摘要:
异烟肼引起的肝毒性是接受抗结核治疗和预防的患者的主要关注点。它可导致血清肝酶升高和肝功能衰竭。本研究的目的是评估白果木水提物的植物化学成分和对异烟肼 (INH) 诱导的成年雄性 Wistar 大鼠肝毒性血清肝酶的改善作用。将三十六 (36) 只成年雄性 Wistar 大鼠分成六组,每组六只,并如下口服治疗 30 天: I 组:1 ml/kg 蒸馏水;第二组:异烟肼(27 毫克/千克);第 III 组:异烟肼 (27 mg/kg) + Livolin forte (20 mg/kg);IV 组:异烟肼 (27 mg/kg) + B. coccineus (200 mg/kg);第 V 组:异烟肼 (27 mg/kg) + B. coccineus(400 毫克/千克); 第 VI 组:异烟肼 (27 mg/kg) + B. coccineus (800 mg/kg)。在实验结束时,处死 Wistar 大鼠并获得血清用于肝酶测定,同时收获肝组织并用于组织学研究。单宁、皂苷、生物碱和类黄酮的含量分别为 2.29%、18.05%、23.24% 和 18.99%。异烟肼治疗组的血清 AST 和 ALT 升高,这被 livolin forte 和 200 mg/kg 剂量的水提取物逆转,但是提取物在更高剂量下增加了 AST 和 ALT 的血清水平,然而,与对照组相比,这并不显着 (p > 0.05) 。有证据表明肝细胞减少与异烟肼未处理组相比,提取物处理组的损伤。总之,B. coccineus的水提物在 200 mg/kg 时对成年雄性 Wistar 大鼠的异烟肼肝毒性表现出保肝作用。
关键词
Brysocarpus coccineus ,异烟肼,肝毒性,植物化学物质
一、简介
抗结核药物性肝损伤(ATDILI)是台湾、中国、南非和许多其他地区最普遍的药物性肝毒性,它既可能威胁患者的健康,也可能阻碍结核病(TB)的治疗。因此,尝试改善这种潜在的严重药物性肝损伤 (DILI) 至关重要。三种常见的结核病一线药物是异烟肼、利福平和吡嗪酰胺,它们有可能引起肝损伤 [ 1 ] [ 2] 。抗结核药物引起的肝损伤 (ATDILI) 的范围从轻微到严重,甚至可能是致命的。ATDILI 的发生率取决于不同的抗结核治疗方案、肝损伤的定义和种族人群。一般有10%~20%的患者在服用这些药物期间可出现血清转氨酶升高。大约 1% 的患者可能会发展为明显的肝炎,定义为伴有黄疸的症状性肝毒性和血清转氨酶显着升高。据估计,明显肝炎患者的死亡率约为 10% [ 2 ]。
异烟肼主要通过肝脏中的 N-乙酰转移酶 2 (NAT2) 乙酰化清除,生成乙酰异肼,然后水解为异烟酸和单乙酰肼 (MAH)。异烟肼水解酶催化异烟肼水解,形成肼,然后通过 NAT2 代谢为 MAH。MAH 可乙酰化为无毒的二乙酰肼,或被细胞色素 (CYP2E1) 氧化为肝毒性中间体 (Ching, 2011)。乙酰肼可水解为肼,肼可进一步诱导 CYP2E1,增加有毒代谢物的产生。肼、MAH 和异烟酸是 INH 的潜在肝毒性代谢物,这些反应性代谢物在患者体内的蓄积可能导致严重的药物不良反应。在大鼠中给予乙酰肼或乙酰异烟肼导致产生反应性烷基化物质并与肝蛋白共价结合,引起肝细胞损伤,表现为肝细胞坏死、肝窦扩张和炎性细胞浸润。NAT2 是参与 INH 和代谢物代谢途径的主要已知酶,被认为在 INH 诱导的肝毒性中发挥重要作用,特别是 NAT2 慢乙酰化基因型/表型 [3 ]。
传统医学实践是尼日利亚约 200,000 名传统医学从业者的重要生计来源和主要收入来源;他们中的大多数人依赖药用植物作为他们的主要药物来源。在许多国家,现代医学已经用许多合成产品取代了传统药物,但近 30% 的药物制剂仍直接从植物中提取。对草药传统药物进行了大量研究,并产生了大量关于其功效的实验室数据 [ 4 ] [ 5 ]。
豆荚木 Schum。和索恩。(Connaraceae) 是一种广泛分布于热带非洲的攀缘灌木,在民族医学中用于治疗多种疾病。在尼日利亚北部,它被豪萨人称为“Tsamiyar kasa 或 kimbar maharba”。富拉尼人称其为“wangarabubi 或 yangara-bubihi”,而巴桑格人称其为“Kogi”。在尼日利亚南部,约鲁巴人称其为“Oke abolo”或“Mybo-apepea”[ 6 ]。阿达玛瓦州的基尔巴人称其为“mblakiki”。紫果木已被证明可用于治疗口咽、皮肤病、泌尿生殖道和血液学问题 [ 7 ] [ 8 ]。
