摘要：
辅酶 B 12依赖性谷氨酸变位酶由两个脱辅酶蛋白亚基组成；S 和 E 2，它们在融合或分离的同时与辅酶 B 12组装形成活性全酶 (E 2 S 2 -B 12 )，用于催化 ( S )-谷氨酸和 (2 S , 3 S )-之间的可逆异构化3-methylas - partate。为了通过紫外分光光度法测定谷氨酸变位酶的活性，该反应通常与甲基天冬氨酸酶偶联，甲基天冬氨酸酶使 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸脱氨基形成中康酸 ( λ max= 240 纳米，Ɛ 240 = 3.8 毫米-1 ·厘米-1）。通过该测定法测量不同辅酶 B 12和腺苷肽 B 12作为辅因子的不同辅酶成分 S 和 E的谷氨酸变位酶重组的活性，并用于通过 Michaelis - Menten揭示辅因子的结合特性方法。由于全酶在 2、7 和 14 S: E 中的重组，辅酶 B 12 in 的K m值被确定为；1.12 ± 0.04 μM、0.7 ± 0.05 μM 和 0.52 ± 0.06 μM，分别与腺苷肽 B 12相同; 1.07 ± 0.04 μM 和 0.35 ± 0.05 μM，分别从全酶的 2 和 14 S: E 组合物中获得。奇怪的是，这些动力学分析结果将辅因子对辅酶的亲和力增加与用于从单独的辅酶组分和辅因子重构全酶的组分 S 的量增加相关联。此外，在这些研究中，开发了一种测定谷氨酸变位酶活性的新方法，其中谷氨酸变位酶活性是通过 NADH（λ max = 340 nm，Ɛ 340 = 6.3 mM -1 ·cm -1）的消耗来测量的，由添加 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸和丙酮酸为E 2 S 2 -B 12和两个辅助全酶体系的混合物；5-磷酸吡哆醛依赖性谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶和 N ADH 依赖性 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶e. 在将 ( S )-谷氨酸和丙酮酸添加到全谷氨酸-丙酮酸转氨酶和 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶的混合物中后，谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活性相对完全恢复，该混合物与每种推定的谷氨酸变位酶抑制剂一起孵育。此外，新的测定法用于确定 (2S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸在谷氨酸变位酶的反应中为K m = 7 ± 0.07 mM 和k cat = 0.54 ± 0.6 s -1。Briggs-Haldane 公式的应用允许计算可逆异构化的平衡常数，K eq = [( S )-谷氨酸] × [(2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸] -1 = 16，其中动力学( S )-谷氨酸的常数通过标准的甲基天冬氨酸酶偶联测定法测定。
辅酶 B 12依赖性谷氨酸变位酶由两个脱辅酶蛋白亚基组成；S 和 E 2，它们在融合或分离的同时与辅酶 B 12组装形成活性全酶 (E 2 S 2 -B 12 )，用于催化 ( S )-谷氨酸和 (2 S , 3 S )-之间的可逆异构化3-methylas - partate。为了通过紫外分光光度法测定谷氨酸变位酶的活性，该反应通常与甲基天冬氨酸酶偶联，甲基天冬氨酸酶使 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸脱氨基形成中康酸 ( λ max= 240 纳米，Ɛ 240 = 3.8 毫米-1 ·厘米-1）。通过该测定法测量不同辅酶 B 12和腺苷肽 B 12作为辅因子的不同辅酶成分 S 和 E的谷氨酸变位酶重组的活性，并用于通过 Michaelis - Menten揭示辅因子的结合特性方法。由于全酶在 2、7 和 14 S: E 中的重组，辅酶 B 12 in 的K m值被确定为；1.12 ± 0.04 μM、0.7 ± 0.05 μM 和 0.52 ± 0.06 μM，分别与腺苷肽 B 12相同; 1.07 ± 0.04 μM 和 0.35 ± 0.05 μM，分别从全酶的 2 和 14 S: E 组合物中获得。奇怪的是，这些动力学分析结果将辅因子对辅酶的亲和力增加与用于从单独的辅酶组分和辅因子重构全酶的组分 S 的量增加相关联。此外，在这些研究中，开发了一种测定谷氨酸变位酶活性的新方法，其中谷氨酸变位酶活性是通过 NADH（λ max = 340 nm，Ɛ 340 = 6.3 mM -1 ·cm -1）的消耗来测量的，由添加 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸和丙酮酸为E 2 S 2 -B 12和两个辅助全酶体系的混合物；5-磷酸吡哆醛依赖性谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶和 N ADH 依赖性 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶e. 在将 ( S )-谷氨酸和丙酮酸添加到全谷氨酸-丙酮酸转氨酶和 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶的混合物中后，谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活性相对完全恢复，该混合物与每种推定的谷氨酸变位酶抑制剂一起孵育。此外，新的测定法用于确定 (2S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸在谷氨酸变位酶的反应中为K m = 7 ± 0.07 mM 和k cat = 0.54 ± 0.6 s -1。Briggs-Haldane 公式的应用允许计算可逆异构化的平衡常数，K eq = [( S )-谷氨酸] × [(2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸] -1 = 16，其中动力学( S )-谷氨酸的常数通过标准的甲基天冬氨酸酶偶联测定法测定。
