摘要：
从瘤胃微生物宏基因组中分离得到一个957 bp的阿魏酸酯酶（FAE-C6）基因，亚克隆到pET32b载体中，并在大肠杆菌中表达。以活性形式纯化的酶由319个氨基酸残基组成，基于SDS-PAGE的分子量为43.7。同源模型表明，FAE 包含由 Ser 154-Asp 263 His 295 和经典的 Gly-X-Ser 154 -X-Gly 亲核基序组成的催化三联体，这在酯酶中很常见。FAE-C6 使用玉米纤维作为底物进行表征。研究了其与糖苷水解酶 (C、X、A) 单独和各种组合的联合作用，重点是在对 FA 和糖释放的影响。酶混合物中含有内切木聚糖酶的糖苷水解酶对增加 FA 产量有显着影响。对于糖的释放，FAE 适度提高了所有水解酶组合的产量，内切木聚糖酶不是酶制剂中的关键因素。
关键字
阿魏酸酯酶,阿魏酸酯酶,阿魏酸,宏基因组学, 玉米纤维
一、简介
玉米纤维 (CF) 是玉米粒中籽粒的果皮或壳中的粗纤维和胚乳中的细纤维的混合物。主要成分为半纤维素（50%）、纤维素（20%）、淀粉（11%～23%）、蛋白质（15%）、木质素（15%）和灰分，以及2%～3%的油脂[ 1 ] . CF 的结构复杂性是由于大的半纤维素部分，由杂木聚糖组成，在其天然状态下，具有 70% 的β -(1,4)-木吡喃糖 (Xyl p ) 主链携带阿拉伯呋喃糖、乙酰基、葡萄糖醛酸侧基和含有半乳糖、木糖和阿拉伯糖的寡糖链 [ 2 ] [ 3]. 阿拉伯呋喃糖基侧单元通常与可形成交联的阿魏酸部分发生酯连接。2017年[ 4 ]湿磨玉米6.7×10 5吨，年产玉米纤维约6.4×10 4吨。来自湿磨工艺的玉米纤维几乎完全不溶且非常顽固，有 50% 的起始材料在预处理、酶水解和发酵（用于玉米乙醇生产）后仍然存在。最近的研究表明，抗性复合木聚糖低聚物（保持未降解）含有阿魏酸、二阿魏酸酯、乙酸、半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸基团 [ 5 ]。一个共同的结构特征代表α -L-吡喃半乳糖基-(1,2)- β的侧链-D-吡喃木糖基-(1,2)-5- O-反式-阿魏酰基-L-阿拉伯呋喃糖基连接到β -1,4 连接的木糖基残基的O -3 位置[ 6 ] [ 7 ]。CF 的顽固性可归因于木聚糖结构的侧单元和/或主链的阿魏酰化。
已知多种细菌和真菌会产生阿魏酰酯酶（FAE，EC 3.1.1.73），该酶催化阿魏酰-阿拉伯糖 (Araf-FA) 酯键的裂解，将阿魏酸连接到木聚糖主链的阿拉伯呋喃糖侧基。有人提出，FAE 等酶可用于提高纤维素酶和半纤维素酶在生物质转化中的水解效率，因此不需要那么苛刻的预处理条件 [ 8 ] [ 9 ]]. 宏基因组的直接克隆为新基因发现和生物催化剂开发提供了对不可培养微生物群落序列空间的高效探索。大多数关于阿魏酸酯酶的酶学研究都集中在从底物水解 FA 的反应上。在先前的研究中，组合酶法已被应用于阿魏酰寡糖文库的生产和筛选 [ 10 ]。本文的目的是报告纤维素分解酶和木聚糖分解酶单独或组合与 FAE 协同作用对 CF 水解的影响，重点是糖释放。
2. 实验性
阿魏酸酯酶的克隆
宏基因组 DNA 从牛瘤胃的微生物群落中分离出来，并用于构建λ ZAP 文库。FAE 酶活性的文库筛选确定了 FAE-C6 基因。将其亚克隆到 pET 载体中，转化到 BL21 中，然后使用先前报道的程序 [ 11 ] [ 12 ] 将蛋白质纯化至同质性。
生物信息学
使用 Vector NTI (Informax, Bethesda, MD, USA) 和 Geneious (Biomatters Ltd., Auckland, New Zealand) 进行序列分析。基因序列已提交至GenBank，登录号为：MK607950。
电泳
使用 50 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) 缓冲溶液在 Bis-Tris NuPAGE 梯度凝胶 (4% - 12%) 上以恒定 100 V 运行纯化的酶 2 小时。显影的凝胶用 SimplyBlue Safe 染色剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）染色。通过图像分析软件（Alpha Inotech，AlphaImager，San Jose，CA，USA）分析蛋白质和标记条带。对于 pI 测定，酶蛋白在电聚焦凝胶（pH 3 至 10，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）上运行。Serva IEF 标记 3 - 10 混合（Biophoretics, Reno, NV, USA, Heidelberg, Germany）用作标准。
酶活性测量
