2 对引物的快速解除封闭仅在封闭的含 RNA 的引物和 DNA 靶标之间形成完美匹配的异源双链时才会发生。一旦被 RNase H2 解除封闭，新激活的引物 3' 端就会覆盖 SNP 位点，并被突变的 Taq DNA 聚合酶检测用于等位基因特异性 PCR。rhAmp SNP 基因分型化学的主要优点包括通过 rhPCR 增强等位基因鉴别，以及通过通用报告系统产生高信号和降低成本。

 

2。材料和方法

 

2.1。SNP、基因组 DNA 样本和提取

 

SNP 目标：从 dbSNP Build 144（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/，补充表S1）中随机选择了总共 130 个 SNP，用于本研究中的大部分分析，涵盖在人类基因组中发现的 SNP 类型。使用一组 1000 个随机选择的常见双等位基因 SNP 来评估管道设计率。

 

合成模板：合成 gBlocks®基因片段（Integrated DNA Technologies，https : //www.idtdna.com/pages/products/genes/gblocks-gene-fragments）在初始测定验证阶段用作已知基因型对照（数据未如图所示）。gBlocks 代表野生型和突变等位基因的基因片段以等摩尔比混合在一起，代表杂合基因型。使用 Nano Drop™ 2000（Thermo Fisher Scientific）测定浓度。

 

基因组 DNA 样本：人类基因组 DNA 样本购自科里尔医学研究所。共获得两组 136 个独特样本，代表三个原始 HapMap 人群：来自伊巴丹的约鲁巴人（YRI）、来自中国北京的汉族人（CHB）和 CEPH 犹他州居民（CEU）（补充表S2）。使用靶向 RNase P (RPPH1) 基因的 qPCR 方法对 DNA 样本进行量化。

 

2.2. rhAmp SNP 基因分型

 

使用 rhAmp SNP Assays、rhAmp Genotyping Master Mix 和 rhAmp Reporter Mix 进行 SNP 基因分型，有或没有被动参考染料 (www.idtdna.com/rhAmp-Genotyping)。通常使用来自 46 个（人类 SNP 组）或 90 个（ADME SNP 组）样本（Coriell 研究所）的 3 ng 干燥基因组 DNA 在 5 µL 反应中进行基因分型反应。除非另有说明，否则反应在 QuantStudio 7 Flex 仪器上运行，并使用 QuantStudio 实时 PCR 软件（Thermo Fisher Scientific，CA）进行分析。对于 DNA 输入测试，每个反应的 gDNA 从 3 ng 减少到 125 pg。rhAmp SNP 基因分型反应在 95°C 10 分钟的热循环曲线下运行，然后按照已发布的方案在 95°C 10 秒、60°C 30 秒和 68°C 20 秒进行 40 个循环（ www.idtdna。com/rhAmp-SNP 协议）。在 CFX384 (BioRad, CA) 平台上使用了相同的热循环程序，反应包含 rhAmp Reporter Mix，不含被动参比染料。IntelliQube（LGC 集团）数据使用 93.5°C 10 分钟的热曲线收集，然后在 93.5°C 10 秒、60°C 30 秒和 68°C 20 秒下进行 40 个循环。反应包含最终浓度为 0.85x 的 rhAmp SNP 基因分型预混液、rhAmp SNP 检测和报告子混合物以及最终 1X 浓度的被动参考染料，以及每次反应 1.6 ng 的 Coriell gDNA 输入。使用 Biomark HD (Fluidigm, CA) 平台，根据制造商的建议，使用来自 90 个子集（ADME SNP 面板）的 23 个 gDNA 样本，每个入口 150 ng。执行修改后的方案，无需额外的 HotStar Taq 聚合酶。热混合方案修改为：37°C 2 分钟，45°C 10 分钟，然后 25°C 10 分钟。反应在 95℃ 10 分钟的热循环下进行，然后在 95℃ 10 秒、60℃ 30 秒和 68℃ 20 秒进行 40 个循环。调用率定义为具有指定 SNP 基因型调用的样本百分比，调用准确度是指定正确基因型的调用样本的百分比。报告的检出率和检出准确度是使用 QuantStudio 实时 PCR 软件为 130 次检测的 46 个样品中的每一个分配的自动检出来确定的。60°C 30 秒，68°C 20 秒。调用率定义为具有指定 SNP 基因型调用的样本百分比，调用准确度是指定正确基因型的调用样本的百分比。报告的检出率和检出准确度是使用 QuantStudio 实时 PCR 软件为 130 次检测的 46 个样品中的每一个分配的自动检出来确定的。60°C 30 秒，68°C 20 秒。调用率定义为具有指定 SNP 基因型调用的样本百分比，调用准确度是指定正确基因型的调用样本的百分比。报告的检出率和检出准确度是使用 QuantStudio 实时 PCR 软件为 130 次检测的 46 个样品中的每一个分配的自动检出来确定的。

