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组织培养技术广泛用于许多物种的大规模繁殖。在腰果体外繁殖中，为此需要建立一些协议。本工作旨在评估贝宁基因型器官发生微繁殖腰果幼苗的体外再生条件。温室中一个月大的腰果幼苗的节外植体和体外的子叶节发芽用于此目的。BAP 和激动素单独评估为 2.2 mg/L，然后还评估了 2.2 mg/L BAP + 0.2 mg/L IBA 的组合。来自不同生长调节剂组合的子叶节和腋芽均获得了腋芽增殖对外植体的反应。然而，最好的反应是用子叶节记录的。当使用 2.2 mg/L BAP 时，80% 的外植体在含有 150 mL 椰子水的 MS 培养基上产生大量增殖（5 到 8 个）芽 (5.75 ± 0.12)，芽长良好 (6.73 ± 0.3 cm)。NAA (2.5 mg/l) + IBA (2.5 mg/l) 在含有 40 g/l 蔗糖的 1/2 MS 上观察到生根。

 

关键词

 

.微繁,腰果 精英 基因型,芽,体外再生,器官 发生 

 

一、简介

 

Anacardium occidentale是面向全世界的战略产品。腰果是一种出口产品，在国际市场上的需求量越来越大。腰果在整个价值链中提供经济机会。通过当地加工，它为生产国的工业发展提供了巨大的潜力。在全球范围内，腰果贸易额超过 20 亿美元，需求正在增加。在世界总供应量中，110,000 吨在国际市场上交易：印度（60%）和巴西（31%）是主要出口国 [ 1 ]。在降雨量极少的地区，嫩叶可食用。这种木材很受重视 [ 2 ]，因为它非常坚硬，密度约为 500 kg/m 3 [ 3]，并用作木材、木柴和木炭生产 [ 4 ]。树皮和叶子用于民间医学[ 5 ]。腰果叶和树皮具有杀菌和杀菌特性。其他作者表明，香脂（贝壳产品）对某些害虫具有有趣的生物学特性 [ 6 ] [ 7 ]。它正在成为一个汇集所有能量的部门。但是作为一个商品链，如果非洲只扮演生产原材料的角色，它是不会发展起来的。最近，马萨维 [ 8] 在坦桑尼亚建立了第一个多克隆领域，在莫桑比克建立了第二个，在贝宁建立了第三个。多克隆种子的开发是一项资产。然而，这项技术也需要现代植物生物技术技术。微繁殖可用于生产克隆砧木和更快地繁殖育种者的砧木。几项研究表明，由于微嫁接枝条在单个嫁接周期后难以完全恢复其根际发生能力，因此腰果嫁接中的根起始非常低。以前的结果一再表明，恢复可能需要时间，成功的年轻化可能需要 4 - 6 次连续移植，然后才能检测到年轻的迹象 [ 9]。因此，第二种植物生物技术：器官发生的微繁殖被用于种子繁殖。这增加了嫁接的供应（嫁接植物作为快速克隆微繁殖的“重生”芽材料的潜在用途）并绕过了嫁接生根的困难。通过体外培养的生物技术将允许各种优良基因型的大量无性生产，以使每种基因型具有大量拷贝，从而构成高产果园。此外，贝宁坚果的仁产量（KOR 值）在 47 至 49 磅 (lbs) 之间，因其卓越的品质和口味而享誉全球 [ 10 ]。然而，腰果与其他漆树科植物一样，存在许多微繁殖限制。的主要制约因素之一腰果的体外培养是由于器官摘取损伤导致的次级代谢产物的高产量 [ 11 ]。事实上，这些化合物的氧化会导致培养基中器官的褐变和坏死。同样，去污所需的高水平消毒使现场采集的外植体难以存活 [ 12 ] [ 13 ]。这些作者记录了栽培植物的茎尖和节外植体的成活率分别为 3% 和 25%。大多数消毒后存活的外植体在培养 20 天后变成棕色或坏死 [ 14 ] [ 15]。通常，来自成熟树外植体的微繁殖受到过度污染的影响。在许多情况下，成熟树外植体的微繁殖受到过度污染、酚类渗出、生长缓慢、微豆荚伸长和生根困难的影响[ 8 ]。几位作者 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] 报告说，从体外发芽的幼苗中切下的外植体最适合优良腰果树的微繁。尽管存在腰果体外再生方案，但在贝宁没有关于体外再生的研究当地腰果品种的栽培已经开始。这项工作的目的是评估芽反应性和有利于在贝宁生产的腰果幼苗的体外繁殖和生根的因素，以产生恢复活力的优良芽。

