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用于生产和筛选阿魏酰寡糖文库的组合酶法

时间:2023-02-14 来源:未知 编辑:-1 阅读:
摘要:

组合化学涉及目标分子结构的多种变化的化学或生物合成,然后筛选库以寻找所需目标特性的变体。该方法一直是药物发现和生物技术研究活动的重点。本报告旨在展示使用组合化学概念的酶技术作为植物纤维生物转化的新方法的应用。对小麦不溶性纤维进行组合酶消化,以产生阿魏酰寡糖 (FOS) 的结构变体。分馏和筛选导致分离出一部分具有抗菌活性的生物活性果寡糖。
 
关键词
 
组合酶,小麦不溶性阿拉伯木聚糖,阿魏酰寡糖,内切木聚糖酶, α-L-阿拉伯木聚糖酶
 
 
一、简介
 
组合化学涉及目标分子的大量不同结构变异的合成,然后筛选构建的文库以寻找表现出所需活性和功能的目标变异 [1] [ 2 ] [ 3 ]。一个简单的有机分子,其核心结构携带 3 个支架,每个支架随机包含 4 种类型的取代基,将产生 4 3 = 64 种结构变体的组合库。在每个位置随机分配 20 种天然氨基酸的六肽库将产生 20 6= 6400 万种不同的肽。用于创建组合文库的化学技术涉及固相合成及其对小有机分子、肽和寡核苷酸文库的改进。相比之下,生物学方法使用遗传密码作为前体,通过系统和重复的选择、突变和扩增,在微生物(如噬菌体、大肠杆菌和酵母)中表达随机文库。动态组合化学的最新发展使得能够设计出在热力学控制下通过响应和重新平衡外部条件而进化的分子“智能”材料库 [4 ]。
 
许多评论讨论了组合化学在药物发现和优化中的技术和应用 [ 3 ] [ 5 ]。组合化学概念在农业科学 [ 6 ] 以及农业和食品研究中的潜在用途受到的关注要少得多[ 1 ] [ 2]]. 植物细胞壁多糖,如木聚糖、果胶和木葡聚糖,由装饰有各种侧基的聚合物主链组成,这些侧基是特定酶的切割目标。这些侧基的存在以及它们的位置、密度和连接类型进一步影响主链聚合物的酶促降解模式,反之亦然。改性主链降解模式的改变反过来会导致不同结构的水解产物。因此,单独和/或顺序地酶促去除侧基部分构成组合设计。低聚糖产品中表达的结构变化将转化为不断变化的反应性和功能特性。图1示意性地展示了来自植物纤维的酶促消化的潜在寡糖结构的几个例子。
 
半纤维素聚合物木聚糖包含 β-1,4-木糖基主链,其装饰有至少四种类型的侧基,即乙酰基、酚阿魏酸、葡萄糖醛酸残基和阿拉伯呋喃糖残基 [7 ]。这些侧基的裂解分别需要乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。这些侧基可以通过特定的酶在不同反应条件下单独或以各种组合靶向每个基团的组合方案中去除。目前的工作
 
 
 
图 1。植物纤维受控酶促水解产生的潜在寡糖结构的一些示例示意图。
 
描述了小麦不溶性阿拉伯木聚糖的组合酶消化以产生低聚木糖文库,从而分离出表现出特定功能活性的 FOS 物种。
 
2。材料和方法
 
材料
 
小麦不溶性阿拉伯木聚糖 (WIA)、黑曲霉 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 (AnABF)、青春双歧杆菌 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 (BaABF) 和海栖热袍菌 β-D-木聚糖酶 (GH10) (TmXYN) 购自 Megazyme (Wicklow,爱尔兰)。大肠杆菌 (ATCC 8739) 获自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯,弗吉尼亚州)。Mueller Hinton (MH) 肉汤和 Amberlite XAD-2 购自 Sigma (St. Louis, MO)。Sephadex LH20 购自 GE Healthcare (Pittsburg, PA)。HPTLC 板购自 Analtech (Newark, DE)。所有化学品和溶剂均为分析级或 HPLC 级。所有实验均使用 Milli-Q 蒸馏水。
 
小麦不溶性阿拉伯木聚糖的酶解
 
通过在 10 毫升水中涡旋悬浮 WIA (100 克),并在室温下浸泡 30 分钟。将不同纳摩尔浓度的 AnABF 和/或 BaABF 添加到悬浮底物中,并通过短暂涡旋充分混合,然后添加不同浓度的 TmXYN。将混合物在 40˚C 下摇动培养 24 小时,并在 4225 RCF 下离心 40 分钟。将回收的上清液在 100°C 下加热 10 分钟以使酶失活并过滤除菌(Nalgene 快速流动过滤器单元)。
 
