以黑曲霉菌丝体粉为底物，进行固态发酵产链霉菌壳聚糖酶。试验结果表明，最佳培养基为麦麸和黑曲霉菌丝体粉，初始含水量为60%～70%。在28 ℃～30 ℃、初始pH 6.5条件下培养5天后酶活达到41.33 U/g干培养基。在孵育的第二天检测到壳聚糖酶，并在第 5 天时具有最大活性，并在 1 个月内逐渐下降。固态发酵可能是生产中的一种经济替代方案。
关键字
链霉菌,固态发酵,壳聚糖酶,废菌丝体
一、简介
壳聚糖是一种阳离子氨基多糖，具有 b-1,4-连接的 D-葡萄糖胺 (Glc N) 残基的线性结构 [ 1 ]。它广泛存在于真菌、甲壳类动物、昆虫和一些藻类中。甲壳素和壳聚糖在食品和营养、化妆品、包装和保鲜、纺织、废水处理、固定化和农业等领域的大量应用已得到充分证明[ 2 ][ 3 ]。壳聚糖可通过化学或酶促方法降解为壳聚糖寡糖（COSs）[ 4 ]。COS 的功能特性取决于它们的分子量。聚合度为 2 - 20 的 COS 具有良好的生物活性，包括抗肿瘤、抗真菌和抗菌活性 [ 5] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]。壳聚糖酶（EC 3.2.1.132）被表征为一种催化壳聚糖裂解形成COS的酶。在 CAZy（碳水化合物活性酶）数据库中，壳聚糖酶通常分为六个糖苷水解酶 (GH) 家族，包括 GH-5、GH-7、GH-8、GH-46、GH-75 和 GH-80。壳聚糖酶主要存在于细菌[ 9 ]和真菌细胞[ 10 ][ 11 ]中。但由于微生物系统中的壳聚糖酶发酵水平太低而无法分离并用于工业制备，因此存在一些商业化的缺点。成本是另一个关键因素。
Streptomyces albolongus ATCC 27414 是一种来自Streptomyces sp. 属的细菌，已被发现可产生壳聚糖酶，即 GH-46 壳聚糖酶 [ 12 ]。链霉菌属是迄今为止微生物界中最大的抗生素生产属。固态发酵（SSF）是一项面临新挑战的传统发酵技术。具有生产效率高、工艺简单、操作范围广、能耗少、废液少、产品分离容易等优点，与液体发酵（SMF）相比，生产成本更低。随着人们对节能减排和减少环境污染的重视，SSF技术越来越受到人们的重视。采用固态发酵技术生产壳聚糖酶具有较好的经济效益和环境效益 [ 13 ] [ 14 ] 。
近年来，关于细菌和真菌发酵生产壳聚糖酶的报道较多，主要是利用壳聚糖或甲壳素在液体发酵中诱导壳聚糖酶的产生。使用壳聚糖酶时，需要将底物预先溶解在酸性溶液中制成凝胶。为了降低成本，壳聚糖酶通常需要先进行冷冻干燥，浪费了大量的水和能源，昂贵的诱导剂增加了生产成本 [ 15 ] [ 16 ] [ 17]. 固态发酵 (SSF) 接近自然环境，选定的微生物，尤其是真菌，可以在自然环境中自然培养。它可以被认为是一个“封闭系统”，发生在没有或几乎没有自由水的情况下。由于大大降低了生产成本和直接适用性，无需下游加工的 SSF 酶（廉价的原位酶、粗酶）可能是某些应用的极佳候选者 [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。
本研究以柠檬酸行业常用的黑曲霉废弃菌丝体为诱导材料，通过白长链霉菌固态发酵产壳聚糖酶。用于壳聚糖酶生产的低成本培养基可以促进工艺优化，以在工业规模上经济地生产微生物壳聚糖酶。
2。材料和方法
2.1. 微生物和培养基