 

2.3. TaqMan SNP 基因分型

 

使用 TaqMan 基因分型预混液（Thermo Fisher Scientific）和 TaqMan SNP 基因分型分析或 TaqMan 药物代谢基因分型分析（Thermo Fisher Scientific）进行 SNP 基因分型（补充表中列出的分析 ID 号S3)。在 5 µL 反应中使用 3 ng 干燥的基因组 DNA 样本评估 SNP。TaqMan SNP Genotyping Assay 反应使用以下热循环曲线运行：95°C 10 分钟，然后在 95°C 15 秒和 60°C 1 分钟进行 40 个循环。TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay 反应按照以下热循环曲线运行：95˚C 10 分钟，然后在 95˚C 15 秒和 60˚C 90 秒下进行 50 个循环。热循环曲线基于制造商推荐的协议。使用 QuantStudio 7 Flex 仪器和 QuantStudio Real-Time PCR Software Autocaller (Thermo Fisher) 进行循环和等位基因鉴别分析。

 

2.4. 分析设计

 

通用报告系统：在筛选的1000万个候选序列中，选择了一小部分符合严格热力学特性（相同长度、GC%、Tm等）并且对人类基因组具有高序列特异性的通用引物和探针。我们进一步缩小了探针组的范围，使它们不会形成二聚体，并且成对编辑距离至少为 4，以最大限度地减少探针之间的干扰。基于经验测试选择了一对通用报告探针（数据未显示）。

 

rhAmp SNP 检测设计流程：我们开发了一个复杂的检测设计流程，针对每个目标 SNP 执行以下步骤： 1) 设计所有可能的等位基因特异性引物 (ASP)、基因座特异性引物 (LSP) 及其组合；2) 评估引物和扩增子的热力学性质，如长度、GC百分比、Tm、序列复杂度、折叠等；3) 评估重叠 SNP 和重复的影响；4) 分析检测引物的二聚化，包括自身二聚体和异二聚体；5) 评估引物的相容性，即具有相似的 Tm 和长度，特别是在 ASP 之间；6) 确定针对人类基因组的测定特异性。最后，基于所有上述参数的最佳组合，选择具有最佳整体质量的测定。

 

3. 结果

 

3.1。rhAmp SNP 基因分型的描述

 

描述 rhAmp SNP 基因分型的示意图如图 1所示。每个 rhAmp SNP 检测由一个基因座特异性引物 (LSP) 和两个尾等位基因特异性引物 (ASP) 组成。每个引物都有一个 RNA 碱基和一个 3' 末端

 

 

 