 

2。材料和方法

 

2.1。材料

 

植物材料包括来自微嫁接的芽和来自成功腰果树的发芽坚果的幼苗。

 

2.2. 方法

 

2.2.1。腰果芽启动

 

· 外植体的制备、消毒和培养

 

为了从 4 周大的体外植物制备外植体，在层流罩下，将体外植物小心地从罐子中取出并放入一个大的无菌培养皿（直径 14.5 厘米）中。使用镊子和带有无菌刀片的手术刀，移除顶端和子叶节点（2.5 - 3.0 cm 长）。通过丢弃根部并在子叶节连接处的每一侧保留约0.5-1.0cm的下胚轴和上胚轴部分，获得具有和不具有宽子叶的子叶节外植体。通过在落叶后分割末端枝条制备单节或双节扦插（长 1 厘米）。如此制备的外植体在芽起始培养基上生长。另一方面，在温室中采集的外植体（插条和顶端 1.0 到 1. 5 cm 长）灭菌后在试管（25 × 250 mm）中生长 4 周。进行了几次亚培养。首先，每隔一周进行一次次培养，直到第三周，然后每隔三周进行一次。如果不经常培养，顶端会变黑并坏死。

 

· 培养基的制备

 

萌芽培养基由改良培养基（四分之三的常量元素、完全微量元素、维生素）组成，添加 3% 蔗糖、0.2% 活性炭 (AC) 和 2.25 g/L 植胶 (Sigma )）。将培养基的 pH 值调节至 5.8，然后在 1 bar 的压力下在 121˚C 高压灭菌 20 分钟。将高压灭菌的培养基分配到 100 mL 试管中，每管 15 mL 培养基。

 

· 生长条件

 

培养物在 25°C ± 2°C 的培养室中培养，光照时间为 16 小时。最初，提供了 3 周的低光强度 (16 μmol∙m -2 ∙s -1 )。随后，光强度增加（45 - 55 μmol∙m -2 ∙s -1）并由荧光灯（飞利浦，40 W）提供。

 

2.2.2。腋芽增殖

 

腋芽增殖是在由改良的 MS (3/4) 和 3% 蔗糖和 25 mg/L 半胱氨酸组成的增殖培养基上进行的。BAP 和激动素单独评估为 2.2 mg/L，或在存在 0.2 mg/L AIB 的情况下联合评估。培养基用 8 g/L 琼脂固化。4 周后，将培养物转移到不含生长调节剂的 MS/2 培养基中。

 

通过计数在第 4 周和第 10 周评估形成的腋芽和芽的数量。

 

2.2.3。芽伸长率

 

在繁殖培养基上诱导的腋芽在没有生长调节剂的 MS/2 培养基上生长，添加 0.2% 活性炭和 400 mg/L 谷氨酰胺，用于叶芽伸长。接种的培养物在白色荧光管灯下保持在 25°C ± 2°C 的孵育温度下 16 小时。测试了椰子水 (150 mL) 的效果。具有增殖芽的多个枝条被分成两个单独的簇并以三周的间隔生长。在每次移栽时，收获长芽并将剩余的芽放回相同的培养基上进行伸长。十周后，通过用方格纸测量来评估枝条的长度。

 

2.2.4。根感应

 

