植酸酶是一种水解植酸及其盐类,生成肌醇和磷酸的酶。植酸酶作为一种新型饲料添加剂,在动物营养和环境保护方面具有巨大潜力。微生物植酸酶因其稳定性好、生产规模大、活性高等特点,成为工业应用的热点。在这里,我们报告了一种来自枯草芽孢杆菌的植酸酶的预测结构和酶学特性,该酶被命名为 phyS。可知最适温度为35 ℃,最适pH为8。同时,在pH 8~9范围内酶活保持在90%以上,证明phyS是一种碱性植酸酶。该研究为phyS的广泛应用奠定了基础。
关键字
结构预测,酶 性质,植酸酶
一、简介
饲料工业是我国国民经济十大基础产业之一。饲料酶制剂因其广泛应用于提高动物生产性能和控制粪便污染等领域而受到越来越多的关注[1 ]。植酸酶又称肌醇六磷酸水解酶,是一种能水解酯键的磷酸水解酶。植酸酶具有特殊的空间结构,依次将磷从植酸分子中分离出来,将植酸降解为肌醇和无机磷,并与植酸结合释放出其他营养物质,可用于动物的生长发育[2 ]]. 植酸酶可以提高动物生产性能,降低生产成本,减少环境污染,具有广泛的应用价值。
植酸酶来源广泛。它存在于植物、动物、真菌、酵母和细菌中。由于微生物植酸酶具有作用范围广、稳定性好、易于规模化生产、活性高、生长周期短等特点,成为研究的热点[3 ]。自从第一个植酸酶(来自Aspergillus terreus no. 9a1)被分离纯化后,相继发现了多种产酸酶菌,如枯草芽孢杆菌、假单胞菌、大肠杆菌、乳杆菌、克雷伯菌、黑曲霉、米曲霉、根霉、酵母等 [ 4 ] [ 5]. 根据结构和催化机制,植酸酶可分为组氨酸酸性磷酸酶(HAP)、β-折叠桶状植酸酶(BPP)、半胱氨酸磷酸酶植酸酶(CP)和紫色酸性磷酸酶植酸酶(PAP)[6 ]。BPP分子结构中有一种特殊的折叠桶结构,因而得名。这种植酸酶最早是在芽孢杆菌中发现的[ 7 ],目前发现的大部分BPP仍来自芽孢杆菌[ 8 ][ 9 ][ 10] 。] 是植酸酶中唯一的中性偏碱性植酸酶(pH 6.0 - 8.0)。与HAP相比,BPP具有更高的热稳定性,更容易降解植酸,更适用于中性和碱性环境。一些研究表明,BPP在陆地和水环境中分布最广。因此,BPP具有较大的社会需求和市场推广前景。但由于BPP的比活度低,分离纯化难度大,限制了BPP的产业化。获得更高酶活性的BPP是其商业化生产的当务之急。
本研究成功地研究了枯草芽孢杆菌phyS的生物信息学,构建了结构,定义了催化结构域,研究了酶的性质,为阐明phyS的生物学特性奠定了基础。
二、材料与方法
2.1. 同源序列的搜索和比较
通过BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)的检索工具,发现PDB数据库中有5个序列与phyS具有同源性,相似度不低于95%。值得一提的是,在搜索到的同源序列中,pdbid: 1 POO [ 11 ], pdbid: 1 QLG [ 11 ], pdbid: 3 AMR [ 12] 和1个CVM都是3-植酸酶,因此可以推断phyS是3-植酸酶。同时,选取这四种同源蛋白的晶体结构作为模板Formwork构建。使用多序列比对程序ClustalW对上述序列进行多序列比对,参数选择默认设置。然后,根据DSSP二级结构的预测结果,通过对比对结果进行微调。序列比对的结果图在espript 2.2[ 13 ]的在线服务器上完成。蛋白质结构由绘图软件PyMOL显示[ 14 ]。
2.2. 同源建模和模型评估
phyS的三级结构由SWISS-MODEL构建[ 15 ]。使用modeller的优化程序和打分程序对生成的结构进行优化排序,最终以PDB格式输出前5名的结构模型。为了避免初步打分造成的结果偏差,我们选择PROCHECK[ 16 ]和验证3D[ 17 ]进一步评估生成模型的质量。
2.3. phyS的主要酶特性