典型的酶反应混合物在 1 ml 体积的 50 mM K 2 HPO 4 pH 7.0 缓冲液中含有 100 mg CF 和各种纳摩尔浓度的 FAE-C6，并在 40˚C 摇床浴中孵育 2 小时。对于所有反应，将 CF 研磨 3 × 10 s（Micro-Mill，Technilab Instruments，Vineland，NJ，USA），用水清洗 4 次，并在 50˚C 下烘干。活性表示为通过高效液相色谱分析测量的每小时从 100 mg 底物释放的 μg FA。HPLC 系统（Gilson 307 HPLC，Middleton，WI，USA）由配备 Brownlee 分析型 C18 柱（260×4.5 mm）的 Gilson 307 泵组成，使用水/甲酸/乙腈（7/1/ 2 v/v) 在环境温度下流速为 0.2 mL/min。在 315 nm 处检测到阿魏酸峰。
酶的 pH 值和温度最适值和稳定性
对于最佳 pH 值，将 100 mg CF 和 0.3 nmole FAE-C6 的反应混合物在 0.5 mL 不同 pH 值的通用缓冲液中在 37˚C 摇床中孵育 2 小时。为了确定 pH 稳定性，将 C6 在 37˚C 的不同 pH 条件下孵育 4 小时，重新配制至 pH 6.0，并通过添加 CF 底物来确定残留活性。为获得最佳温度，酶反应混合物在 pH 7.0 的 100 mM K 2 HPO 4缓冲液中在 20˚C 至 70˚C 的温度下孵育 2 小时。
玉米纤维的碱解
将 6 mL 1 N NaOH 中的 200 mg CF 样品在 37˚C 摇床浴中孵育 16 小时 [ 13 ]。离心后，回收上清液并用 HCl 调节至 pH ≤ 2。然后用乙酸乙酯 (3 × 3 mL) 萃取阿魏酸产物，在 N 2下干燥，并溶解在 CH 3 OH:H 2 O (1:1 v/v) 中用于 HPLC 分析。
添加辅助酶的活性
向 100 mg CF 中添加 0.5 nmole FAE-C6，辅以内切木聚糖酶（XYN、内切-1,4- β-木聚糖酶、GH11）、α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶 (ABF) 和纤维素酶（CEL，内切-1,4- β -D-葡聚糖酶）均来自黑曲霉（ Megazyme，Bray，爱尔兰），浓度各不相同。这三种酶被单独或以各种组合添加到 C6 反应中。将混合物在 40˚C 摇床中孵育 2 小时。这些酶的最佳 pH 值为 4.5，温度为 40˚C。
3。结果与讨论
FAE 基因的分离、克隆和生物信息学
从宏基因组文库中分离出的基因组插入片段包含一个 957 bp（319 个残基）的酯酶序列域 (FAE-C6)。该基因作为含有硫氧还蛋白 (Trx) 标签、Met 起始密码子和 6xHis 标签的融合蛋白亚克隆到 pET 32b 载体中。BLASTP 搜索揭示了与Prevotella sp.一级结构相关的氨基酸序列。从反刍动物胃肠道微生物组 MBP57-15121 和 MBQ9883982 中分离出的拟杆菌科细菌 α / β 折叠水解酶的同一性百分比分别为 96.6% 和75.8 % （图1 ）。同源模型显示在各种酯酶中常见的α / β水解酶折叠（图 2). FAE-C6 与Bacteroides eggershii双功能蛋白 BeGH43/FAE (PDB 6MLY) [ 14 ]的 C 末端区域密切相关并表现出高度保守性。基于序列和结构比较，FAE-C6 包含由 Ser 154 Asp 263 His 295组成的催化三联体，以及酯酶中常见的经典 Gly-X-Ser 154 X-Gly 亲核基序 [ 15 ] [ 16 ]。
FAE-C6 对玉米纤维的活性
使用 CF 作为底物对酶 FAE-C6 进行了表征。酶单位定义为每小时反应每100mg底物催化形成1μg阿魏酸产物的酶量。FAE 显示 pH ≥ 7 时的最佳 pH 值和 50˚C 的最佳温度（图 3）。在所述反应条件下（100 mg CF，在 1 mL pH 7.0 缓冲液中，孵育
图 1。FAE-C6 的多序列比对。普氏菌属 从反刍动物胃肠道微生物组 MBP5715121 和 MBQ9883982 中分离的拟杆菌科细菌 α / β 折叠水解酶的同一性百分比分别为 96.6%和75.8 %。Gly-X-Ser 154 -X-Gly 基序序列在残基上方用条纹条突出显示。催化三联体 Ser 154 Asp 263 His 295在残基上方用星号表示。
图 2。FAE-C6的3D模型。基于与Bacteroides eggershii双功能蛋白 Be-GH43/FAE (PDB 6MLY) [的高保守 C 端区域比较的同源性建模[ 14 ] 作为模板。Phyre2 [ 22 ] 生成的所有图像和数据。
图 3。pH 值和温度对 FAE 催化的 CF 释放阿魏酸的影响。反应条件：100 mg CF、1 ml 不同 pH 值的通用缓冲液、1 nmole FAE-C6、不同温度，孵育 2 小时。
在 50˚C 下持续 2 小时），1 纳摩尔 FAE 从 100 mg CF/h 催化释放 7.8 μg FA，相当于反应混合物中使用的 100 mg CF（通过碱水解测定）中总 FA 含量的 1.3% .