图1. rhAmp SNP 基因分型系统示意图。(A) SNP 等位基因 C 模板 DNA 显示为黑色实线上的红色椭圆。在 3' 末端带有封闭组 (X) 的实线表示一个 3' 末端封闭的基因座特异性引物 (LSP) 和两个 3' 末端封闭的等位基因特异性引物 (ASP)，在 5 处有绿色和蓝色线' 结束表示等位基因特异性尾序列。一个 ASP 包含与目标 SNP 参考等位基因互补的 DNA 碱基，另一个 ASP 包含与替代等位基因互补的 DNA 碱基，分别显示为红色椭圆形和黄色椭圆形。ASP 和 LSP 中带有 R 符号的蓝色三角形代表 RNA 碱基。蓝色圆形代表 RNase H2。(B) RNase H2 识别完美匹配的 RNA-DNA 异源双链体并切割引物以释放封闭的 3' 端，从而激活 PCR 引物，而不匹配的 ASP 仍然被阻止。紫色水滴形状代表突变 Taq DNA 聚合酶，黑色虚线代表聚合酶的延伸。(C) 来自 ASP 的延伸将等位基因特异性尾序列合并到扩增子中，然后延伸 LSP 以形成互补链。绿色圆圈和黑色圆圈分别代表荧光团和猝灭剂，并通过接头序列（绿线）连接，共同代表双标记探针。探针和通用引物（黑色箭头）与与掺入的等位基因尾序列互补的链退火。在 PCR 过程中，Taq 聚合酶的 5' 核酸酶活性降解探针，释放荧光团并产生荧光信号。紫色水滴形状代表突变 Taq DNA 聚合酶，黑色虚线代表聚合酶的延伸。(C) 来自 ASP 的延伸将等位基因特异性尾序列合并到扩增子中，然后延伸 LSP 以形成互补链。绿色圆圈和黑色圆圈分别代表荧光团和猝灭剂，并通过接头序列（绿线）连接，共同代表双标记探针。探针和通用引物（黑色箭头）与与掺入的等位基因尾序列互补的链退火。在 PCR 过程中，Taq 聚合酶的 5' 核酸酶活性降解探针，释放荧光团并产生荧光信号。紫色水滴形状代表突变 Taq DNA 聚合酶，黑色虚线代表聚合酶的延伸。(C) 来自 ASP 的延伸将等位基因特异性尾序列合并到扩增子中，然后延伸 LSP 以形成互补链。绿色圆圈和黑色圆圈分别代表荧光团和猝灭剂，并通过接头序列（绿线）连接，共同代表双标记探针。探针和通用引物（黑色箭头）与与掺入的等位基因尾序列互补的链退火。在 PCR 过程中，Taq 聚合酶的 5' 核酸酶活性降解探针，释放荧光团并产生荧光信号。(C) 来自 ASP 的延伸将等位基因特异性尾序列合并到扩增子中，然后延伸 LSP 以形成互补链。绿色圆圈和黑色圆圈分别代表荧光团和猝灭剂，并通过接头序列（绿线）连接，共同代表双标记探针。探针和通用引物（黑色箭头）与与掺入的等位基因尾序列互补的链退火。在 PCR 过程中，Taq 聚合酶的 5' 核酸酶活性降解探针，释放荧光团并产生荧光信号。(C) 来自 ASP 的延伸将等位基因特异性尾序列合并到扩增子中，然后延伸 LSP 以形成互补链。绿色圆圈和黑色圆圈分别代表荧光团和猝灭剂，并通过接头序列（绿线）连接，共同代表双标记探针。探针和通用引物（黑色箭头）与与掺入的等位基因尾序列互补的链退火。在 PCR 过程中，Taq 聚合酶的 5' 核酸酶活性降解探针，释放荧光团并产生荧光信号。一起代表双标记探针。探针和通用引物（黑色箭头）与与掺入的等位基因尾序列互补的链退火。在 PCR 过程中，Taq 聚合酶的 5' 核酸酶活性降解探针，释放荧光团并产生荧光信号。一起代表双标记探针。探针和通用引物（黑色箭头）与与掺入的等位基因尾序列互补的链退火。在 PCR 过程中，Taq 聚合酶的 5' 核酸酶活性降解探针，释放荧光团并产生荧光信号。

 

阻止修改。ASP 中的 RNA 碱基位于目标 SNP 位置的下游（图 1 (A)）。

 

