留学生论文网

蓖麻油是众多产品的来源，也是脂肪酸蓖麻油酸酯、12-羟基油酸酯的唯一商业来源。氢化蓖麻油作为 12-羟基硬脂酸的来源同样有用，12-羟基硬脂酸最出名的是锂基润滑脂的成分。单酰基和二酰基甘油衍生自蓖麻油，可用于开发用于化妆品、药物和食品的润滑剂和乳化剂。源自氢化蓖麻油的酰基甘油可能同样有用，尽管具有不同的物理和化学性质。我们评估了使用固定化脂肪酶生成酰基甘油，使用有机溶剂调节脂肪酶产生单酰基和二酰基甘油的作用，使用三（12-羟基硬脂酰）-甘油作为氢化蓖麻油的模型。

 

关键词

 

蓖麻油,酶,脂肪酶,二酰甘油,单酰甘油

 

一、简介

 

蓖麻油在商品种子油中是独一无二的，因为它含有高达 90% 的蓖麻油酸酯（12-羟基-十八烷-顺9-烯酸酯）。中链羟基的存在赋予物理和化学功能，使蓖麻油成为一种独特的化学和工业原料。蓖麻油是食品、化妆品和药物制剂中使用的乳化剂的基础。来自氢化蓖麻油的酰基甘油和游离脂肪酸含有 12-羟基硬脂酸酯，这些产品同样可用作乳化剂。12-羟基硬脂酸锂盐用于配制众所周知的润滑剂锂脂，该脂对减少金属间摩擦非常有用。羟基和羧基与金属相互作用，非极性烃主链有助于保留非极性添加剂。类似于蓖麻油酸酯，1 ]。

 

我们之前已经证明了脂肪酶可用于从种子中提取脂肪酶，并使用超临界 CO 2提取和甲醇作为助溶剂在固定化脂肪酶床上同时进行甲基转移 [ 2 ]。此外，通过明智地使用溶剂和脂肪酶，我们已经能够生产高产量的 1,2-二蓖麻油酰基甘油二酯 [ 3 ]。1,2-二蓖麻油酰 DG 在鉴定蓖麻籽中甘油二酯酰基转移酶的活性方面特别有用 [ 4]] 。通过改变甘油上羟基脂肪酸的取代量，除了用作乳化剂和粘度调节剂外，我们相信这些产品在开发具有不同功能特性的聚氨酯和复合材料方面也可能有价值甘油 [ 1 ] 。

 

2。材料和方法

 

2.1. 材料

 

溶剂购自：HPLC 级甲醇、正丁醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、己烷和甲苯，购自 Fisher Scientific（新泽西州费尔劳恩）；来自 FlukaChemie（Buchs，瑞士）的 DIPE；来自 Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）的异辛烷和来自 Acros Organics（Fairlawn, NJ）的乙醇。氯化锂、硝酸镁、氯化钠和无水硫酸钠购自 JT Baker Inc. (Phillipsburg, NJ)。硫酸钾、磷酸钠和磷酸二钠购自 Spectrum Chemical Mfg. Corp. (Gardena, CA)。脂肪酶 R (P. roquefortii, PRL) 是来自 Amano Enzymes Inc.（日本名古屋）的礼物，来自 Rhizomucor miehei 的 Lipozyme RMIM 60 由 Novozymes North America（Franklinton, NC）慷慨提供。

 

THS-甘油不是市售的，而是通过脂肪酶催化的酯化反应制备的。通过混合吸附在硅胶上的 40.8 mg 甘油（1:1，w/w）和 0.2 g 12-羟基硬脂酸 (12-HSA)，FFA 与 GL 的摩尔比为 3:1 来进行反应。反应在 85˚C 下进行，刚好高于 12-HAS 的熔化温度。在此温度下，不需要有机溶剂来溶解底物，这允许使用仅由必要底物组成的反应介质。合成THS-甘油的最佳条件是HS与吸附GL的摩尔比为3:1，脂肪酶RMIM负载量为HS重量的10% (w/w)，所有组分的A w 调整为0.11通过在含有饱和 LiCl [ 5的干燥器中平衡]，反应温度为85℃。在 85˚C 的平衡温度下，通过磁力搅拌器 (150 rpm) 将开口玻璃瓶 (17 mm id × 85 mm L) 中的反应混合物剧烈混合。在不同时间的孵育过程中，从每个烧瓶中取出两个 40 μl 样品，并与 0.4 ml 2-丙醇混合，并储存在 20˚C 的冰箱中，以供以后进行 HPLC 分析。