关键词
辅酶 B12 ,腺苷肽 B12 ,谷氨酸变位酶, (S)-谷氨酸, (2S , 3S)-3-Methylaspartate , Methylasparatase
一、简介
谷氨酸变位酶 (EC 5.4.99.1) 是辅酶 B 12 (1) 依赖性酶类中众所周知的成员之一。此类包括酶的变位酶和消除酶亚型，它们使用辅酶 B 12 (1) 作为辅助因子来催化氢原子和碳骨架 [ 1 ] 或吸电子官能团 [ 2 ] [ 3 ]之间的邻位交换。它们的底物分子，其中消除酶实现进一步去除作为水或 NH 3的迁移基团。由于需要辅酶 B 12，Horace Albert Barker 及其同事于 1959年首次描述了谷氨酸变位酶与维生素 B 12 (2)(1) 作为反应中的辅助因子，它催化 [ 4 ]（图 1）。具体而言，谷氨酸变位酶催化 ( S )-谷氨酸 (4) 和 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5)（方案 1）之间的可逆异构化，形成 ( S )- 谷氨酸 (4)的第一个代谢步骤) 发酵为丁酸、乙酸、NH 3、CO 2和 H 2，因此它们在 ( S )-谷氨酸 (4) [ 5 ] [ 6 ]上厌氧生长。
载脂蛋白谷氨酸变位酶由两个蛋白质亚基组成；S，单体（σ，14.8 kDa）和 E 2，同型二聚体（Ɛ 2，2 × 53.5 kDa）。这些蛋白质结构域由结构基因编码，这些结构基因存在于操纵子中，它们被组织在阅读框架原型序列中；glmS / glmL /glmE和mutS / mutL / mutE分别在C. cochlearium和C. tetarnomorphum的基因组中确定。尽管在域 S 和 E 之间不断检测到编码推定伴侣 L 的基因，[ 7 ][ 8 ]] 组分 L 对于酶的功能表达不是必需的。因此，谷氨酸变位酶已通过使用重组成分 S 和 E在体外与辅酶 B 12 (1)组装形成活性异四聚体全酶 (E 2 S 2 -B 12 ) 进行了广泛研究。
各种学习策略，使用不同的技术来理解
图 1。钴胺素的结构；辅酶 B 12（腺苷钴胺素）(1)、维生素 B 12（氰钴胺素）(2) 和腺苷肽 B 12 (3)。
谷氨酸变位酶的催化机制大多产生了趋同的结果。特别令人难以置信的包括通过 EPR 光谱测定中间体 ( S )-谷氨酸 (4) 衍生的 4-谷氨酰自由基 (6)，以及对表观 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 相关 ( 2 S , 3 S )-3-亚甲基天冬氨酸基团 (7) [ 9 ] 以及通过 HPLC [ 10 ] [ 11鉴定的丙烯酸酯 (8)]. 后一种化合物被假设为两者兼而有之；与尚未确定的甘氨酰自由基 (9) 一起形成，作为前任自由基分裂的结果，并允许通过与假定的甘氨酰自由基 (9) 重组形成任何前自由基 [ 10 ]进行可逆异构化。 11 ] [ 12 ]（方案 1）。通过酶蛋白的特定氨基酸残基突变对谷氨酸变位酶机制的研究结果以及伴随的动力学损伤的测定生动地补充了从其他研究中获得的见解，[ 13 ][ 14 ]] 特别是酶晶体结构，它提供了对谷氨酸变位酶机制的实质性理解。从晶体结构中可以看出，辅酶 B 12 (1) 通过“碱基关闭，他开启”与脱辅基酶结合，其中辅助因子的二甲基苄基咪唑 (DMBI) 与钴的配位被来自结构域 S 的 His 16 的咪唑取代，以及结合基材；( S )-谷氨酸 (4) 和 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 通过底物分子的羧酸盐与来自结构域 E 的 Arg 66、Arg 100 和 Arg 149 的胍碱基的氢键相互作用 [ 12 ] [ 15 ] [ 16 ]。而辅酶 B 12的结合(1) 至 S，因此 ( S )-谷氨酸 (4) 至 E 已通过晶体结构中揭示的突变研究得到证明，[ 14 ] [ 17 ] 被取代的低位配体磷酸-α- D的推测作用-ribofura-nosyl-5, 6-二甲基苄基咪唑在增强 Co(III)-C σ键均裂裂解方面的作用也已通过几种方法进行了研究，这些方法最终得出了一致的结果 [ 18 ] [ 19 ]。最近报道的k cat以及 k猫猫_ _⋅钾− 1米由于全谷氨酸变位酶与腺苷肽 B 12 (3) 相对于辅酶 B 12 (1) 的重构增加了 10 倍，这也暗示了磷酸-α-D-呋喃核糖基-5, 6-二甲基-苄基酰亚胺-唑的构象变化，而埋在蛋白质疏水口袋中可增强 Co(III)-C σ键的裂解 [ 20 ]。酶晶体结构还揭示了辅助因子上配体的核糖部分通过假旋转重新定向的机制，这有助于 Co(III) -C σ键的均裂裂解并引导主要有机自由基，即5'-脱氧腺苷自由基催化过程中底物的活化 [ 12 ] [ 15]. 通过密度泛函理论 (DFT) 计算 [ 21 ] 和各种实验方法 [ 22 ] 进一步研究了这种现象。