只有在完美匹配的 RNA-DNA 异源双链体存在时，封闭的引物才能被 RNase H2 酶有效激活。一旦 RNase H2 切割引物，3' 端可用于突变 Taq DNA 聚合酶的延伸（图 1 (B)）。每个 ASP 都有一个独特的 5' 尾序列，该序列被整合到等位基因特异性扩增子中。尾部区域为通用引物和荧光探针的结合添加了必要的序列（图 1 (C)）。试验的设计使得参考等位基因在 FAM 染料通道中发出信号，而替代等位基因信号在 VIC ®染料通道中检测到。替代等位基因荧光团是 Yakima Yellow ®，其激发和发射光谱与 VIC 染料非常相似。有了这种相似的激发和发射曲线，就不需要重新校准光谱。

 

3.2. 野生型与突变型 Taq DNA 聚合酶的比较

 

虽然 RNase H2 酶在存在或不存在错配 RNA-DNA 异源双链体 [ 2 ]的情况下对 RNA 碱基的酶促切割速率表现出显着差异，但 rhAmp SNP 测定还需要 DNA 聚合酶来完成等位基因特异性 PCR。开发了一种新型突变 Taq DNA 聚合酶，可在与 RNase H2 酶相同的缓冲液中有效发挥作用，与野生型 Taq DNA 聚合酶相比，它提供了改进的等位基因识别。图 2显示了两种预混液在等位基因鉴别 (AD) 图中的性能差异，一种含有野生型 Taq DNA 聚合酶（图 2 (A)），另一种含有突变型 Taq DNA 聚合酶（图 2 ）(B))，以用于检测 SNP rs2269829 的示例分析为例。在每次反应 3 ng gDNA 输入的情况下，总共测试了 46 个不同的人类 gDNA 样本。使用野生型 Taq DNA 聚合酶，可以自动调用三个基因型簇，但是，簇分离相对较差，可能是由于 ASP 错误引发，并且一些无模板对照重复从原点漂移。用突变版本替换 Taq 可以提高基因型簇的分离度、紧密度和角度。

 

3.3. rhAmp SNP 基因分型检测的性能

 

在从公共 dbSNP 数据库中随机选择的 1000 个常见人类 SNP 中，成功为 950 个目标 (95%) 生成了 rhAmp SNP 分析设计。使用 46 个基因组 DNA 样本（人类 SNP 组）测试的 130 个测定的随机选择子集的功能测试结果总结在表 1中。图 3显示了针对人类 SNP rs6068816 和 rs4148946 的 rhAmp SNP 基因分型分析的两个示例。rhAmp SNP 检测的总体性能显示出 98% 的检出率和 99% 的准确度（与 NCBI 数据库中公布的基因型一致），同时保持较高的检测设计率。

 

 

 

图 2。一种新的突变 Taq DNA 聚合酶提高了等位基因的鉴别能力。在针对人类 SNP (rs2269829) 的 rhAmp SNP 基因分型分析中，在来自 46 个个体的 3 ng gDNA 存在下，比较了用野生型 (A) 或突变型 (B) Taq DNA 聚合酶配制的 rhAmp SNP 基因分型预混液。随着 SNP 位点特异性的提高，含有突变 Taq DNA 聚合酶的反应导致较低的非特异性信号和更大的簇角分离。

 

 

DNA输入对rhAmp SNP基因分型的影响

 

由于生物样本有限、纯化损失和其他原因等因素，DNA 输入可能会有所不同。由于较低的荧光信号，低样本输入可能会影响 SNP 基因分型调用的质量。因此，确定可以提供稳健基因分型调用的 DNA 输入范围非常重要。我们测试了 rhAmp SNP 系统的输入 DNA 下限（图 4）。针对人类 SNP (rs4657751) 的 rhAmp SNP 测定在 QuantStudio 7 上以 0（无模板对照或 NTC）、0.125（蓝色）、0.5（绿色）和 3（橙色）ng/PCR 反应的 gDNA 存在的情况下进行测试弹性仪器。使用 0.5 和 3 ng gDNA 可以准确自动调用 46 个单独 gDNA 样本的基因型，并且可以使用 0.125 ng gDNA 手动调用。对于一些测试的分析，可以使用低至 25 pg 的样本输入手动调用准确的基因型

 

 

 

