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酿酒酵母多磷酸酶 PPN1 (uniprot/Q04119) 通过从链端切割 Pi 和将长链聚合物分解成较短的聚合物来降解无机多磷酸盐。在这项研究中，我们发现了这种蛋白质的新活性：它从 dATP 中释放磷酸盐。与外聚磷酸酶活性相比，纯 PPN1 的 dATP 磷酸水解酶活性低约 7 倍。该活性受 Co 2+离子以及铵离子的强烈刺激，并被肝素和焦磷酸盐抑制，类似于 PPN1 的外聚磷酸酶活性。dATP 的 Km 值为 0.88 ± 0.14 mM。PPN1 过表达酵母菌株细胞中的 dATP 磷酸水解酶活性比亲本菌株高几倍。另一种外聚磷酸酶酿酒酵母PPX1 不会从 dATP 中分离出 Pi。

 

 

一、简介

 

无机聚磷酸盐 (PolyP) 是一种多功能生物聚合物，在从原核生物到人类的所有活细胞中执行许多细胞功能 [ 1 ] - [ 8 ]。PolyP 代谢酶催化其他底物转化的能力是这些蛋白质参与调节途径的原因之一。例如，gppA 外聚磷酸酶将 Pi 从鸟苷 5'-三磷酸、3'-二磷酸和鸟苷 5'-二磷酸、3'-二磷酸、细菌第二信使中分离出来 [ 9 ]。一些细菌外聚磷酸酶显示出 NTP 酶活性 [ 10 ]。属于多磷酸激酶 2 亚家族的酶催化核苷单磷酸磷酸化 [ 11] 。铜绿假单胞菌的外聚磷酸酶是一种多磷酸盐：ADP磷酸转移酶[ 12 ]。酿酒酵母蛋白 DDP1（一种二腺苷和二磷酸肌醇多磷酸磷酸水解酶）具有内多磷酸酶活性 [ 13 ]。酿酒酵母的外聚磷酸酶 PPX1 可水解四磷酸腺苷磷酸水解酶和四磷酸鸟苷磷酸水解酶活性 [ 14 ]。多磷酸酶PPN1

 

( http://www.uniprot.org/uniprot/Q04119 ) S. cerevisiae 通过从链端切割 Pi 和将长链聚合物分裂成较短的聚合物来降解 PolyP [ 15 ] [ 16 ]。Co 2+存在时Pi释放占主导地位，而Mg 2+存在时高分子PolyP的断裂占主导地位[ 16 ] 。这种酶的其他底物是未知的；PPN1的焦磷酸酶活性极低[ 17 ]。我们尝试使用纯重组 PPN1 [ 18 ] 来揭示 PCR 反应产物中具有高水平焦磷酸盐的 PolyP [ 19 ]] 。在这些实验中，用 PPN1 处理 dNTP 混合物导致 Pi 释放；即PPN1催化了以下反应：

 

 

 

本研究旨在表征以 dATP 为底物的 PPN1 的 dNTP 磷酸水解酶活性。

 

2。材料和方法

 

2.1. 菌株生长

 

酿酒酵母的ΔPPN1突变菌株CRN获自N. Rao和A. Kornberg [ 15 ]。过表达多磷酸酶 PPN1 的酿酒酵母菌株 CRN/pMB1_PPN1 Sc 是由 Eldarov 和早期的合作者设计的 [ 20 ]。酵母菌株在含有（每 1 升）1.7 克细菌酵母氮碱（Difño，底特律，美国）、20 克葡萄糖、20 毫克 L-色氨酸、L-组氨酸、L-蛋氨酸和腺嘌呤，以及 60 毫克 L-亮氨酸。添加尿嘧啶 (20 mg/l) 用于培养菌株 CRN。细胞在 29˚C 摇动 (145 rpm/h) 下培养至稳定生长期。

 

2.2. PPN1纯化

 