然而，前者的结果暗示通过辅因子上配体核糖的 3'OH (O3RL) 和 corrin 的 C 19 -H之间的氢键相互作用对底物活化步骤的临界稳定受到后者的挑战，后者表明弱氢键相互作用基于对用作辅酶 B 12 (1) 模态的非对映异构体 ( R ) 和 ( S )-2, 3-二羟丙基钴胺素的 X 射线晶体结构和 NMR 光谱的分析，相同的原子12 (1) [ 22]. 通过证明在所有 pH 条件下全酶与 D 2 O 孵育时 C 19 -H 无法与氘交换以及钴氧化态和酶减少 15 倍 k猫猫_ _⋅钾− 1米由于在没有 O3RL 的情况下重建全谷氨酸变位酶 [ 22 ] [ 23 ]。这种酶的减少 k猫猫_ _⋅钾− 1米转化为 7 kJ∙mol -1 ，这是由 O3RL 相互作用通过与 C 19 -H的氢键形成的底物活化步骤的稳定程度。尽管如此，DFT 和实验研究都得出结论，辅助因子上配体核糖的 2'OH (O2RL) 和 O3RL 与 E330 活性位点残基和 corrin 的 C 19 -H 通过氢键相互作用，促进 Co(III)- 的均裂裂解。 Cσ _将 5'-脱氧腺苷自由基键合并引导至距钴 6 ˚A 的底物。这些结σ键 [ 12 ] [ 15 ] [ 22 ] [ 23 ]。5'-脱氧腺苷自由基被氢键相互作用紧密引导到( S的 C 4上的pro S H si的立体特异性抽象 )-谷氨酸 (4) 或 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5)甲基上的任何氢原子，从而切换到实现异构化的自由基机制 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]（方案1）。氢原子向底物上乙烯基碳原子的迁移通过 5'-脱氧腺苷发生在分子间，沿着丙烯酸酯 (8) 的分子内迁移产生异构体产物，而钴 (II) 胺在机械上与稳定性有关在辅因子 [ 24 ]再生之前，包括初级有机自由基在内的中间自由基的合成。已鉴定的 4-谷氨酰 (6) 和表观
方案一。谷氨酸变位酶催化 ( S )-谷氨酸 (4) 和 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5)之间的可逆异构化的拟议断裂重组机制辅因子的 Co(III)-C σ键均裂裂解为钴胺素 (II) 胺和初级有机基团；5'-脱氧腺苷自由基。根据反应方向，5'-脱氧腺苷自由基立体特异性地提取( S )-谷氨酸 (4)的 C4 上的H si或 (2 S , 3 S )-3-的甲基上的任何氢原子天冬氨酸甲酯 (5) 形成相应的中间体 4-谷氨酰胺 (6) 和 (2S , 3 S )-3-亚甲基天冬氨酸 (7) 基团。这些自由基可逆地异构化；显然是通过甘氨酰基 (9) 和丙烯酸酯 (8)，然后从 5'-脱氧腺苷的甲基上夺去氢原子，与辅酶 B 12 (1) 的再生形成异构体产物。
(2 S , 3 S )-3-亚甲基天冬氨酸 (7) 自由基定义了所有辅酶 B 12 (1) 依赖性反应共有的最小机制方案，但由 II 类核糖核苷酸还原酶 (RNRs-II) 家族催化的反应除外辅酶 B 12 (1) 依赖酶 [ 25 ] [ 26 ]。
与任何其他酶一样，研究谷氨酸变位酶催化机制所必需的是测定其酶活性。目前的谷氨酸变位酶活性测定方法是在20世纪60年代初开发的，以甲基天冬氨酸酶为辅助酶，将谷氨酸变位酶产生的( 2S，3S )-3-甲基天冬氨酸(5)转化为中康酸。后一种化合物具有紫外线活性，λ max = 240 nm，Ɛ 240 = 3.8 mM −1 ∙cm −1，因此可以通过紫外线分光光度法测定谷氨酸变位酶活性 [ 27]. 这种标准的甲基天冬氨酸酶偶联测定对谷氨酸变位酶的大多数机理研究至关重要，从鉴定谷氨酸变位酶蛋白纯化过程中含有酶蛋白的级分到动力学测量，包括突变 [ 17 ] [ 14 ] 和结构活动关系中受损的动力学（ SAR) 谷氨酸变位酶研究 [ 20 ] [ 22]. 然而，标准的甲基天冬氨酸酶偶联测定仅限于在存在任何竞争性抑制谷氨酸变位酶的化合物的情况下测定谷氨酸变位酶的活性，因为这种化合物也可能抑制辅助甲基天冬氨酸酶。因此，标准的甲基天冬氨酸酶偶联测定法无法测定谷氨酸变位酶的活性以解决抑制动力学问题。本文报道了一种新方法的最新发展，该方法通过紫外分光光度法测定谷氨酸变位酶催化 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 转化为 ( S )-谷氨酸 (4) 的活性。开发的测定法使用两种辅助酶；5-磷酸吡哆醛依赖性谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶和 NADH 依赖性（R ) 2-羟基戊二酸脱氢酶。该论文进一步描述了所开发的活性测定方法在其假设抑制剂存在下测量谷氨酸变位酶活性的适用性；顺式- 戊烯二酸 (10)、反式- 戊烯二酸 (11)、丁-1、3-二烯-2、3-二羧酸 (12)、富马酸 (13)、马来酸 (14) 和衣康酸 (15)。这些化合物 (11 - 15) 被指定为竞争性抑制谷氨酸变位酶，因此适用于所提出的基于机制的谷氨酸变位酶抑制研究。还报告了 (2 S , 3 S)- 3-甲基天冬氨酸 (5) 在谷氨酸变位酶催化的反应中由酶活性测定的新方法和可逆异构化的平衡常数确定，该平衡常数由 ( S )-谷氨酸 (4) 的动力学常数和(2 S , 3 S )-3-methylaspartate (5) 在谷氨酸变位酶的反应中。从谷氨酸变位酶在 S、E 和还讨论了辅酶 B 12 (1) 或腺苷肽 B 12 (3)。
2。材料和方法
2.1. 一般的