糖苷水解酶对 CF 糖释放的影响
以下三种糖苷水解酶在催化 CF 糖释放方面单独或以各种组合进行了测试：内切-1,4- β -D-葡聚糖酶（内切纤维素酶、EC 3.2.1.4、GH12）、内切-1,4- β -木聚糖酶（EC 3.2.1.8，GH11）、α- L-阿拉伯呋喃糖苷酶（EC 3.2.1.55，GH51），图中分别标记为C、X和A。所有酶均来自黑曲霉，最适 pH 值和最适温度分别为 4.0 - 4.5 和 60˚C（来自爱尔兰 Megazyme 的规格）。将酶（每个 2U）单独或组合添加到 pH 5.0 缓冲液中的 100 mg CF 中，在 37˚C 下孵育 2 小时。图 4表明与单一酶相比，酶的组合显着增加了糖产量。与单独使用纤维素酶相比，CXA 的组合使糖产量提高了 93%。同样，与单独使用 X 或 A 相比，XA 的组合分别使产率提高了 167% 和 245%。
添加 FAE 对糖苷水解酶的影响
单独的 FAE 对糖产量几乎没有影响（图 5）。很明显，糖产量主要归因于糖苷水解酶的作用。在 CXA 中加入 FAE-C6，在 pH 5 和 6 下，产率分别提高了 6.5% 和 17.6%。显然，FAE 作用释放的是纤维复合物中的非共价糖分子。在这种情况下释放的糖可能不完全代表水解产物。糖产量随着 pH 值的增加而降低，当反应在 pH 7 而不是 pH 5 下进行时减少 40%（图 5）。该结果表明进一步的证据表明水解酶 (CXA) 在从 CF 底物释放糖方面提供了关键的催化作用。
图 4。纤维素酶、木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶单独（C、X、A）或组合（CX、CA、XA、CXA）对 CF 释放糖（作为木糖等价物）的影响。反应条件：100 mg CF，每种酶 2U，pH 5.0，37˚C 2 小时。
图 5。在各种 pH 条件下向 C+X+A 酶组合添加 FAE 的影响：100 mg CF，0.3 nmole FAE-C6，C+X+A 组合各 2U，pH 5.0、6.0 或 7.0 缓冲液，37˚C， 2 小时。
FAE-C6 对 FA 和糖释放的影响
将 FAE-C6 单独或组合添加到糖苷水解酶（C、X、A）中会影响不同模式的 FA 和糖的释放。FA 的释放在 CXF、XAF 和 CXAF 中得到增强，与单独的 FAE 相比，显示出类似的增加，分别为 6.9%、8.7% 和 8.3%（图 6 (a)）。所有这三种酶混合物都含有内切木聚糖酶。值得注意的是，用 CAF（不含内切木聚糖酶）处理后，FA 产量降低了 21.7%。在我们之前的研究中已经广泛研究了内切木聚糖酶的协同作用。在恒定浓度 (0.5 nmole) 的 FAE 下添加浓度增加的内切木聚糖酶（1.0 nmole 至 20 nmole）导致木聚糖酶浓度每加倍平均增加 1.11 ± 0.14 μg FA [ 10]. 据报道，FAE 在协同增效作用下从 CF 和玉米麸中释放 FA 的范围相似，分别为 1.21 倍和 1.19 倍 [ 17 ]。木聚糖内切酶的增强作用是由于形成了较短链的低聚木糖，与长链底物相比，它们更容易受到影响（FAE 以更快的速度水解）[ 18 ][ 19 ]。此外，已知 FAE 在 FA 的释放中与内切木聚糖酶协同作用，因为短链阿魏酰化木寡糖是更好的底物，具有更高的 Araf-FA 裂解率 [ 17 ]。作用于各种侧链的其他木聚糖分解辅助酶也可以增强木聚糖主链的水解，进而增强阿魏酸键 [ 20] [ 21 ]。然而，我们之前的研究表明，在相似的实验条件下，阿拉伯呋喃糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶对 CF 底物没有显示出协同作用 [ 10 ]。