将得到的长 (>2 cm) 微生长物植根于含有 25 mg/L 半胱氨酸和 4% 蔗糖的 MS/2 培养基上。NAA 和 IBA 组合使用（各 2.5 mg/L）。培养物在光照下孵育。根首字母一出现，就将它们转移到没有生长调节剂的液体 MS/2 培养基中，滤纸上含有 1 g/L 活性炭。高压灭菌前将培养基的 pH 值调节至 5.8 ± 0.1。

 

2.2.5。评估的参数

 

对于腋芽增殖，在第 4 周和第 10 周评估形成的腋芽和芽的数量。对于伸长率，十周后通过用方格纸测量来评估枝条长度。在开始后 15 周评估形成的根数。

 

2.2.6。统计分析

 

对芽数、芽数和根数进行三因素方差分析（培养基、外植体类型、时间）。为了获得正态分布（ANOVA 假设），将计数数据（芽数、芽数、根数）转换为 log10 (n) [ 20 ]，其中 n 是实际值。枝条伸长也经过三因素方差分析（培养基、外植体类型、时间）。这些分析是使用 SAS 软件（统计分析系统版本 9.2）的 PROC GLM 程序进行的。考虑到 5% [ 21 ]的概率水平，Student Newman-Keuls 检验用于分离均值。

 

3. 结果

 

3.1。增殖过程中外植体存活率的评估

 

存活率因外植体类型和培养基而异。高存活率 (90%) 由在含有测试的两种细胞分裂素 (2.2 mg/L BAP + 0.2 mg/L IBA) 的培养基 M3 上培养的体外萌发的子叶节记录 (表 1 )。

 

在没有生长调节剂的培养基上的芽在三周内开始生长，腋芽肿胀和变绿（图1（A）-（D））。

 

 

3.2. 评估培养基、外植体类型和时间对增殖的影响

 

芽、芽和根数随生长介质、外植体类型和时间变化的方差分析结果见表 2。培养基、外植体类型和时间对芽数、芽数和根数的影响（平均值±标准误差）见表 3。形成的芽数受培养基、外植体类型和时间的影响非常显着（p < 0.001）。芽数不显着（p > 0.05）

 

 

 

图 1。腰果树的微繁殖。(A) 切割顶点；(B)-(D)：腋芽增殖；(E)、(F)：芽的增殖；(G)、(H)：枝条伸长率。

 

 

ns : p > 0.05; *：p < 0.05；**：p < 0.01；***：p < 0.001。

 

受外植体类型的影响，但受培养基和时间的影响显着（p < 0.05 和 p < 0.001）。关于根数，没有一个因素对根形成有显着影响。

 

没有一种相互作用对芽、芽或根的数量有显着影响（p > 0.05）。从表 3可以看出，几个腋芽开始出现并在节点的轴周围增殖。从第一批作物中观察到腋芽的出现。形成的腋芽数量从 1 到 12 不等，平均 4-5 芽/作物。M1 培养基，其中 BAP 以 2.2 mg/l 存在，具有来自体外的子叶节发芽的幼苗产生更多的腋芽 (4.56 ± 0.09)、芽 (4.19 ± 0.06)、

 