部分纯化的甲基天冬氨酸酶（44 U∙mg −1，25 % 产率，3.2 富集）是按照已发表的程序从破伤风梭菌的无细胞提取物中制备的 [ 28 ]。同样，如文献中所报道的，分别制备了来自耳蜗梭菌的具有 glmS和glmE插入片段的pOZ3和 pOZ5 载体质粒。每个质粒构建体都用于转化大肠杆菌 DH 5 α细胞。谷氨酸变位酶的部分纯化重组S (66 U∙mg −1 , 65% 产率, 51 富集) 谷氨酸变位酶apo-酶蛋白组分在大肠杆菌中过表达后最终制备携带 pOZ3 质粒构建体的 DH5α 细胞。类似地，在携带 pOZ5 质粒构建体的大肠杆菌 DH 5 α细胞中过表达后制备谷氨酸变位酶的部分纯化组分 E（18 U∙mg −1，58 % 产率，38 富集） [ 7 ] [ 29 ]. S 的比活性测量超过 E，因此 E 的比活性测量超过 S。带有 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶编码hgdH插入片段的 PACYCDuet TM -1 载体质粒获自 Ivana 博士Djurdjevic, University of Marburg, 并用于生产重组纯 ( R)-2-羟基-戊二酸脱氢酶（1 kU∙mg −1 , 8 富集）在大肠杆菌BL21 中过表达，而纯谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶 (81 U∙mg −1 ) 购自 Sigma-Aldrich . 腺苷肽 B 12 (3) 辅助因子是苏黎世大学 Felix Zelder 教授的礼物，而cis -glutaconic acid (10) 和 buta-1, 3-diene-2, 3-dicarboxylic acid (12) 是通过以下方法合成的文献报道程序 [ 30 ]。这些研究中使用的其他化学品和生化物质均来自可靠来源。光敏辅助因子；辅酶 B 12 (1)，腺苷肽 B 12(3) 和 pyridoxal-5-phosphate 始终避光，所有涉及它们的测量都在红光下进行。谷氨酸变位酶催化 ( S )-谷氨酸 (4) 转化为 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 的活性在不同数量的辅因子中进行了测定；辅酶 B 12 (1) 或腺苷肽 B 12 (3) 以确定每个辅因子的动力学常数，从而在确定 ( S )- 谷氨酸 (4) 的动力学常数时改变 ( S )-谷氨酸 (4)的量). 对应于指定量的辅助因子的初始反应速率值；辅酶 B 12 (1) 或腺苷肽 B 12(3) 以及 ( S )-谷氨酸 (4) 通过标准的甲基天冬氨酸酶偶联测定进行全程测量。米氏法测定( S )-谷氨酸(4)、辅酶B 12 (1)和腺苷肽B 12 (3)在谷氨酸变位酶催化反应中的动力学常数。一种新开发的 pyridoxal-5-phosphate 依赖性谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶和 NADH 依赖性 ( R ) 2-hydroxyglutarate dehydrogenase coupled assay of glutamate mutase activity is used to measure the initial rates of conversions of (2 S , 3 S )-3 -甲基天冬氨酸 (5) 到 ( S )-谷氨酸 (4) 通过谷氨酸变位酶以不同量的 (2 S, 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5)。(2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸(5)在谷氨酸变位酶逆反应中的动力学常数也用Michaelis-Menten法测定。在谷氨酸变位酶活性的所有测量中，辅因子的量；辅酶 B 12 (1) 或腺苷肽 B 12 (3) 不限制反应。辅助酶系统；甲基天冬氨酸酶以及全谷氨酸丙酮酸氨基转移酶和全 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶在整个测量过程中也不限制谷氨酸变位酶。k cat的值对于谷氨酸变位酶，从全酶重建中使用的组分 E 的量计算。
2.2. 辅助因子动力学常数测定法
全谷氨酸变位酶在 Tris/HCl (50 mM, pH 8.3) 和巯基乙醇 (0.05 mM) 中于 37˚C 下从部分纯化的 S 和 E 重组蛋白和辅助因子中完全重组。每个辅助因子的K M和在 14、7 和 2 倍过量 S 中的反应的V max从一系列测定中获得，其中全酶由 S（5 µg）重组：E（2.5 µg），S（2.5 µg ): E (2.5 µg) 和 S (0.15 µg): E (2.5 µg), 分别。部分纯化的甲基天冬氨酸酶 (36 µg) 也包含在所有测定混合物中。在辅酶 B 12 (1)的量变化 (0.32 µM - 25 µM) 的一系列测定中，每个反应都是通过添加 ( S)-谷氨酸 (4) (20 mM) 添加到测定混合物中，然后通过紫外分光光度法测定 240 nm 处的谷氨酸变位酶活性。同样，腺苷肽 B 12 (3) 的动力学常数在 14 倍和 7 倍过量的 S 中测量，每种脱辅基酶组分的量相对增加 10 倍，腺苷肽 B 12 (3) (0.35 µM - 70 µM) 的量不同。
2.3. ( S )-谷氨酸动力学常数测定法 (4)
含有 14 倍过量组分 S 的全谷氨酸变位酶在 Tris/HCl（30 mM，pH 8.3）和37˚C 时的巯基乙醇 (1 mM)。部分纯化的甲基天冬氨酸酶 (36 µg) 也包含在所有测定混合物中。在分光光度法测定 240 nm 处的谷氨酸变位酶活性之前，通过向测定混合物中添加不同量的 ( S )-谷氨酸 (4) (5 mM - 300 mM) 来开始每个反应。
2.4. 测定每种拟议的谷氨酸变位酶抑制剂与甲基天冬氨酸酶的相互作用