植酸酶活性的测定:植酸酶活性的测定方法为硫酸亚铁钼蓝法[ 18]]. 取100 μl phyS溶液,37℃水浴孵育5 min,加入400 μl底物植酸钠溶液,37℃水浴反应15 min。加入 500 μl 终止液终止反应。加入500 μl显色剂,室温静置10 min,使显色充分,37℃,4000 r/min离心10 min,去除肉眼看不见的沉淀杂质,测定溶液在 700 nm 波长下的 OD 值。设置了对照实验。对照组先在500 μl终止液中加入100 μl植酸酶溶液使酶失活,同法进行后续测定。
最佳反应温度的确定:phyS的酶活性是通过phyS蛋白溶液在pH为8.0的缓冲体系中在不同温度(10℃ - 65℃)下的酶促反应来测定的。
最适pH的测定:在最适温度下,将phyS溶液在pH 3.0~9.0的条件下进行酶促反应,测定phyS的酶活。
温度耐受性测量:phyS 在不同温度(20˚C - 65˚C)下孵育不同时间,然后立即在冰中冷却。在最佳反应条件下测定phyS的酶活性
pH 稳定性:phyS 在一系列不同 pH 缓冲液中处理 30 分钟后,在最适温度和 pH 条件下测定 phyS 的酶活性。
米氏常数和最大反应速率(Km值,V max)的测定:配制不同浓度(0.1 mmol/L - 10.0 mmol/L)的底物溶液,在最佳反应条件下测定phyS的酶活性。表观Km和Vmax采用线编织burk双倒数曲线法计算[ 19 ]。
3。结果与讨论
3.1. phyS序列分析
对实验室保存的含有pet-28b-phys的重组质粒进行测序,测得蛋白序列有373个残基。颜色对齐是在 clustalw 服务器上进行的。从比较结果(图1)可以看出,phyS与1PO0、1QLG、3AMR和1CVM的序列同一性在95%左右,非同一性区域主要集中在n端前29个残基。因此,以上述四种蛋白质为模板构建phyS的三级结构是有效且可信的。同时利用swiss-model的在线服务器,预测L71、L80、Y83-L85、R76、V101、E187、D211、L227、I258、D288、T279、D336、H342、Q367-N369、D379站点为Ca 2+的相互作用位点。相互作用显示在图 2 (b)。
图 1。phyS 及其同源结构的序列比对。phyS 的二级结构元素以绿色表示。预测的与 Ca 2+相互作用的位点标记为蓝色星星。序列比对的呈现是使用 ESPript 2.2 的在线服务进行的。
3.2. 同源建模和模型评估
phyS 的三级结构是通过使用同源建模程序 SWISS-MODEL [ 15 ] 构建的。利用SWISS-MODEL的优化程序和打分程序,对生成的结构进行初步优化排序,最终将排名前5的结构模型输出为PDB格式。phyS 的结构属于五叶片β-螺旋桨家族,每个叶片由四个β-链组成(图3)。为了避免初步打分造成的结果偏差,我们选择PROCHECK[ 16 ]和验证3D[ 17 ]进一步评估生成模型的质量。
通过分析Ramachandran图(图4(a))表明,89.9%的模型蛋白残基的Ф和ψ角在最佳区域,9.1%的残基落在其他许可区域,0.6%落在最佳区域几乎没有许可的区域,0.4% 的残留物落在不允许的区域。以上结果表明,模块构造的二面角是非常合理的。同时使用profile_3D(图4(b))不难发现,除了V101,其他残基的得分都大于其他残基,其他所有残基的得分都大于0,99.7%的残基平均3D-1D得分大于0.2,表明侧链环境是可以接受的。
3.3. phyS 的主要酶学特性
3.3.1. phyS 的最佳反应温度
不同温度下phyS测定结果表明(图5(a))酶的最适反应温度为35℃,在10℃~45℃时酶的催化活性保持在30%以上,表明phyS可以在很宽的温度范围内发挥其催化活性。
图 2。三级结构 (a) 和 phyS 与 Ca 2+的相互作用位点(b) 结构以 pymol 的卡通形式显示,相互作用以棒状显示,Ca 2+以绿点显示。
图 3。phyS结构示意图。该结构由 Pymol 生成,并以卡通形式显示。β 链由箭头和螺旋表示为线圈。