如[ 18 ]所述获得细胞提取物。菌株 CRN/pMB1_PPN1 Sc 的细胞提取物用于纯化多磷酸酶 PPN1，方法是结合早期设计的用于获得纯 PPN1 的方法 [ 18]] 。向细胞提取物补充硫酸铵至 50% 饱和度并孵育 1 小时，然后以 12,000 g 离心 20 分钟。将上清液吸附在用 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) 和 50% 硫酸铵平衡的 Butyl-Toyopearl 650 M 上。在 45 分钟内，树脂在 4000 g 下沉淀 3 分钟，并用含有 50% 硫酸铵的 50 mM Tris-HCl，pH 7.2 洗涤 3 次。对于多磷酸酶洗脱，树脂用含有 25% 硫酸铵的 50 mM Tris-HCl，pH 7.2 洗涤四次。将 Triton X-100 (0.05%) 添加到制剂中。通过 YM-10 膜超滤后，将溶液应用于 DEAE-Toyopearl 650 M 柱（1.5 × 7.5 cm），用 25 mM Tris-HCl，pH 7.2 和 0.1% Triton X-100 平衡。用 50 ml 相同的缓冲液洗涤柱子，然后用 50 ml 0.1 M KCl 的相同缓冲液洗涤。多磷酸酶以 24 ml/h 的流速在同一缓冲液中随着 KCl 浓度的增加 (0.1 - 0.8 M) 被洗脱。梯度体积为 200 毫升。合并具有多磷酸酶活性的部分，通过超滤浓缩，并与肝素-琼脂糖一起孵育 2 小时。树脂用 25 mM Tris-HCl，pH 7.2 和 0.1% Triton X-100 预平衡。肝素-琼脂糖用 10 ml 缓冲液洗涤，然后在相同缓冲液中用 5 ml 0.5 M KCl 洗涤 5 倍，使用 1500 g 离心 5 分钟。然后用 5 ml 0.7 M KCl 的缓冲液洗涤树脂两次；外聚磷酸酶在相同缓冲液中用 5 ml（4 倍）1 M KCl 解吸。该制剂对 polyP 的比活性为 208 - 2000 E/mg 蛋白质。用三氯乙酸沉淀后，用 Pierce Bradford 试剂测定蛋白质。制剂储存在-20℃。

 

2.3. 酶活性测定

 

在 0.1 ml 50 mM Tris-HCl，pH 7.2，含有 0.1 mM CoSO 4和 200 mM NH 4 Cl 的条件下，在 30˚ 下测定酶活性。MgSO 4、MnSO 4、ZnSO 4和其他添加剂的浓度在表和图的图例中指示。每1分钟释放1纳摩尔磷酸盐（Pi）的酶量作为酶活单位（mU）。平均链长为 208 个磷酸残基的无机聚磷酸盐 (polyP 208 ) (Monsanto, USA) 用作外聚磷酸酶的底物，浓度为 2.5 mM（浓度由磷估算）。PolyP 208如所述从焦磷酸盐和正磷酸盐中纯化 [21 ]。dATP（GE Healthcare Bio-Sciences Corp，立陶宛）、ATP、ADP 和焦磷酸盐 (Sigma) 的使用浓度为 2 mM。肝素来自捷克共和国的 Spofa。使用免疫板光谱仪（Sapfir，俄罗斯）用孔雀石绿 [ 22 ]测定释放的 Pi 。不含酶的样品中的 Pi 含量作为对照进行测定。

 

2.4. 统计数据

 

测定一式三份进行；均值和标准差用Excel计算。相关系数使用

 

http://www.alcula.com/calculators/statistics/correlation-coefficient/。

 

3. 结果

 

纯化的 PPN1 催化 Pi 从 dATP 中释放（表 1）。酿酒酵母的另一种外聚磷酸酶 PPX1（由 L. Lichko 友情提供）[ 23 ] 不会从 dATP 中分离 Pi（表 1）。这是令人惊讶的，因为 PPX1 对 polyP 3 [ 23 ] 以及四磷酸腺苷和四磷酸鸟苷 [ 14 ]更具活性。长链 PolyP 的 PPN1 活性最大，而 PolyP 3 [ 17 ] [ 18 ] 的活性较弱。与外聚磷酸酶活性相比，纯 PPN1 的 dATP 磷酸水解酶活性低约 7 倍（表 1). PPN1 与 ATP 的活性几乎是 dATP 的两倍；ADP 和 PPi 的活性仍然较低（表 2）。该酶的 dATPase 活性的浓度依赖性符合 Michaelis-Menten 方程，Km 为 0.88 ± 0.14 mM。

 

PPN1 的外聚磷酸酶活性表现出非米氏动力学，与 PolyP 208和 PolyP 3的表观 Km分别为 0.0035 和 1.1 mM [ 17 ]。PolyP 3 [ 17 ]和dATP的底物亲和力和水解速率相似。PPN1 的外聚磷酸酶和 dATPase 活性都被 NH 4 Cl (200 mM)刺激了近两倍（未显示）。

 

图 1显示了 dATPase 活性对二价阳离子浓度的依赖性。Co 2+比Mn 2+更有效；Mg 2+和Zn 2+没有刺激作用。肝素和 PPi 抑制了这种活性，ADP 的抑制作用很低（图 2）。二价阳离子和上述抑制剂对PPN1的dATP酶（图1、图2）和外聚磷酸酶[ 18 ]活性的影响相似。

 