部分纯化的甲基天冬氨酸酶 (9 µg) 与每种抑制剂化合物 (10)-(15)（1 mM 或 2 mM）在 Tris/HCl（45 mM，pH 8.3）和巯基乙醇 (0.05 mM) 中于 37˚C 孵育，用于2 或 6 分钟。在每个测定中，在 240 nm 的甲基天冬氨酸酶活性分光光度法测定之前，通过向测定混合物中添加 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) (70 mM) 来开始反应。甲基天冬氨酸酶在每种抑制剂存在下持续特定持续时间的测量活性最终报告为无抑制剂甲基天冬氨酸酶活性的百分比，其在没有抑制剂的类似测定中测量。
2.5. 测定谷氨酸变位酶与其假设抑制剂的相互作用
将每种抑制剂化合物 (10)-(15) (3 mM) 与脱辅酶蛋白组分一起孵育；S (10 µg)、E (5.2 µg) 和辅酶 B 12 (1) (0.05 mM) 在 Tris/HCl（30 mM，pH 8.3）和巯基乙醇 (1 mM) 中，37˚C 5 分钟。在将甲基天冬氨酸酶 (72 µg) 添加到每个测定混合物之前，使用 Sephadex G 25 去除多余的蛋白质未结合抑制剂和辅助因子分子。在将 ( S )-谷氨酸 (4) (40 mM) 添加到每个测定混合物后，最终通过 240 nm 紫外分光光度法测定谷氨酸变位酶的残留活性。
2.6. 测定谷氨酸变位酶催化 (2 S , 3 S )-3-Methylaspartate (5) 转化为 ( S )-Glutamate(4) 的活性和 (2 S , 3 S )-3-Methylaspartate动力学常数的测定(5)
谷氨酸变位酶活性通过紫外分光光度法在 37˚C 下通过每次添加 (2 S , 3 S )-3后 NADH ( λ max = 340 nm, Ɛ 340 = 6.3 mM −1 ∙cm −1 ) 的吸光度降低来确定甲基天冬氨酸 (5) (5 - 300 mM) 和丙酮酸 (20 mM) 到全谷氨酸变位酶组分的混合物；S (10 µg)、E (5 µg)、辅酶 B 12 (1) (0.025 mM) 和两种辅助全酶；谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶 (40 µg)、5-磷酸吡哆醛 (0.02 mM)、( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶 (20 µg) 和 NADH (0.2 mM)，溶于 Tris-HCl（30 mM，pH 8.3）和巯基乙醇(0.05 毫米)。
(2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 = L-谷氨酸
L-谷氨酸 + 丙酮酸 = 2-氧代戊二酸 + L-丙氨酸
2-氧戊二酸 + NADH + H + → ( R )-2-羟基戊二酸 + NAD +
总和：(2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 + 丙酮酸 + NADH + H + → L-丙氨酸 + ( R )-2-羟基戊二酸 + NAD +
2.7. 测定拟议的谷氨酸变位酶抑制剂与谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶和 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶的相互作用
每种建议的谷氨酸变位酶抑制剂 (10)-(15) 分别用全谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶和 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶系统进行测定。两种全酶的成分；谷氨酸-丙酮酸转氨酶 (40 µg)、5-磷酸吡哆醛 (0.02 mM)、( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶 (20 µg) 和 NADH (0.2 mM) 与每种抑制剂一起孵育 (10)-(15 ) (20 mM) 在 Tris-HCl (30 mM, pH 8.3) 和巯基乙醇 (0.05 mM) 中，37˚C 5 分钟。每次孵育后，加入谷氨酸-丙酮酸转氨酶底物开始反应；丙酮酸 (20 mM) 和 ( S )-谷氨酸 (4) (20 mM) 在测定 NADH 递减量 (Ɛ 340= 6.3 mM −1 ∙cm −1 ) 在 340 nm 通过紫外分光光度法。
3。结果与讨论
类似于辅酶 B 12依赖性谷氨酸变位酶的许多其他报道的动力学研究，这些研究使用标准的甲基天冬氨酸酶偶联测定来测量酶的活性 [ 14 ] [ 17 ]，最近对辅酶 B 12谷氨酸变位酶机制的动力学研究（ 1) 和腺苷肽 B 12 (3) 辅助因子也依赖于标准的甲基天冬氨酸酶偶联试验来测量谷氨酸变位酶的活性 [ 20 ]。腺苷肽 B 12 (3) 在谷氨酸变位酶催化 ( S )-谷氨酸 (4) 转化为 (2 S , 3 S)-3-甲基天冬氨酸 (5) 是通过米氏法测定两种不同相对量的脱辅酶组分 S：E 2 和 14，以及从全酶重组中获得的辅酶 B 12 (1) 2、7 和 14 S：E（表 1）[ 20 ]。辅酶 B 12 (1) 和腺苷肽 B 12 (3) 在 2 和 14 S 中几乎相等的K m值：全谷氨酸变位酶的 E 重组表明辅酶 B 12 (1) 的低配体对该机制没有影响辅因子与脱辅酶的结合。此外，随着早前报道的k cat的减少
| 辅助因子 | S:E | K m (µM) | k猫(s −1 ) | (s −1 ∙µM −1 ) |