2。材料和方法
2.1. 动物分类和药物管理局
购自扎里亚艾哈迈杜贝洛大学人类生理学系实验动物房,共36只体重100g~150g的成年雄性Wistar大鼠。将动物维持在正常实验室条件下。动物饲养在种植者捣碎的颗粒上,并随意饮水。该研究持续了三十 (30) 天。分组和管理如下进行:
第 I 组:每次口服 (po) 蒸馏水 30 天(对照)。第 II 组——异烟肼(27 毫克/千克/天),口服 30 天,用作毒性对照。第 III 组——异烟肼(27 毫克/千克/天),口服和利沃林20毫克/千克,口服 30 天,作为阳性对照。第 IV 组——异烟肼(27 毫克/千克/天),口服和紫檀 200 毫克/千克,口服 30 天。第 V 组——异烟肼(27 毫克/千克/天),口服和紫檀 400 毫克/千克,口服 30 天。第 VI 组——异烟肼(27 毫克/千克/天),口服和紫檀 800 毫克/千克,口服,持续 30 天。伦理批准是从艾哈迈杜贝洛大学伦理委员会获得的,扎里亚动物处理符合标准动物福利指南。
2.2. 样品采集
植物采集与鉴定
该植物是从 Jema'a LGA 的 Nimbia 森林保护区获得的;尼日利亚卡杜纳州。植物鉴定在扎里亚艾哈迈杜贝洛大学生物科学系植物标本室进行,并收集了标本凭证(凭证编号:926)以供进一步参考。
B. coccineus 水提取物的制备
B. coccineus 的新鲜叶子被风干,直到获得恒重。水萃取在 Bassawa Zaria 国家化学技术研究所的基础研究实验室进行。将干燥的材料浸入蒸馏水(3 升中 30 克)中,并在 4˚C 下冷藏。24 小时后倾析提取物。然后将滤液在 40˚C 的烘箱中蒸发至干,得到深棕色粉末(Akindele 和 Adeyemi,2006 年)。一部分提取物用蒸馏水复溶并用于植物化学分析。将干燥的提取物称重并在蒸馏水 (pH = 6.8) 中复溶,然后才施用于实验动物,以获得 10 mg/ml 的浓度,以便能够根据不同治疗组的剂量给予适当的体积.
血样采集
实验结束时,禁食一夜后,动物被安乐死并解剖;通过心脏穿刺收集血液,以3000rpm离心并用于评估肝酶;丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶和天冬氨酸氨基转移酶。还收获肝组织并用于组织学研究。
肝组织采集
在第30天从实验组收获肝组织并用于医学院组织病理学系的组织学研究;艾哈迈杜贝洛大学教学医院,扎里亚。使用 H 和 E 染色技术的方法,包括在酒精浓度从 100%、95%、90% 到最后 70% 的酒精中水化组织切片 [9 ]] 。这些步骤中的每一个都持续三 (3) 分钟,然后将组织在流动的自来水中清洗。组织用苏木精染色二十五 (25) 分钟,用水洗涤,然后在酸性酒精中分化。然后将组织用曙红复染并在斯科特水中染成蓝色。组织用递增等级的酒精水合,并在二甲苯中清洗三 (3) 次,每次更换五 (5) 分钟。使用封固剂将组织与盖玻片封固。在光学显微镜下观察组织并拍摄显微照片。
2.3. 定量植物化学分析
生物碱测定
称取 5 克样品放入 250 毫升烧杯中,加入 200 毫升 10% 乙酸的乙醇溶液,盖上盖子静置 4 小时。将其过滤并将提取物在水浴上浓缩至原始体积的四分之一。将浓氢氧化铵滴加到提取物中直至沉淀完全。让整个溶液沉降,收集沉淀物并用稀氢氧化铵洗涤,然后过滤。残留物是生物碱,将其干燥并称重 [ 10 ] 。
黄酮类物质测定
在室温下用 100 毫升 80% 的甲醇水溶液反复提取 10 克植物样品。整个溶液通过 42 号 whatman 滤纸 (125 mm) 过滤。随后将滤液转移到坩埚中,在水浴上蒸发至干,然后称重至恒重 [ 11 ]。
皂甙的测定
使用的方法是 [ 12] 。将 20 克样品粉末放入锥形瓶中,加入 100 毫升 20% 的乙醇水溶液。将样品在约 55˚C 的热水浴中加热 4 小时,同时持续搅拌。过滤混合物并用另外的200ml 20%乙醇重新提取残余物。在约 90˚C 的水浴上将合并的提取物减少至 40 毫升。将浓缩物转移至250ml分液漏斗中,加入20ml乙醚并剧烈振摇。回收水层,弃去乙醚层。重复纯化过程。添加60ml正丁醇。合并的正丁醇萃取液用 10 毫升 5% 氯化钠水溶液洗涤两次。将剩余的溶液在水浴中加热。