媒体	外植体类型	期间（启动后一周）	芽数	拍摄次数	根数
M0（控制）	来自温室的节点	4	0.15±0.07a	0.00±0.00a	0.00±0.00a
			(1.57)	(0)	(0)
		10	0.00±0.00a	0.00±0.00a	0.00±0.00a
			(1)	(0)	(0)
		意思是	0.09±0.05A	0.00 ± 0.00A	0.00 ± 0.00A
			(1.33)	(0)	(0)
	来自体外萌发的子叶节	4	0.2±0.07a	0.00±0.00a	0.00±0.00a
			(1.86)	(0)	(0)
		10	0.12±0.07a	0.00±0.00a	0.00±0.00a
			(1.4)	(0.2)	(0)
		意思是	0.17±0.05A	0.00 ± 0.00A	0.00 ± 0.00A
			(1.66)	(0.08)	(0)
	一般平均值		0.13±0.04Y	0.00 ± 0.00Z	0.00 ± 0.00X
			(1.5)	(0.04)	(0)
M1 (2.2 毫克/升 BAP)	来自温室的节点	4	0.27±0.06a	0.31±0.13a	0.00±0.00a
			(2)	(2.37)	(0)
		10	0.22±0.09a	0.42±0.1a	0.00±0.00a
			(1.7)	(3.3)	(0)
		意思是	0.24±0.06B	0.37±0.08A	0.00 ± 0.00A
			(1.83)	(2.89)	(0)
	来自体外萌发的子叶节	4	0.67±0.12a	0.46±0.12a	0.00±0.00a
			(5.75)	(3.75)	(0.25)
		10	0.4±0.14a	0.6±0.1a	0.08±0.05a
			(3.38)	(4.62)	(0.63)
		意思是	0.54±0.09A	0.53±0.08A	0.03±0.02A
			(4.56)	(4.19)	(0.44)
	一般平均值		0.38 ± 0.06X	0.45 ± 0.06X	0.02 ± 0.01X
			(3.12)	(3.5)	(0.21)
M2 (2.2 毫克/升 Kin)	来自温室的节点	4	0.03±0.03a	0.00±0.00a	0.00±0.00a
			(0.77)	(0.13)	(0)
		10	0.03±0.03a	0.1±0.07a	0.00±0.00a
			(0.78)	(1.11)	(0)
		意思是	0.04±0.02B	0.05±0.03A	0.00 ± 0.00A
			(0.94)	(0.65)	(0)
	来自体外萌发的子叶节	4	0.3±0.1a	0.00±0.00a	0.00±0.00a
			(2.38)	(0.5)	(0)
		10	0.11±0.08a	0.11±0.08a	0.00±0.00a
			(1.38)	(1.38)	(0)
		意思是	0.2±0.06A	0.06±0.04A	0.00 ± 0.00A
			(1.87)	(0.94)	(0)
	一般平均值		0.12±0.04Y	0.05±0.03Z	0.00 ± 0.00X
			(1.4)	(0.79)	(0)
M3 （2.2 毫克/升 BAP + 0.2 毫克/升 IBA）	来自温室的节点	4	0.21±0.07a	0.08±0.08a	0.00±0.00a
			(1.78)	(0.67)	(0)
		10	0.04±0.04a	0.28±0.12a	0.00±0.00a
			(1)	(2.29)	(0)
		意思是	0.14±0.05A	0.16±0.07A	0.00 ± 0.00A
			(1.44)	(1.37)	(0)
	来自体外萌发的子叶节	4	0.33±0.08a	0.08±0.08a	0.00±0.00a
			(2.44)	(0.78)	(0)
		10	0.08±0.05b	0.34±0.09a	0.00±0.00a
			(1.13)	(2.5)	(0)
		意思是	0.21±0.06A	0.2±0.07A	0.00 ± 0.00A
			(1.82)	(1.59)	(0)
	一般平均值		0.17±0.04Y	0.18±0.05Y	0.00 ± 0.00X
			(1.64)	(1.48)	(0)

表 3。生长介质、外植体类型和周期对芽、芽和根数的影响（平均值±标准误差）。

变异来源	自由度	F 值 芽长（厘米）
媒体	1	15.38***
外植体类型	1	198.02***
时期	1	217.98***
重复	14	0.94ns
媒体 * 外植体类型	1	00ns
媒体 * 期间	1	15.38***
外植体类型 * 期间	1	0.05ns
培养基* 外植体类型 * 时期	1	00ns

表 4。三因素方差分析（培养基、外植体类型、周期）对枝条伸长率的 Fischer 值和显着性水平。

 

ns：p>0.05；***：p < 0.001。

 