| 辅酶 B 12 (1) | 2:1 | 1.12 ± 0.04 | 1.24 ± 0.36 | 1.11 |
| 7:1 | 0.7 ± 0.05 | 0.9 ± 0.4 | 1.29 | |
| 14:1 | 0.52 ± 0.06 | 1.24 ± 0.36 | 2.39 | |
| 腺苷肽 B 12 (3) | 2:1 | 1.07 ± 0.04 | 0.12 ± 0.01 | 0.1 |
| 14:1 | 0.35 ± 0.05 | 0.09 ± 0.01 | 0.26 |
表 1。辅因子的动力学常数；辅酶 B 12 (1) 和腺苷肽 B 12 (3) 在谷氨酸变位酶催化下 ( S )-谷氨酸 (4) 转化为 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5)，由 Michaelis-Menten 测定方法在不同相对量的脱辅基酶组分S：E与辅助因子。
当全酶用腺苷肽 B 12 (3) 相对于辅酶 B 12 (1) 重构时，( S )-谷氨酸 (4) 转化为 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) ，[ 20 ]相同的动力学数据证明了脱辅基酶组分的比例与最大转化率无关。然而，有趣的是，在 ( S )-谷氨酸 (4) 转化为 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5)的过程中，辅因子的K m值显示出一致的趋势，这与脱辅酶成分的比例相关形成全酶（表 1 )。从全酶与辅酶 B 12 (1) 和腺苷肽 B 12 (3) 的重组中获得的结果清楚地表明，由于在从单独的脱辅酶组分和辅因子重构全酶中使用的 S 量增加，辅因子的K m降低。这些趋势表明，由于用于重构全谷氨酸变位酶的组分 S 的量增加，辅助因子与脱辅基酶的结合增加。一致地，辅酶 B 12 (1) 在 ( S )-谷氨酸 (4) 到 (2 S , 3 S ) 的相同转化中的K m)-3-methylaspartate (5) 通过谷氨酸变位酶在另一项使用融合 SE 辅酶的研究中获得是 5.5 ± 0.7 µM [ 17 ]。该值比本研究中获得的 1.12 ± 0.04 µM 大 5 倍，这是通过在 S: E 2 中用辅酶 B 12 (1) 的单独脱辅酶成分重组全酶而获得的。辅因子的漂移 (1) K m这些不同研究报告的值表明辅酶 B 12 (1) 与脱辅基酶的组分 S 的结合如果发生在组分 S 与 E 组装之前发生，则比与 ES 的结合更有效。K m的这种比较导致这种概念的值是基于这样一个事实，即融合酶具有脱辅酶蛋白组分 S: E 2 的比例，而在所有重组中，辅酶 B 12 (1) 和腺苷肽 B 12 (3) 的较低坐标都被替换为来自亚基 S 的 His 16 的咪唑。同样，本研究中获得的辅因子的K m值的趋势类似于通过凝胶过滤研究辅酶 B 12 (1) 与脱辅酶结合的研究报告的趋势，其中表观K E 2 S 2 -B 12的辅因子和解离常数( K d )的m当全酶的重组从 mutS：mutE 1 到 5 变化时，复合物分别从 18 µM 减少到 5.8 µM 和 5.4 µM 到 1.8 µM [ 8 ]。
此外，最近提出的通过使用其推定的抑制剂化合物对谷氨酸变位酶进行基于机制的抑制研究（图 2）需要谷氨酸变位酶与每种抑制剂化合物相互作用的动力学描述。因此，在存在每种抑制剂的情况下，确定谷氨酸变位酶反应中底物的动力学常数以及抑制常数对于确定谷氨酸变位酶与抑制剂相互作用的性质是必要的。推定抑制剂的分子被设计成类似于 4-谷氨酰胺 (6) 或 (2 S , 3 S )-3-亚甲基天冬氨酸自由基 (7) 的骨架结构，并具有模拟 4-谷氨酰胺 (6) 自由基原子的 sp2 碳原子中心) 和 (2 S , 3S )-3-亚甲基天冬氨酸基团 (7)。根据它们的结构，预测这些抑制剂会结合谷氨酸变位酶活性位点，并在辅因子 (1) Co(III)-C 键均裂后通过与 5'-脱氧腺苷自由基加合反应。因此，提出了通过 EPR 光谱确定谷氨酸变位酶活性位点的每种推定抑制剂反应性，以确定它是否与 2-亚甲基戊二酸变位酶 [ 30 ] 中的主要有机自由基形成自由基加合物以及抑制动力学的测定。由于动力学常数的测定 ( S)-谷氨酸 (4) 在谷氨酸变位酶催化的反应中需要通过标准甲基天冬氨酸酶偶联测定法测量谷氨酸变位酶活性，因此，只有当辅助甲基天冬氨酸酶未被灭活时，谷氨酸变位酶与每种建议抑制剂相互作用的动力学表征才有可能抑制剂化合物。然而，这项研究揭示了甲基天冬氨酸酶与 1 mM 的顺式-戊烯二酸 (10) 孵育 2 分钟和 6 分钟后，比活性分别降低了 10% 和 20% （图 3）。同样，几何异构体反式-戊烯二酸 (11) 表现出类似的抑制作用。由于顺式- 戊烯二酸 (10) 和反式- 戊烯二酸 (11) 模拟
图 2。结构类似于中间体 4-谷氨酰自由基 (6) 的分子；顺式- 戊烯二酸 (10)、反式- 戊烯二酸 (11) 和 (2 S , 3 S )-3-亚甲基天冬氨酸基团 (7)；丁-1、3-二烯-2、3-二羧酸盐 (12)、富马酸盐 (13)、马来酸盐 (14) 和衣康酸盐 (15)。
图 3。在每种推定的谷氨酸变位酶抑制剂存在下测量的甲基天冬氨酸酶活性相对于其最大活性或无抑制剂甲基天冬氨酸酶的活性 (44 U∙mg -1 )（蓝色条）。橙色和灰色条分别为甲基天冬氨酸酶（44 U∙mg -1 , 9 µg）与 1 mM 每种抑制剂的孵育时间为 2 分钟和 6 分钟