单宁的测定
粉末状提取物 (0.5 g) 在室温下用 300 ml 乙醚提取 20 小时。残余物用100毫升蒸馏水煮沸2小时,然后冷却,过滤。在容量瓶中将提取液定容至 100 ml。使用 Folin-Denis 试剂通过比色法测定提取物中单宁的含量,并通过使用单宁酸溶液作为标准溶液 [ 13 ]测量蓝色络合物在 760 nm 处的吸光度。
2.4. 肝酶分析
使用印度 Agape 诊断试剂盒从血清中测定血清肝酶、丙氨酸转氨酶 (ALT)、天冬氨酸转氨酶 (AST) 和碱性磷酸酶 (ALP)。
血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)的测定
这是通过 [ 14 ]中描述的方法估算的。确切地说,将 1000 μL 试剂加入到 100 μL 样品中,然后混合并在 37˚C 下孵育 1 分钟。用分光光度计在 590 波长处每分钟测量样品吸光度的变化。
血清谷丙转氨酶(ALT)的测定
这是通过 [ 14 ]中描述的方法估算的。确切地说,将 1000 μL 试剂添加到 100 μL 样品中,然后混合并在 37˚C 下孵育 1 分钟。每分钟测量样品吸光度的变化。
血清碱性磷酸酶(ALP)的测定
这是通过 [ 15 ]中描述的方法估算的。确切地说,将 0.5 mL 试剂添加到 0.05 mL(500 μL)样品中,然后混合并在 37˚C 下孵育 10 分钟。每分钟测量样品吸光度的变化。
3。结果与讨论
表 1中的本研究结果显示了单宁酸、皂苷、生物碱和类黄酮的百分比;分别为 2.29%、18.05%、23.24% 和 18.99%,其中生物碱的含量最高。植物产品的抗氧化特性主要由它们的酚类化合物含量介导,例如类黄酮、酚酸、单宁和酚类二萜 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]] 。这些可能在 200 mg/kg 的提取物的改善作用中发挥了作用。植物化学物质是从植物中提取的化学物质。根据它们在植物新陈代谢中的作用,这些化学物质被分类为主要或次要成分。主要成分包括常见的糖、氨基酸、蛋白质、核酸的嘌呤和嘧啶、叶绿素等。次要成分是剩余的植物化学物质,例如生物碱(源自氨基酸)、萜烯(一组脂质)和酚类物质(源自来自碳水化合物) [ 19 ] 。
血清肝酶是肝毒性的重要标志物,血清丙氨酸转氨酶对急性肝细胞损伤更具特异性,而天冬氨酸转氨酶位于胆管内壁细胞中 [20 ]。在表 2中,异烟肼治疗组的血清天冬氨酸转氨酶 (AST) 无显着升高 (P > 0.05),表明可能对肝胆管造成急性损伤,这种升高可被异烟肼治疗逆转
表 1。Brysocarpus coccineus(Conaraceae)水提取物的植物化学研究(定量)结果。
表 2。在异烟肼中用球形芽孢杆菌水提取物处理 30 天后的血清天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 在成年雄性 Wistar 大鼠中引起肝毒性。
NS = 生理盐水,B. coccineus = Byrsocarpus coccineus。
livolin forte 是治疗药物引起的肝毒性和氧化应激的标准治疗药物 [ 21 ]。用 200 mg/kg 提取物处理的组中 AST 血清水平的降低和用 400 和 800 mg/kg 水提取物 B. coccineus 处理组中 AST 水平的剂量依赖性增加可能表明该提取物可逆转低剂量异烟肼的肝毒性作用,同时增强高剂量的毒性作用。这可能是由于提取物代谢过程中可能形成的代谢物对肝细胞产生有害影响。
在表 3中,与正常对照组相比,异烟肼治疗组的血清 ALT 水平没有显着升高。然而,这在用 Livolin forte 和 200 mg/kg B. coccineus 处理的组中发生了逆转,表明提取物可能具有改善肝细胞损伤的特性。提取物中类黄酮的存在也可能通过类黄酮聚合形成尿酸而间接起作用。众所周知,尿酸作为一种抗氧化剂起着至关重要的作用,并且在这项研究中可以改善或消除脂质过氧化,从而有助于恢复肝细胞的完整性。
表4显示血清碱性磷酸酶(ALP)的结果。有一个