 

2.2. 高效液相色谱分析

 

如前所述 [ 3 ]，通过反相 HPLC 监测酯化过程。通过在 C 18上注入 50μL 样品来分析脂肪酶反应的预期产物，即 HS、MHS-甘油、DHS-甘油和 THS-甘油RP-HPLC 柱，使用甲醇 (A) 和甲醇: 水 (90:10) (B) 的流动相。梯度是在 20 分钟内从 100% B 到 100% A，然后保持 12 分钟，在 2 分钟内反向梯度到 100% B，并用 B 平衡 6 分钟。总运行时间为 40 分钟。流速为 1.0 mL/min，检测波长为 205 nm。结果表示为峰面积的百分比。MHS-甘油、HS、DHS-甘油和 THS-甘油的保留时间分别为 4.94 分钟、7.52 分钟、20.46 分钟和 32.34 分钟，每种产品的身份均通过 LC/MS 确认。

 

通过合并来自多个反应的产物并使用 250×15 mm Phenomenex Luna C 18 RP 柱，5 微米粒径，来自 Phenomenex，（ Torrance , CA) 根据 Turner 等人的方法洗脱。[ 3 ]。

 

2.3. 甲醇分解反应

 

使用的一般反应条件是将 100 毫克 THS-甘油（110 微摩尔）溶解在 5 毫升反应介质中，并将 0.625 毫升（1.54 毫摩尔）甲醇与 100 毫克游离酶混合。脂肪酶 PRL、反应介质、甲醇和玻璃器皿在含有饱和 MgNO 3水溶液的干燥器中平衡至少 48 小时，以达到0.53 [ 5 ]的Aw 。反应在 25˚C 和 220 rpm 的转速下在封闭的玻璃管中进行。在预定的时间间隔取出 100 微升的级分，用氮气去除溶剂，将 0.5 mL 的 2-丙醇添加到残留物中，将样品短暂储存在 -20˚C 下并通过 HPLC 进行分析。反应一式两份进行。

 

3。结果与讨论

 

图 1显示了脂肪酶 RMIM 催化的 HS 与甘油的酯化反应结果。所呈现的反应提供了获得良好的 THS-甘油产量所需的条件，并且在确定经过 1 天的孵育后，高达 80% 的产物是 THS 后，并未对其进行密切监测。作为这种脂肪酶催化反应的替代方法，也可以氢化蓖麻油并通过制备型 HPLC 分离 THS-甘油产物，如材料和方法中所述。

 

甲醇分解反应的结果（表 1）表明与溶剂的疏水性没有明显联系。有机溶剂为脂肪酶介导的作用提供了一种非常有用的介质，因为底物和产物都是疏水性的并且可溶于有机溶剂 [ 6 ] [ 7 ]。一般来说，酶反应在有机溶剂中要慢得多 [ 8 ]，尽管这在很大程度上取决于底物 [ 9 ]，水不溶性甘油三酯更容易被脂肪酶的作用裂解。二酰基甘油底物，因此对于生成所需的二酰基甘油作为中间体而不是单酰基甘油或完全氢化非常有用

 

 

 

图 1。在 Aw = 0.11 下通过酶促酯化 12-羟基硬脂酸和甘油生产 triHS-甘油；反应条件如下：40.8mg吸附在硅胶上的GL（甘油与吸附剂的重量比=1:1），0.2g 12-羟基硬脂酸，FFA与甘油的摩尔比为3:1，20mg RMIM (Aw 0.11)，在 150 rpm 和 85˚C 下搅拌。MHS-甘油(♦♦)；HS（▲）；DHS-甘油 (■)；和 THS-甘油 (●)。

 

 

*来自 Sangster [ 6 ]，异辛烷除外，来自 Kumar 和 Gross [ 7 ]。

 

水解。在表 1所示的结果中，我们主要看到二酰基甘油 (DHS) 在有机溶剂中的积累，但两种醇除外。

 