根据以下方法制备菌丝体粉末。来自柠檬酸生产厂的黑曲霉废菌丝体只需用沸腾的 30% - 40% NaOH 水溶液处理 4 - 6 小时 [ 22 ]。121℃烘干粉碎后得到菌丝体粉末，经茚三酮测定壳聚糖含量为13.62%[ 23 ]。
在开始 SSF 之前，在固体培养基中预培养白长链霉菌ATCC 27414。固体培养基由1%可溶性淀粉、0.2%(NH4) 2 SO 4、0.2%CaCO 3、0.1% NaCl、0.1% K 2 HPO 4、0.05% MgSO 4 ·7H 2 O和2%琼脂组成。孢子在无菌水中用 5 ml 0.05% Tween-80 洗涤，并通过以 3000 x g 离心 10 分钟来收集。每毫升悬浮液含有约10 8个孢子。固态培养基含(g)：菌丝体粉10、麦麸20、(NH 4 )2SO 4 1、CaCO 3 0.5、NaCl 0.2、KH 2P0 4 0.2和MgSO 4 ·7H 2 O 0.1。将培养基与种子培养物充分混合，然后用蒸馏水将初始水分含量调节至 60%。孵育在 28˚C 下进行 2 - 5 天。
2.2. 壳聚糖酶的制备
取一瓶固体培养基，加入100 mL醋酸缓冲液（pH 5.6，20 mmoL/L）。破碎后，将介质机械搅拌 1 小时。四层纱布用于过滤。收集滤液，冷冻干燥，得壳聚糖酶溶液供测定。
2.3. 酶活性测定
壳聚糖酶活性是在 40˚C 下通过使用改良的二亚硝基水杨酸 (DNS) 方法估计糖的还原端的量来测定的，以氨基葡萄糖·HCl 作为校准标准。1个壳聚糖酶单位定义为在上述条件下每分钟释放1摩尔还原糖所需的酶量。每次分析进行三次重复。
2.4. 固态发酵和条件优化
考察了不同初始水分含量对壳聚糖酶产生的影响。测试的水分含量在 50% 和 80% 之间。培养基在 121°C 下灭菌 20 分钟。接种无菌培养基并加入适当体积的无菌蒸馏水以补充所需的水分含量。然后将它们在 30˚C 的烧瓶中静置培养 2 - 5 天，每天搅拌一次。
研究了合适碳源的影响。选择了麦麸、糖蜜粉、玉米粉和稻草。每10g菌丝体粉中碳源的添加量为20g。SSF的温度和周期分别为30˚C和2-5天。
在优化SSF培养基后，逐步优化初始接种量、发酵温度、初始pH和发酵时间等发酵条件。初始接种量从 5% 到 15%（5%、8%、10%、12% 和 15%）不等。发酵温度从 25˚C 到 38˚C（25˚C、28˚C、30˚C、35˚C 和 38˚C）不等。初始 p H 包括从 5 到 7.5（5、5.5、6、6.5、7 和 7.5）。从 3 天到 7 天监测发酵时间的影响。
2.5. 壳聚糖酶产品的特性
取壳聚糖酶溶液，测定其在不同温度、pH、底物浓度等条件下的酶活，研究其最适温度、最适pH、温度稳定性、酸碱稳定性等性质。
3。结果与讨论
3.1. 初始水分含量对固态发酵产壳聚糖酶的影响
在生物、加工、环境和经济方面，SSF 优于深层发酵。一般来说，固态生物反应器的设计应侧重于水分含量控制，因为它影响 O 2转移、CO 2释放和监测温度，进一步改变孢子萌发效率和酶生产 [ 18 ]。物料的水分含量对固态发酵过程中细菌的生长和产物的积累起着关键作用。这可能是由于高水分含量可能导致低基质孔隙率导致氧转移减少，而低水分含量可能导致养分扩散不良 [ 24 ] [ 25 ]] [ 26 ]。
本研究调查了初始含水量对固态发酵生产壳聚糖酶的影响。在发酵过程中，活性在第 3 天首次检测到，在第 5 天达到最大产量，然后逐渐下降。如图1所示，初始水分含量为60％～70％时，壳聚糖酶产量增加，其最大值为67％(27.32U/g)。当初始水分含量低于 50% 时，壳聚糖酶的产量很低，因为底物太干燥，不利于细胞生长。在初始水分含量为 80% 时，总