图 4。(a) 主链二面角(Ramachandran 图)和 (b) 建模 phyS 的 Verify_3D 图。
3.3.2. phyS 的最适 pH 值
phyS在pH 5~9范围内保持良好的催化活性,随着pH值的升高,酶活性也随之增加,在pH 8.0时达到峰值。此外,随着pH值的升高,酶活性开始下降。最适pH为8.0,表明phyS属于碱性植酸酶。当pH小于4时,酶的催化活性降低到小于
图 5。phyS 的酶学特性。(a) phyS的最佳温度;(b) phyS 的最佳 pH;(c) phyS 的 pH 稳定性;(d) 酶促反应的动力学参数。误差条代表标准偏差。
10%(图5(b)),这个结果表明phyS不适合在强酸环境中工作。
3.3.3. Phyht 的温度稳定性
60℃孵育15分钟后,phyS的酶活下降到15%以下,说明phyS的酶活在60℃以上不能很好的维持。当温度在45℃时,孵育2小时后植酸酶活性仍能保持80%。当温度低于37℃时,植酸酶活性在5小时内几乎没有变化。表明phyS在低温下的稳定性较好。
3.3.4. phyS 的 pH 稳定性
当 phyS 在一系列不同 pH 缓冲液中在 37˚C 下处理 30 分钟,pH 为 6 - 12 时,剩余酶的活性保持在 95% 以上。当pH值低于6时,酶活性迅速下降。当pH值低于4时,几乎没有酶活性(图5(c)),说明该酶的耐碱性好,耐酸性差。
3.3.5. phyS 反应的动力学参数
如图5 (d)所示,在植酸钠为底物的条件下,通过画线计算表观Km和V max分别为1.38 mmol/L和100.06 μmol/(mg∙min)编织伯克双倒数曲线 [ 20 ]。
4。结论
本研究以phyS为研究对象。进行了序列分析和结构预测,并定义了 phyS 的基本酶学特性。通过结构预测了解其主要结构特征,为进一步研究phyS结构和解释功能与结构的关系奠定了基础。研究了酶促性质。阐述了phyS的主要催化性质,为今后的广泛应用提供了理论基础。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
[ 1 ] Mrudula, VU、Jaiswal, AK、Krishna, S. 和 Pandey, A. (2019) 饲料和燃料工业中的耐热植酸酶。生物资源技术,278, 400-407。
[ 2 ] Li, X., Yang, H., Hu, J., Wu, Y., Li, J. 和 Ren, Y. (2010) 植酸酶的多样性和分类。中国微生物学, 37, 738-747.
[ 3 ] Dvorakova, J. (1998) 植酸酶:来源、制备和开发。Folia Microbiologica (Praha), 43, 323-338。
[ 4 ] 刘,N.,等。(2008) 含植酸和植酸酶的日粮对鸡碳水化合物酶和转运蛋白活性和信使核糖核酸表达的影响。动物科学杂志,86, 3432-3439。
[ 5 ] Reddy, NR、Sathe, SK 和 Salunkhe, DK (1982) 豆类和谷物中的植酸。在:Chichester, CO, Mrak, EM 和 Stewart, GF, Eds., Advances in Food Research, Academic Press, Cambridge, 1-92。
[ 6 ] Lim, BL、Yeung, P.、Cheng, C. 和 Hill, JE (2007) 植酸盐矿化细菌的分布和多样性。ISME 期刊,1, 321-330。
[ 7 ] Kerovuo, J.、Lauraeus, M.、Nurminen, P.、Kalkkinen, N. 和 Apajalahti, J. (1998) 枯草芽孢杆菌新型植酸酶的分离、表征、分子基因克隆和测序。应用和环境微生物学,64,2079-2085。