图 3。针对两个人类 SNP rs6068816 (A) 和 rs4148946 (B) 的 rhAmp SNP 测定示例，每个 SNP 具有参考等位基因 C 和备用等位基因 T。收集 PCR 后读取数据并标准化等位基因 1 (FAM) 的报告信号 (Rn)和等位基因 2（Yakima Yellow）分别沿 X 轴和 Y 轴绘制。等位基因鉴别图显示三个不同的基因型簇，包括参考等位基因 C/C（红色）的纯合子、杂合子 C/T（绿色）和备用等位基因 T/T（蓝色）的纯合子。在 5 μL 反应中对 46 个人类 gDNA 样品进行了测定。

 

 

 

图 4。gDNA 输入对 rhAmp SNP 基因分型的影响。针对人类 SNP (rs4657751) 的 rhAmp SNP 测定的等位基因鉴别图显示在 gDNA 的存在下，每个反应为 0（无模板对照）、0.125（蓝色）、0.5（绿色）和 3（橙色）ng。在含有 0.5 和 3 ng gDNA 的反应中，使用 QuantStudio 实时 PCR 软件可以准确地自动调用 46 个单独 gDNA 样本的基因型，并且可以使用 0.125 ng gDNA 手动调用。

 

（数据未显示）。

 

rhAmp SNP 基因分型与各种 qPCR 平台的兼容性

 

本研究中的所有 rhAmp SNP 测定最初是在 QuantStudio 7 Flex（Thermo Fisher）和 CFX384（BioRad）仪器上使用 3 ng 基因组 DNA 或 1000 拷贝 gBlocks 基因片段进行评估的。为了证明小容量平台的兼容性，一些分析在 IntelliQube（LGC Group）和 Biomark HD 系统（Fluidigm）上进行了测试。UGT2B7 基因中人类 ADME SNP rs7668258 的等位基因鉴别图示例显示在四个不同平台上：QuantStudio 7 Flex（图 5 (A)）、CFX384（图 5 (B)）、IntelliQube（图 5 (C) ) 和 Biomark HD (图 5(D))。对于 QuantStudio 7 Flex 和 CFX384，该测定使用来自 90 个人的 3 ng gDNA 和 5 µL 的反应体积进行测试。在 IntelliQube 上测试了相同的 gDNA 样品，每次反应 1.6 ng，反应体积为 1.6 µL。对于 Biomark HD，该测定使用来自 90 个 ADME SNP gDNA panel 样本子集的 23 个 Coriell gDNA 样本进行测试，每个样本的每个进样量为 150 ng。如方法中所述，对热混合方案进行了修改，以实现最大的测定灵敏度和特异性。rhAmp SNP 检测在这四种主要的 SNP 基因分型平台上表现良好，在所有测试样品中都实现了相似的簇角和一致的基因分型调用。

 

3.4. TaqMan 与 rhAmp SNP 基因分型

 

稳健的 SNP 基因型调用需要相对较高的荧光信号、较大的簇角分离和紧密的簇。在对 18 个目标 SNP 的研究中，rhAmp SNP 测定产生的两个等位基因的信号平均比 TaqMan 高至少两倍（补充图S1）。比较了通过 rhAmp SNP 和 TaqMan 基因分型化学分析的 ADME SNP rs776746 的等位基因区分图和原始荧光（图6）。rhAmp SNP 检测对所有样本都实现了更高的信号（图6（A）），杂合子样本中的两个等位基因的信号更均匀（图6（B）），导致杂合子簇角更接近理想的 45 度。

 

4。讨论

 

使用靶标特异性荧光探针或等位基因特异性引物进行 SNP 基因分型，例如 TaqMan [ 3 ] 和 KASP 测定 [ 4 ]，是医学和农业中常用的两种方法。Broccanello 等人首次报道了一种基于等位基因特异性 rhPCR 结合通用荧光报告系统的新方法 rhAmp SNP 基因分型。[ 5 ]。这种新的 SNP 基因分型方法与 TaqMan 和 KASP 相比具有几个优点。

 