4-谷氨酸自由基 (6) 在谷氨酸变位酶的活性位点，因此 2 mM 的每个谷氨酰胺等于( S )-谷氨酸 (4) 的K m在谷氨酸变位酶反应中的作用被确定为还原甲基天冬氨酸酶比活性在 2 分钟内降至 40% 以下（图 4）。通过等于K m的抑制剂量，辅助酶活性的显着降低在谷氨酸变位酶机制中形成模拟自由基的底物的分析证实了甲基天冬氨酸酶偶联测定法在测量谷氨酸变位酶活性时存在任一戊二酸的情况下的不适当性。从评估甲基天冬氨酸酶与模拟 (2 S , 3秒)-3-亚甲基天冬氨酸自由基(7)在谷氨酸变位酶的作用机制中。富马酸盐 (13) 表现出最强的抑制作用，它在与酶孵育 1 mM 后 2 分钟内导致甲基天冬氨酸酶完全失活，而最弱的抑制作用是 but-1, 3-diene-2, 3-dicarboxylate ( 12) 在其 2mM 与酶孵育 6 分钟后，甲基天冬氨酸酶活性降低 50%（图 3和图 4）。显着低于 7 mM 的抑制剂量的这些抑制程度是显着的，7 mM 是(2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 在谷氨酸变位酶反应中的K m 。因此，类似于顺式- 和反式-戊二酸，后一种化合物抑制谷氨酸变位酶的动力学不能通过标准的甲基天冬氨酸酶偶联测定来确定。
图 4。相对于其最大活性或无抑制剂酶的活性 (44 U∙mg -1 )（蓝色条），在存在每种推定的谷氨酸变位酶抑制剂的情况下测量的甲基天冬氨酸酶的活性。橙色和灰色条分别为甲基天冬氨酸酶（44 U∙mg −1 , 9 µg）与 2 mM 每种抑制剂的孵育时间为 2 分钟和 6 分钟
然而，可能与抑制剂结合的全谷氨酸变位酶的残留活性通过甲基天冬氨酸酶偶联测定法进行了评估。使用 Sephadex G 25 制备不含蛋白质未结合抑制剂分子的抑制剂结合全酶溶液，该溶液在全谷氨酸变位酶与每种抑制剂孵育后去除抑制剂和辅因子的蛋白质未结合分子，从而防止甲基天冬氨酸酶在加入后被灭活过滤。因此，凝胶过滤已确保包含辅助甲基天冬氨酸酶，然后通过添加 ( S )-谷氨酸 (4) 启动谷氨酸变位酶反应。而表观顺式的残留活性-戊二康酸(10)和衣康酸(15)结合的谷氨酸变位酶是无抑制剂谷氨酸变位酶活性的82％，表观反式-戊二康酸(11)结合谷氨酸变位酶表现出无抑制剂酶活性的70％。不含抑制剂的谷氨酸变位酶的活性在明显的 but-1, 3-diene-2, 3-dicarboxylate (12) 结合酶中完全恢复，而出乎意料的是，富马酸 (13) 和马来酸 (14) 使谷氨酸变位酶完全失活。在全谷氨酸变位酶与富马酸 (13) 和马来酸 (14) 厌氧孵育 1 小时后记录了钴钴胺素光谱这一事实（光谱未显示）暗示全酶被 (13) 和 (14) 灭活不会导致 Co(III)-C σ均裂纽带。这些结果表明 (13) 和 (14) 对谷氨酸变位酶的变构结合，这会改变活性位点结构并导致酶失去对 ( S )- 谷氨酸 (4) 的效忠。
有意深入了解抑制剂分子是否变构地结合谷氨酸变位酶或酶活性位点，这是一种测定 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 至 ( S )-谷氨酸转化活性的新方法(4)由谷氨酸变位酶研制而成。该测定利用 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 连同丙酮酸作为底物和吡哆醛-5-磷酸依赖性谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶以及 NADH 依赖性 ( R )- 2-羟基戊二酸脱氢酶作为辅助酶。在该测定中，( S )-谷氨酸 (4) 由 (2 S , 3 S)-3-甲基天冬氨酸 (5) 在谷氨酸变位酶的逆反应中被全谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶转化为 2-酮戊二酸，丙酮酸被分配为丙氨酸。脱氢酶将2-氧代戊二酸进一步还原为 ( R )-2-羟基戊二酸，同时将 NADH 氧化为 NAD +。NADH 的消耗（λ max = 340 nm，Ɛ 340 = 6.3 mM −1 ∙cm −1）允许在 340 nm 处进行谷氨酸变位酶活性的分光光度测定（方案 2）。为了确定 (2 S , 3 S)-3-甲基天冬氨酸 (5) 在推定的抑制剂化合物 (10)-(15) 存在下的谷氨酸变位酶反应中，评估了每种抑制剂化合物对两种辅助酶系统的作用。在将 ( S )-谷氨酸 (4) 和丙酮酸添加到全谷氨酸-丙酮酸转氨酶和 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶与每种抑制剂孵育的混合物中后，谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活性相对完全恢复。这些结果证明了新的 pyridoxal-5-phosphate 依赖性谷氨酸-丙酮酸转氨酶和 NADH 依赖性 ( R)-2-羟基戊二酸脱氢酶偶联测定在存在每种假定抑制剂的情况下测量谷氨酸变位酶的活性。因此，建议应用新的检测方法
方案二。在谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶和 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶偶联谷氨酸变位酶活性测定中，从 ( 2S , 3S )-3- 甲基天冬氨酸 (5) 产生 ( R )-2-羟基戊二酸的酶促转化
在拟议的基于机制的谷氨酸变位酶抑制研究中，有可能深入了解谷氨酸变位酶与化合物 (10)-(15) 的相互作用。