Gagnon 和 Vasudevan [ 10 ] 观察到脂肪酶催化的大豆油甲醇分解与所用溶剂的疏水性增加之间存在良好的相关性。我们的结果不同，但这可能是由于我们使用了不同的脂肪酶、PRL、不同的反应条件和不常见的羟基脂肪酸。在乙醚 DIPE 和两种醇（乙醇和丁醇）中观察到较高水平的甲醇分解。当然，后两种溶剂也可能参与醇解反应，除了酰基甘油外，我们没有尝试量化由醇溶剂形成的脂肪酸酯的水平。观察到类似的结果，还使用固定化 PRL 从三癸酸甘油酯、三月桂酸甘油酯和三棕榈精中生成甘油二酯 [ 9]] 。甲苯中的甲醇分解与两种醇的产率相似，DIPE 被证明是 THS 受控甲醇分解的最佳溶剂，MHS 和 DHS 的产率为 73%，DHS 的产率为 65%。

 

通常，仔细控制的反应需要维持稳定的水活度，因为酶会因水的存在而改变其在有机溶剂中的反应性和稳定性。水会影响酶的结构，水解过程中产生的过多水会由于竞争性水解反应而干扰甲醇分解 [ 11 ]。

 

4。结论

 

我们的结果表明，在 DIPE 中谨慎使用脂肪酶可以提供合适的 DHS 产量，用于化妆品、药品和食品的乳化剂以及润滑剂中的粘度调节剂。甘油主链上两个脂肪酸羟基和可用羟基的存在为使用这些 12-羟基硬脂酰二酰基甘油开发具有新特性的聚氨酯提供了可能性。

 

缩略语

 

HS：12-羟基硬脂酸酯

 

DIPE：二异丙醚

 

MHS-甘油：Mono-(12-hydroxy stearoyl)-glycerol

 

DHS-甘油：二-(12-羟基硬脂酰基)-甘油

 

THS-甘油：三（12-羟基硬脂酰基）-甘油

 

RP：反相

 

 

 

向SCIRP提交或推荐下一篇稿件，我们将为您提供最好的服务：

 

通过电子邮件、Facebook、LinkedIn、Twitter 等接受提交前查询。

 

广泛的期刊选择（包括 9 个学科，200 多种期刊）

 

提供24小时优质服务

 

用户友好的在线提交系统

 

公平快捷的同行评审制度

 

高效的排版和校对程序

 

下载和访问结果显示，以及被引文章数

 

最大限度地传播您的研究工作

 

将您的手稿提交至：http://papersubmission.scirp.org/

 

或联系aer@scirp.org

 

利益冲突

 

作者宣称没有利益冲突。

 

参考

 

[ 1 ] McKeon, TA (2016) Castor (Ricinuscommunis L.) In: McKeon, TA, Hayes, DG, Hildebrand, DF 和 Weselake, RJ, Eds., Industrial Oil Crops, Academic Press, Amsterdam 和 AOCS Press, Champaign-Urbana, 75 -112。

[ 2 ] Turner, C.、Whitehand, LC、Nguyen, T. 和 McKeon, T. (2004) 使用实验设计优化用于分析蓖麻油的超临界流体萃取/反应方法。农业和食品化学杂志，52, 26-32。

[ 3 ] Turner, C., He, X., Nguyen, T., Lin, JT, Wong, RY, Lundin, RE, Harden, L. 和 McKeon, T. (2003) 在有机溶剂中脂肪酶催化三蓖麻油酸甲醇分解生产 1 ,2(2,3)-diricinolein。脂质，38, 1197-1206。

[ 4 ] 他，X.，特纳，C.，陈，G.，林，J.-T。和 McKeon, TA (2004) 编码来自蓖麻子的二酰基甘油酰基转移酶的 cDNA 的克隆和表征。脂质，39, 311-318。

[ 5 ] Halling, PJ (1992) Salt Hydrates for water activity control with biocatalysis in Organic Media。生物技术，6， 271-276。

[ 6 ] Sangster, J. (1989) 简单有机化合物的辛醇-水分配系数。物理化学杂志参考数据，18，1111-1228。

[ 7 ] Kumar, A. 和 Gross, RA (2000) 南极假丝酵母脂肪酶 B 催化的聚己内酯合成：有机介质和温度的影响。生物大分子，1， 133-138。

[ 8 ] Klibanov, AM (2001) 通过在有机溶剂中使用酶来改进酶。自然，409, 241-246。

请关注我们的公众号：