首先，rhAmp SNP 基因分型化学是一种双酶系统，具有改进的等位基因特异性 PCR 的特异性，从而产生更好的基因分型簇角和分离（图 2）。Dobosy 和他的同事 [ 2 ] 比较了使用未修饰 PCR 引物的等位基因特异性 PCR 与 3' 封闭 rhPCR 引物的特异性。在 12 种错配组合中，未修饰引物的 ΔCq（错配 Cq ? 匹配 Cq）的中等鉴别率平均为 7.4，3' 封闭引物平均为 10.9，这表明 rhPCR 在等位基因鉴别方面至少比标准 PCR 好 5 倍 [ 2 ] . 其次，rhAmp SNP 基因分型等位基因特异性和基因座特异性引物无活性

 

 

 

图 5。rhAmp SNP 基因分型与各种 qPCR 平台的兼容性。显示针对人类 ADME SNP rs7668258 的 rhAmp SNP 测定的等位基因鉴别图，其中基因分型自动调用分配给在 QuantStudio 7 Flex (A)、CFX384 (B)、IntelliQube (C) 和 Biomark HD (D) 上运行的样品。等位基因 1 和等位基因 2 调用表明纯合基因型。Allele1/Allele2 call 表示杂合基因型。

 

 

 

图 6。rhAmp 和 TaqMan SNP 基因分型的比较。用来自 90 个个体的 3 ng gDNA 测试了针对 CYP3A5 基因中人类 ADME SNP rs776746 的测定。所有样品的等位基因鉴别图显示 rhAmp 测定 (A) 的信号更高且簇分离更好，5 个杂合基因型样品的多组分扩增曲线显示 rhAmp SNP 测定的信号更高且更均匀 (B)。

 

最初由于 3' 末端封闭基团。只有在与其完美匹配的目标杂交后，3' 封闭基团才容易被 RNase H2 切割去除。因此，在没有靶 DNA 的情况下，引物二聚体被消除或显着减少（数据未显示）。部分由于检查引物与引物相互作用的宽松规则实现了高测定设计率（表 1 ）。第三，rhAmp SNP 基因分型方法消除或减少了来自通用报告基因的非特异性信号，这些信号通常由引物二聚体引起。一些 KASP 检测在没有靶标或 NTC 孔的情况下会产生错误的基因分型簇，这通常是由于非特异性相互作用 [ 6] . TaqMan 探针和 PCR 引物之间的非特异性相互作用也会在一些 TaqMan SNP 基因分型分析中引起更高的 NTC 信号 [ 7 ]。接下来，减少引物二聚体和使用通用报告基因与 rhAmp SNP 基因分型系统使多重 SNP 基因分型成为可能。在单个 PCR 反应中同时检测两个 SNP 将降低分析成本并增加通量（未发表的数据）。最后，对任何 SNP 或任何物种使用通用报告系统不仅会产生高荧光信号（图 6），而且使 SNP 基因分型具有成本效益。

 

5. 结论

 

总之，我们已经成功地将一种新的 rhPCR 方法应用于现有的 qPCR 仪器（如 QuantStudio 7 Flex、CFX384、IntelliQube 和 Biomark HD）上从纯化的 gDNA 中进行 SNP 基因分型。该方法为生物医学和农业应用提供了一种高性能且具有成本效益的 SNP 基因分型解决方案。

 

补充

 

 

 

图S1。rhAmp 和 TaqMan SNP 基因分型之间的信噪比比较。针对 18 个人类 SNP 的分析在 5 µL 反应中使用来自 46 个个体的 3 ng Coriell gDNA 进行了测试，并在 QuantStudio 7 Flex 实时 PCR 系统软件 (Thermo Fisher) 上收集和分析了 PCR 后读取数据。通过计算纯合簇与无模板对照 (NTC) 的距离（从每个纯合样品的在靶等位基因信号中减去平均测定 NTC 信号）来确定每个等位基因的信噪比。与 Taqman 相比，rhAmp SNP 基因分型在所有 18 次测定中导致两个等位基因的簇到 NTC 距离更高（A），在 18 次测定中平均簇到 NTC 距离高出 2 倍以上（B）。