图 1。初始水分含量对固态发酵产壳聚糖酶的影响。
生物测定仅为 0.61 mg/g，因为底物的聚集性阻止了气体交换。
3.2. 不同碳源对固态发酵产壳聚糖酶的影响
此外，碳源是培养微生物的重要限制因素。黑曲霉的菌丝体可用作诱导剂。当然，它也作为碳源提供生长所必需的。
发现最佳初始水分为60%～70%，而新鲜菌丝的水分为80%左右。我们决定在新鲜菌丝体中补充一些不溶于水的碳源，这样既可以弥补碳源的不足，又可以降低水分。纤维素分解材料在全球范围内随处可见，可被多种微生物使用，例如链霉菌[ 27 ] [ 28 ]。农副产品主要用作 SSF 的底物，因为它具有生产成本低和环境友好的优点。例如，曾 X等人。由链霉菌从麦麸、菜籽饼、稻壳中提取纳他霉素gilvosporeus Z28 通过固态发酵，导致原料成本降低 50.05%，能耗和废水排放量减少 [ 29 ]。麦麸、糖蜜麸、米糠、玉米粉、小米谷物、小麦片、大麦麸、碎玉米、玉米芯和碎小麦等固体底物被研究用于淀粉酶生产 [ 30 ]。
如图 2所示，选择麦麸、糖蜜粉、玉米粉和稻草作为碳源。每10g干菌丝添加碳源20g，水分68%。4种碳源中，麦麸对壳聚糖酶的积累效果较好，壳聚糖酶产量达到30.05 U/g。在这项研究中，选择麦麸糖蜜粉作为高产的补充碳源。
图 2。不同碳源对固态发酵产壳聚糖酶的影响
3.3. 优化壳聚糖酶生产的固态发酵条件
为了在选择最佳碳源后获得最佳发酵参数，还研究了初始接种物、温度和初始pH对壳聚糖酶产率的影响。初始接种量会影响细菌的生长和代谢物积累的产量。合适的初始接种量可以帮助我们获得更多的壳聚糖酶产量。如果初始接种量过低，细菌的生长将长期处于滞后期。无助于获得代谢物。另一方面，高水平的初始接种量会导致细菌大量生长。溶解氧减少，菌丝体易断裂，代谢产物减少。在我们的研究中（图 3(a))，壳聚糖酶的最佳产量为 35.47 U/g，接种量为 10% (v/w)。
在研究了初始接种量的影响后，研究了温度与壳聚糖酶产量之间的关系。如图3 (b)所示，最佳发酵温度为28℃～30℃，壳聚糖酶产量提高至36.85 U/g。
此外，发酵pH值也是影响生长的重要因素
图 3。优化 SSF 条件。(a) 接种量，(b) 发酵温度，(c) 初始 pH。
细菌及其产物的合成。在固态发酵过程中还研究了初始 pH 值对壳聚糖酶生产的影响。如图3 (c)所示，微酸性环境有利于壳聚糖酶的积累。最适宜的pH为6.5，壳聚糖酶的产率达到41.33 U/g。
在孵育的第二天检测到壳聚糖酶，并在第 5 天时具有最大活性，并在 1 个月内逐渐下降。它是在滞后期或稳定期合成和分泌的次级代谢产物。在深层发酵中，由于细胞自溶，长时间孵育后活性急剧下降。固态发酵产生的产品比深层培养的产品更稳定，而且需要的能量输入更少 [ 31 ]。它可以暂时存储而不会显着失去活性。得出结论，固态发酵可能是生产中的一种经济替代方案。
致谢
本工作得到中央公益性科研机构基础研究基金中央基金项目（编号：20603022019023、20603022017006）和枣庄市自主创新与成果转化（编号：2019GH01）的资助。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
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