和根 (0.44 ± 0.02) 已经从四个星期开始。

 

3.3. 评价环境、外植体类型和时间对枝条伸长率的影响

 

10 周后，以 70% - 80% 的频率观察到枝条伸长。对作为培养基、外植体类型和周期的函数的枝条长度进行的方差分析 (ANOVA)（表 4）显示，后者（培养基、外植体类型、周期）以及介质*周期相互作用影响枝条伸长率非常显着（p < 0.001）。

 

对表 5的分析表明，含有 150 mL 椰子水的 E2 培养基是最佳培养基，平均为 4.35 ± 0.24 cm。此外，发现体外萌发的子叶节是微繁殖的最佳外植体（p < 0.05），平均长度为 5.37 ± 0.29 cm。

 

尽管形成的根数各不相同（1 - 4 个/作物）（图 2），但大多数都有一到两个突出的根，平均长度为四 (4) 厘米。生根的百分比从 20% 到 30% 不等。盐浓度的降低和蔗糖浓度的增加有利于生根。从子叶节收获的嫩枝显示出较高的生根百分比。

 

4。讨论

 

目前的工作使用温室中一个月大的腰果植物的节外植体和体外萌发的子叶节。来自不同生长调节剂组合的子叶节和腋芽均获得了外植体上腋芽增殖的反应。然而，最好的反应是用子叶节记录的。结果还表明，在含有 150 mL 椰子水和 2.2 mg/L BAP 的 MS 培养基上，80% 的外植体对大量增殖 (5.75 ± 0.12) 芽 (5.75 ± 0.12) 有良好的芽长 (6.73 ± 0.3 cm) 作出反应. 疗效

 

 

根据 Student Newman-Keuls 检验，后跟相同字母和相同因子的平均值没有显着差异 (p > 0.05)。

 

 

 

图 2。新形成的枝条伸长。

 

据报道，BAP 在刺激素上用于海巴戟的枝条增殖 [ 22 ]。子叶节获得的芽数量较多可能是由于子叶节处的分生组织面积较大，而节外植体的分生组织面积较小。与 MS 培养基上的其他外植体相比，子叶节的芽诱导（12 个芽）的潜力更高，据报道 [ 12 ] 在腰果组织培养和Dacryodes edulis的再生方面 [ 23 ]。同样，在 1995 年，[ 14 ] 从Anacardium occidentale的子叶节每个外植体获得了 9 个芽。从子叶节诱导出大芽，可能是由于营养储备的存在，因为子叶是幼苗后续生长的营养储备结构，而根部允许外植体从环境中吸收营养，为幼苗提供能量。生长的幼苗。

 

此外，为了优化生根反应，NAA (2.5 mg/l) + IBA (2.5 mg/l) 的组合用于含有 40 g/l 蔗糖的 1/2 MS。将 MS 培养基的矿物元素浓度减半并增加蔗糖浓度对于腰果根际发生至关重要。实际上，培养基中矿物质浓度的降低导致该培养基的营养资源减少。另一方面，蔗糖参与生长平衡和有丝分裂的定位 [ 24]。事实上，这些作者指出，高浓度的蔗糖，建立高渗透压，可以减少水和养分从基部到地上部分的运输。因此，MS 培养基中矿物质元素的减少，加上生长培养基中糖含量的增加，从而导致叶器官营养物质的减少，将导致矿物质胁迫。为了应对这种压力状态，叶芽会长出根。作者 [ 25 ] [ 26 ] 还报道了通过降低培养基中的养分浓度来诱导根系。

 

5. 结论

 

嫁接植物作为快速克隆微繁殖的“再生”芽材料来源的潜在用途是一个优势。存在 2.2 mg/L BAP 的子叶节点导致更好的增殖率。此外，椰子水（150 毫升）促进枝条伸长。降低盐浓度、增加蔗糖浓度和使用液体培养基可诱导最佳生根率。

 

利益冲突

 

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

 

参考

 

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