 

号码	dbSNP rsID	多态性	号码	dbSNP rsID	多态性	号码	dbSNP rsID	多态性
1	rs1013087	电汇	46	rs2045434	电汇	91	rs6908755	C/T
2	rs10280568	C/A	47	rs2283270	C/T	92	rs6918402	总账
3	rs10422074	电汇	48	rs2286163	总账	93	rs6976501	C/T
4	rs1049434	电汇	49	rs2289221	电汇	94	rs6977778	C/T
5	rs11131763	C/G	50	rs2707507	C/T	95	rs6987931	总帐
6	rs11203651	C/T	51	rs2744290	电汇	96	rs7000593	C/T
7	rs11243026	总帐	52	rs27843	电汇	97	rs7141006	总账
8	rs1135093	A/G	53	rs2823211	在	98	rs7228817	总账
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10	rs11726362	在	55	rs28626972	总账	100	rs7304811	总帐
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16	rs11986143	电汇	61	rs4388130	电汇	106	rs7591813	C/A
17	rs11996643	C/T	62	rs4591363	总账	107	rs7669896	总账
18	rs12054049	C/A	63	rs4646406	电汇	108	rs7687806	电汇
19	rs12141503	总账	64	rs4653334	总帐	109	rs7704188	电汇
20	rs1217974	A/G	65	rs4867403	总账	110	rs7717092	总账
21	rs12197997	电汇	66	rs4907732	A/G	111	rs7743013	A/G
22	rs12279214	C/A	67	rs4911456	总账	112	rs7753012	T/G
23	rs12372167	GC	68	rs4971525	电汇	113	rs7760561	A/G
24	rs12420422	C/T	69	rs5019104	A/G	114	rs7871600	C/T
25	rs12507217	C/T	70	rs5030740	C/T	115	rs7939374	总账
26	rs12537914	总账	71	rs540719	电汇	116	rs7949609	C/T
27	rs12568373	总账	72	rs6016306	总账	117	rs7966055	A/G
28	rs12574217	C/T	73	rs6054484	C/G	118	rs8030470	C/T
29	rs12576497	C/T	74	rs606373	C/T	119	rs8095910	A/G
30	rs12587509	电汇	75	rs6080387	C/T	120	rs8104441	A/G
31	rs12593964	空调	76	rs6115865	总账	121	rs9346650	总账
32	rs12597401	A/G	77	rs6432323	A/G	122	rs9369584	C/T
33	rs12600458	总账	78	rs6441819	A/G	123	rs9372649	电汇
34	rs1269628	A/G	79	rs6452030	电汇	124	rs9482300	电汇
35	rs12933889	电汇	80	rs6452908	电汇	125	rs9500864	总账
36	rs12992152	总账	81	rs6553586	C/T	126	rs9506510	总账

表 S1。本研究中使用的来自 dbSNP Build 144 的人类 SNP 列表。

46 个人 SNP gDNA 面板		90 ADME SNP gDNA 面板
NA10853	NA18558	NA10859	NA17123	NA17202	NA17230
NA10855	NA18572	NA14474	NA17124	NA17203	NA17231
NA10856	NA18576	NA14476	NA17125	NA17204	NA17232
NA11829	NA18582	NA17102	NA17126	NA17205	NA17235
NA11830	NA18603	NA17103	NA17127	NA17206	NA17237
NA11831	NA18611	NA17104	NA17128	NA17207	NA17239
NA11832	NA18620	NA17105	NA17129	NA17208	NA17240
NA11839	NA18623	NA17107	NA17130	NA17209	NA17241
NA11843	NA18633	NA17108	NA17131	NA17210	NA17242
NA11882	NA18637	NA17109	NA17132	NA17211	NA17245
NA12376	NA18854	NA17110	NA17134	NA17212	NA17247
NA12383	NA18859	NA17111	NA17136	NA17213	NA17251
NA12399	NA19093	NA17112	NA17137	NA17214	NA17253
NA12400	NA19098	NA17113	NA17139	NA17215	NA17254
NA12489	NA19099	NA17114	NA17140	NA17216	NA17255
NA12546	NA19101	NA17115	NA17144	NA17217	NA17258
NA18506	NA19102	NA17116	NA17147	NA17220	NA17259
NA18522	NA19130	NA17117	NA17148	NA17221	NA17260
NA18526	NA19131	NA17118	NA17149	NA17223	NA17261
NA18529	NA19141	NA17119	NA17155	NA17225	NA17262
NA18537	NA19172	NA17120	NA17188	NA17226	NA17263
NA18545	NA19192	NA17121	NA17194	NA17227
NA18552	NA19208	NA17122	NA17201	NA17228