PPN1 过表达酵母菌株的细胞提取物的 dATP 磷酸水解酶 (dATPase) 活性比亲本菌株高几倍（表 3）。这种增加与外聚磷酸酶活性的增加相当。此外，转化细胞的细胞提取物的 dATPase 和胞外多磷酸酶活性同样受到肝素的抑制，肝素是已知的多磷酸酶抑制剂 [ 1 ]，而 ΔPPN1 突变体细胞提取物的 dATPase 活性几乎不受肝素的影响。可能，一些其他酶在该菌株中执行 dATPase 活性。

 

酵素	不同底物的活性
	基质	活性，mU/ml
PPN1	聚丙烯208	244.0 ± 28.5
PPN1	dATP	34.9 ± 3.9
PPX1	聚丙烯208	311±32.0
PPХ1	dATP	0

表 1。酿酒酵母纯 PPN1 和 PPX1 的外聚磷酸酶和 dATP 磷酸水解酶活性。

基质	P i释放，控制百分比
dATP	100±5.0
三磷酸腺苷	57±5.0
ADP	20.0 ± 2.1
PPi	11.0 ± 1.0

表 2。PPN1 从一些底物 (2 mM) 释放 Pi。

 

 

 

图 1。Co 2+（白色方块）、Mg 2+（空心圆）、Zn 2+（黑色三角形）和Mn 2+（空心三角形）对多磷酸酶的dATP磷酸水解酶活性的影响

 

 

 

图 2。抑制剂对多磷酸酶 PPN1 的 dATP 磷酸水解酶活性的影响。在含有 0.1 mM CoSO 4和 200 mM NH 4 Cl的 50 mM Tris-HCl，pH 7.2 中测定活性

 

 

4。讨论

 

在这项研究中，我们发现了酿酒酵母蛋白 РРN1 的 dATP 磷酸水解酶活性。该活性类似于该蛋白的外聚磷酸酶活性，依赖于二价阳离子、NH 4离子的刺激以及肝素和 PPi 的抑制。活性按以下顺序降低：dATP > ATP > ADP。dNTP 混合物水解的初步数据表明了其他 dNTP 的水解能力。应该注意的是，酿酒酵母的 PPX1 外聚磷酸酶既不水解 dATP（本研究）也不水解 dNTP 混合物 [ 19 ]。

 

dNTPs 的分解代谢是由许多酶进行的。首先，碱性和酸性磷酸酶能够水解这些底物 。

 

其次，酵母的 DEAH-box 剪接因子 Prp22 可以以相当的效率水解所有常见的 NTP 和 dNTP [ 24 ]，催化反应：

 

(d) 三磷酸核苷 + H 2 O → (d) 二磷酸核苷 + 磷酸 (EC 3.6.1.15)。最后，脱氧核苷酸三磷酸三磷酸水解酶 (dNTPases) 将脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP) 水解为核苷和三聚磷酸 (3.1.5.B1, http://www.brenda-enzymes.org )。在哺乳动物细胞中，不育的 alpha 基序和含 HD 结构域的蛋白 1 (SAMHD1) 是一种 dNTP 酶，是细胞 dNTP 水平的主要调节因子 [ 25 ]。这种蛋白质通过耗尽细胞 dNTP 库来防止逆转录病毒（包括 HIV）对非分裂细胞的感染 [ 25 ]。讨论了 dNTP 代谢和 SAMHD1 在癌症发展中的重要性 [ 26]] 。似乎 dNTP 分解代谢在生物体或细胞群的生存需要降低增殖活性的条件下变得特别重要。为了进一步研究 PPN1 作为酵母细胞中细胞 dNTP 水平的推定调节剂的作用，有必要考虑以下两个事实。首先，PPN1 基因负责酵母细胞核中的外聚磷酸酶活性 [ 27 ]。其次，当细胞在 Pi 限制下生长时，ΔPPN1 突变体显示出细胞周期受损 [ 4 ]。

 

5.结论

 

酵母多磷酸酶 PPN1 是脱氧腺苷三磷酸磷酸水解酶，而外多磷酸酶 PPX1 不会从 dATP 中分离 Pi。该蛋白的外聚磷酸酶和脱氧腺苷三磷酸磷酸水解酶活性在离子和抑制剂作用方面相似。

 

致谢

 

作者感谢 Elena Makeeva 帮助准备手稿。这项研究得到俄罗斯基础研究基金会 (Grant 14-04-00515) 的支持。

 

缩略语表

 

PolyP―无机聚磷酸盐、PolyP208―平均链长为208个磷酸残基的无机聚磷酸盐、PolyP3―三聚磷酸盐、Pi―正磷酸盐、PPi―焦磷酸盐；dATPase——脱氧腺苷三磷酸磷酸水解酶。

 

利益冲突

 

作者宣称没有利益冲突。

 

参考

 

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