此外，新测定法还用于确定 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 在谷氨酸变位酶反应中的动力学常数。连同 ( S )-谷氨酸 (4) 在逆反应中的动力学常数，如标准甲基天冬氨酸酶偶联测定法 (表 2 ) 所示， ( S )-谷氨酸 (4) 和 (2)之间可逆异构化的平衡常数S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5), K eq =[( S )-谷氨酸 (4)] × [ (2 S , 3 S )-3-甲基甲基天冬氨酸 (5)] −1 = V× _ _（向前）× V− 1× _ _（反向）× 钾米( 2秒,3秒) -3-甲基天冬氨酸× 钾− 1米（小号) -谷氨酸= 16 获得。
该值与文献 ( K eq = 12) 中描述的值相当，[ 27 ] 直接从 ( S )-谷氨酸 (4) 和 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5)的浓度获得) 在类似于分析混合物的条件下达到平衡，最终达到表 2中的动力学常数。
4。结论
辅酶 B 12 (1) 的K m降低，如腺苷肽 B 12 (3) 在 ( S )-谷氨酸 (4) 向 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5)的转化中在用辅因子从单独的辅酶成分重构 E 2 S 2 -B 12时增加 S 的量意味着辅因子对辅酶的亲和力随着 S 的增加而增加。相应地，获得的辅酶 B 12 (1)的K m值在这项研究中，E 2 S 2 -B 12由单独的脱辅基酶成分重组而成；S 和 E 以及在另一项使用融合脱辅酶成分 SE 的研究中获得的结果清楚地表明辅因子结合 S 比 ES 更有效。[ 17 ] 因此，活性 E 2 S 2 -B 12的体外形成是通过 SB 12与 E 2的组装而发生的，此时 S 在与 E 2组装之前与钴胺素结合，并且钴胺素与整个脱辅酶结合；ES，其中来自动力学研究的数据表明前者比后者更有效。同样，这些发现与一项研究报告的结果得到证实，在该研究中，辅酶 B 的结合模式12 (1)
| 承印物 | 米(毫米) | V最大(U∙mgE −1 ) | k猫(s −1 ) | (s −1 ∙mM −1 ) |
| ( S )-谷氨酸 (4) | 2.25 ± 0.03 | 3.2±0.5 | 2.85 ± 0.5 | 1.3 |
| (2 S , 3 S ) -3-甲基天冬氨酸 (5) | 7 ± 0.07 | 0.6±0.6 | 0.54 ± 0.6 | 7.7 × 10 -2 |
表 2。底物的动力学常数；( S )-谷氨酸 (4) 和 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 在谷氨酸变位酶与辅酶 B 12 (1) 在 S: E 14 中重组的反应中，由 Michaelis-Menten 方法测定.
通过平衡凝胶过滤评估脱辅酶。后一项研究表明辅酶 B 12 (1) 与辅酶的亲和力增加，同时E 2 S-B 12复合物的表观解离常数 ( K d ) 降低，这是由于 mutS 的量增加，同时从单独的辅酶成分重构全酶；mutS 和 mutE 由C. tetarnomorphum和辅酶 B 12 (1) [ 8 ] 制备而成。
通过 E 2 S 2 -B 12与全谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶和全-( R )-2偶联 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5) 到 ( S )-谷氨酸 (4) 的转化-羟基戊二酸脱氢酶在丙酮酸存在下成功地将 ( S )-谷氨酸 (4) 通过 2-酮戊二酸转化为 ( R ) -2-羟基戊二酸，同时分配 ( S )-丙氨酸和 NADH 氧化 ( λmax = 340 nm , ε 340 = 6.3 毫米-1 ∙厘米-1). 后者允许通过 340 nm 的紫外分光光度法测量谷氨酸变位酶的活性。这种测定谷氨酸变位酶活性的新方法被用于测定谷氨酸变位酶反应中(2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸(5) 的动力学常数。连同通过标准甲基天冬氨酸酶偶联测定确定的 ( S )-谷氨酸 (4) 的动力学常数，通过 Briggs-Haldane 方程计算谷氨酸变位酶催化的可逆转化的平衡常数 ( K eq ) =16。这一发现揭示了对 ( S )-谷氨酸 (4) 的平衡与早先报道的K eq一致=12，这是反应开始一段时间后 ( S )-谷氨酸 (4) 与 (2 S , 3 S )-3-甲基天冬氨酸 (5)的恒定比率[ 27 ]。新测定进一步证明了其在确定化合物 10 至 15 的谷氨酸变位酶抑制动力学方面的有用性，因为在每种抑制剂化合物与全谷氨酸-丙酮酸转氨酶和 ( R )-孵育后，全谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活性相对完全恢复。 2-羟基戊二酸脱氢酶。
致谢
感谢苏黎世大学 Felix Zelder 教授为我们提供腺苷肽B12和马尔堡大学 Ivana Djurdjevic 博士为 PACYCDuet TM -1 载体质粒提供 ( R )-2-羟基戊二酸脱氢酶编码hgdH使我们能够生产重组 ( R )-2-羟基-戊二酸脱氢酶的插入片段。我们感谢 Deutscher Akademischer Auslands Dienst (DAAD)、马克斯普朗克研究所和马尔堡的 LOEWE-Zentrum für Synthetische Mikrobiologie 为 FEL 提供奖学金。这项工作由德国研究基金会 (DFG) 和 Fonds der Chemischen Industrie 资助。
利益冲突
作者声明本文的发表不存在利益冲突。
参考
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