表 S2。研究中使用的人类基因组 DNA 样本列表。DNA 来自科里尔医学研究所，包括来自三个原始 HapMap 人群的样本：来自伊巴丹的约鲁巴人 (YRI)、来自中国北京的汉人 (CHB) 和 CEPH 犹他州居民 (CEU)。

dbSNP ID	目标基因	rhAmp SNP 设计 ID	Taqman 检测 ID
rs2273697	ABCC2	Hs.ADME.rs2273697.A.1	C__22272980_20
rs717620	ABCC2	Hs.ADME.rs717620.T.1	C___2814642_10
rs762551	CYP1A2	Hs.ADME.rs762551.A.1	C___8881221_40
rs776746	CYP3A5	Hs.ADME.rs776746.C.1	C__26201809_30
rs1143671	SLC15A2	Hs.ADME.rs1143671.T.1	C____385930_60
rs1143672	SLC15A2	Hs.ADME.rs1143672.A.1	C___7504282_30
rs6068816	CYP24A1	Hs.GT.rs6068816.T.1	C__25620091_20
rs2295475	XDH	Hs.GT.rs2295475.A.1	C__25473873_30
rs4148946	CHST3	Hs.GT.rs4148946.T.1	C___1904468_20
rs3749442	ABCC5	Hs.GT.rs3749442.A.1	C____479128_40
rs1049434	SLC16A1	Hs.GT.rs1049434.T.1	C___2017662_30
rs2269829	PON1	Hs.GT.rs2269829.G.1	C___2548961_1_
rs13126239	ARAP2	Hs.GT.rs13126239.A.1	C___1485150_10
rs4073846	桅杆2	Hs.GT.rs4073846.G.1	C____37954_10
rs332433	基因间	Hs.GT.rs332433.G.1	C___7951370_10
rs1799865	CCR2	Hs.GT.rs1799865.C.1	C___2610509_30
rs495529	MIR3658，UCK2	Hs.GT.rs495529.G.1	C____19642_1_
rs4657751	基因间	Hs.GT.rs4657751.A.1	C_29085526_10

表 S3。本研究中使用的 rhAmp SNP 和 TaqMan SNP 基因分型分析 ID 列表。

 

笔记

 

*这些作者同等贡献这项工作。

 

利益冲突

 

作者宣称没有利益冲突。

 

参考

 

[ 1 ] Kim, S. 和 Misra, A. (2007) SNP 基因分型：技术和生物医学应用。生物医学工程年度回顾，9，289-320。

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[ 3 ] Livak, KJ (1999) 使用荧光探针和 5' 核酸酶分析的等位基因鉴别。遗传分析：生物分子工程，14, 143-149。

[ 4 ] Neelam, K.、Brown-Guedira, G. 和 Huang, L. (2013) 小麦叶锈病抗性基因座 Lr21 的育种者友好型 KASPar 标记的开发和验证。分子育种，31，233-237。

[ 5 ] Broccanello, C.、Chiodi, C.、Funk, A.、McGrath, JM、Panella, L. 和 Stevanato, P. (2018) 植物 SNP 基因分型的三种基于 PCR 的检测方法的比较。植物方法, 14, 28.

[ 6 ] Semagn, K.、Babu, R.、Hearne S. 和 Olsen, M. (2014) 使用竞争性等位基因特异性 PCR (KASP) 进行单核苷酸多态性基因分型：技术概述及其在作物改良中的应用。分子育种，33，1-14。