表 3。在异烟肼中用球形芽孢杆菌水提取物处理 30 天后,血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 在成年雄性 Wistar 大鼠中引起肝毒性。
NS = 生理盐水,B. coccineus = Byrsocarpus coccineus。
表 4。在异烟肼中用球形芽孢杆菌水提取物处理 30 天后,血清碱性磷酸酶 (ALP) 在成年雄性 Wistar 大鼠中引起肝毒性。
NS = 生理盐水,B. coccineus = Byrsocarpus coccineus,上标 = 统计显着性 (P < 0.05)。
与对照组和异烟肼治疗组相比,800 mg/kg 提取物治疗组血清 ALP 有统计学意义 (P < 0.05) 增加。这种显着的增加可能是由于提取物剂量增加导致肝细胞不堪重负所致。这也可能是由于高剂量提取物可能形成有害代谢物,导致肝细胞脂质过氧化等病症,从而导致肝酶渗漏到循环中。
4. 异烟肼诱导成年雄性 Wistar 大鼠肝毒性 B. coccineus 水提取物治疗 30 天后的组织学研究结果
图 1显示了用蒸馏水处理的正常肝组织的中央静脉和肝细胞,作为对照。然而,图 2和图 3中存在正弦扩张的证据但没有肝细胞膨胀,图 4-6 显示没有肝细胞膨胀和/或正弦扩张。组织学研究已被证明在描述药物引起的肝损伤和这种损伤的程度方面非常重要,因为它显示了与观察到的生化变化相证实的基本肝脏结构的破坏。在这项研究中,没有可见的肝组织损伤指标;包括所有治疗组的肝细胞球囊变性、桥接坏死、肝窦扩张、脂肪沉积或细胞质空泡化;这些特征通常见于异烟肼引起的肝炎。肝实质细胞结构与中央静脉和肝窦一样完整。该结果可能是由于给药剂量或可能的给药持续时间没有考虑到明显的肝炎特征。轻度急性和亚急性肝损伤后,弥漫性分布的肝细胞肿胀伴有非脂质细胞质空泡形成是一致的 [22 ]。然而,在这项研究中,治疗组没有观察到细胞质空泡形成,这可能是由于药物给药的持续时间。
图 1。用蒸馏水口服处理 30 天的 Wistar 大鼠肝脏的显微照片切片(H 和 E,×400。CV = 中央静脉,HC = 肝细胞)。
图 2。口服异烟肼 30 天的 Wistar 大鼠肝脏的显微照片切片(H 和 E,×400。H 和 E,×400。CV = 中央静脉,HC = 肝细胞)。
图 3。口服异烟肼和利沃林 30 天的 Wistar 大鼠肝脏的显微照片切片(H 和 E,×400。H 和 E,×400。CV = 中央静脉,HC = 肝细胞)。
图 4。Wistar 大鼠肝脏的显微照片切片,口服异烟肼和 B. coccineus (200 mg/kg) 30 天(H 和 E,×400。CV = 中央静脉,HC = 肝细胞)。
图 5。Wistar 大鼠肝脏的显微照片切片,口服异烟肼和 B. coccineus (400 mg/kg) 30 天(H 和 E,×400。CV = 中央静脉,HC = 肝细胞)。
图 6。Wistar 大鼠肝脏的显微照片切片,口服异烟肼和球形双歧杆菌 (800 mg/kg) 30 天(H 和 E,×400。CV = 中央静脉,HC = 肝细胞)。
5.结论
Brysocarpus coccineus 含有一些多酚成分,已知这些成分能够使提取物具有抗氧化潜力。然而,这项研究表明,当口服高剂量的 Brysocarpus coccineus 30 天时会产生肝毒性。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
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[ 2 ] Huang, YS (2014) 综述文章:遗传变异和抗结核药物性肝损伤风险的最新进展。中华医学会杂志, 77, 173.
[ 3 ] Ching, S. (2011) 抗结核药物引起异质性肝毒性的遗传多态性研究。为部分满足纽卡斯尔大学哲学博士学位要求而提交的论文,纽卡斯尔,23-34。
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[ 8 ] Amos, S.、Binda, L.、Kunle, OF、Wambebe, C. 和 Gamaniel, K. (2002) 黄豆乙醇提取物的子宫收缩特性。药物生物学,40, 33-38。