图 6。将 FAE 添加到糖苷水解酶（CX、CA、XA、CXA）的各种组合中对 (a) FA、(b) 糖作为木糖等价物从 CF 底物释放的影响。反应条件：100 mg CF，0.3 nmole FAE，每种水解酶 2U，pH 5.0，37˚C，2 小时。
将 FAE-C6 添加到糖苷水解酶混合物中的效果显示出不同的糖释放产物模式（图 6 (b)）。在所有情况下（CXF、CAF、XAF、CXAF），糖释放的增加都非常适中，分别显示 CXF 和 CXAF 酶混合物增加了 8.0% 和 11.9%。结果表明，内切木聚糖酶的影响与其他酶没有区别，(2) 添加 FAE 提高了所有酶组合的糖产量，但不是反应中糖释放的关键因素。
4。结论
从瘤胃微生物宏基因组中分离出阿魏酸酯酶 (FAE) 基因，在大肠杆菌中表达，并以活性形式纯化酶蛋白 (fae-C6)。它由具有α / β水解酶折叠的酯酶结构域组成，由催化三联体 Ser 154 Asp 263 His 295组成. FAE-C6 使用玉米纤维作为底物进行表征。研究了它与糖苷水解酶 (C、X、A) 单独和各种组合的联合作用，重点是水解作用对 FA 和糖释放的差异。酶混合物中含有内切木聚糖酶的糖苷水解酶对增加 FA 产量有显着影响。对于糖的释放，FAE 适度提高了所有水解酶的木糖产量，其中 CXAF 增加了 11.9%。内切木聚糖酶不是酶制剂中的关键因素。
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利益冲突
作者声明本文的发表不存在利益冲突。
参考
[ 1 ] Hames, BR (2009) 能源应用的生物质成分分析。载于：Mielenz, JR, Ed., Biofuels, Humana Press, Totowa, 147-167。
[ 2 ] Biely, P.、Vrsanska, M.、Tenkanen, M. 和 Kluepfel, D. (1997) 内切-β-1,4-木聚糖酶家族：催化特性的差异。生物技术杂志，57, 151-166。
[ 3 ] Biely, P.、Singh, S. 和 Puchart, V. (2016) 复杂植物木聚糖结构的酶促分解：最新技术。生物技术进展，34，1260-1274。
[ 4 ] 国家农业统计局 (NASS)（2018 年）谷物压榨和副产品生产（美国农业部 NASS 报告）。NASS，华盛顿特区。
[ 5 ] Appeldoorn, MM, Kabel, MA 和 van Eylen, D. (2010) 玉米纤维低聚木聚糖结构的抗预处理和同时糖化和发酵的表征。农业与食品化学杂志，58，11294-11301。
[ 6 ] Agger, J.、Vikso-Nielsen, A. 和 Meyer, AS (2010) 预处理玉米麸阿拉伯木聚糖的酶促木糖释放：脱乙酰化和脱阿魏酰化对不溶性和可溶性底物组分的不同影响。农业和食品化学杂志，58，6141-6148。
[ 7 ] Appeldoorn, MM, de Waard, P., Kabel, MA, Cruppen, H. 和 Schols, HA (2013) 来自热化学处理的玉米纤维的耐酶阿魏酰化木寡聚物类似物含有大侧链、乙基糖苷和新的乙酰化位点。碳水化合物研究，381，33-42。
[ 8 ] Akin, DE (2007) 草木素纤维素。应用生物化学和生物技术，137，3-15。
[ 9 ] Wong, DWS, Chan, VJ 和 Liao, H. (2021) 宏基因组阿魏酰酯酶对玉米纤维中阿魏酸的水解。生物资源，16, 825-834。
[ 10 ] Wong, DWS, Chan, VJ 和 Liao, H. (2020) 用于生产和筛选阿魏酰寡糖文库的组合酶法。酶研究进展，8, 27-37。