疏水作用层析
 
使用 Amberlite XAD-2 柱 (2.5 × 50 cm) 在室温下分离酶水解产物。酶消化物首先用 470 ml H 2 O 以 0.7 ml/min 的流速洗脱。收集了 12 毫升的级分。用 H 2 O 洗涤后,使用800 ml CH 3 OH/H 2 O (1:1 v/v) 从柱中洗脱吸附的 FOS。通过 A 320读数测量馏分中的阿魏酸,通过 DNSA 方法 [ 8 ] 测量还原糖,并通过苯酚硫酸法 [ 9 ] [ 10 ] 测量总碳水化合物。合并级分,通过旋转蒸发器浓缩,并在 H 2 O 或合适的溶剂中重构。
 
体积排阻色谱
 
将合并的 FOS 级分溶解在 CH 3 OH/H 2 O (1:3 v/v) 中,并使用 Sephadex LH20 柱 (2.5 × 70 cm) 进一步纯化。使用1:3 CH 3 OH/H 2 O作为洗脱剂以0.6ml/min的流速进行分离。收集 12 毫升的级分,在 320 纳米处测量吸光度。浓缩各个峰以通过 HPLC 进一步分析阿魏酸,并通过如下所述的苯酚-硫酸法进一步分析作为木糖当量的碳水化合物含量。
 
木糖当量和阿魏酸含量的测定
 
浓缩样品中的阿魏酸含量在碱性水解(1N NaOH,37˚C,16 小时)后通过 HPLC 进行定量 [ 11 ]。以木糖当量表示的碳水化合物浓度是根据木糖标准曲线 [ 9 ] [ 10 ]通过苯酚-硫酸法测定的。
 
高效液相色谱分析
 
HPLC 分析在装有串联连接的 UV 和 RI 检测器的 Shimadzu LC-10 AD 系统上进行,使用寡糖柱(Supelcogel Ag+)(4.6×250 mm),H 2 O 作为流动相,流速为85˚C 时 0.3 毫升/分钟。凝胶渗透色谱 (GPC) 使用 Ultrahydrogel 柱 (7.8 × 300 mm) 进行,以水为流动相,流速为 0.3 ml/min。支链淀粉标准品用于分子量校准。阿魏酸浓度分析在带有 UV 检测器的 Gilson 系统上进行,使用 Brownlee 分析型 C18 5μ ODS 色谱柱 (260 × 4.6 mm),H 2 O/ HCOOH /CH 3 CN 7:1:2 流动相在流速为 0.2 毫升/分钟。
 
高效薄层色谱
 
将寡核苷酸样品应用于 20 × 10 cm HPTLC 硅胶 F254 板,并使用 EtOAc/HOAc/H 2 O (2:2:1) 显影。然后用含有 1 mg/ml orcinol 的 10% H 2 SO 4甲醇溶液喷洒板,然后在 90˚C 下加热以观察低聚糖。
 
生长实验和培养条件
 
将冻干的大肠杆菌 (ATCC 8739) 用 1 ml 无菌 Difco™ MH (Mueller Hinton) 肉汤再水化并划线到 MH 琼脂平板上。制备 5 ml 培养物(35˚C,210 rpm,4 小时)并测量 600 nm 处的吸光度。培养物用 MH 肉汤稀释至终浓度为 1 × 10 3cfu/ml 基于标准曲线。通过绘制菌落数(通过平板计数)与 OD600(液体培养物)来构建标准曲线。将不同浓度的活性果寡糖(过滤除菌)添加到稀释的大肠杆菌培养物中。在 35˚C、210 rpm 的条件下孵育不同的时间段。通过测量适当稀释的细胞培养物(SpectraMax M2,Molecular Devices,CA)在 600 nm 处的吸光度来确定细胞生长,并通过平板计数确认。作为木糖当量的寡聚物浓度通过基于木糖标准曲线的苯酚-硫酸法测定。最低抑菌浓度 (MIC) 定义为在过夜孵育后抑制微生物可见生长的最低抗菌浓度 [ 12 ][13 ]。
 
3。结果与讨论
 
已经使用各种降解方法研究了阿魏酰寡糖,包括酸水解、水热处理、微波辅助自水解以及植物纤维(如玉米和麦麸、甜菜浆和不溶性小麦阿拉伯木聚糖)的酶处理 [14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17]. 这些方法中的大多数都涉及纤维的非特异性水解分解,并有不受控制地形成副产物的风险。酶处理主要限于使用内切木聚糖酶,产生结构变异有限的寡糖产物。目前的工作采用组合概念,利用三种酶的相互作用,即海栖热袍菌 β-D-木聚糖酶 (TmXYN)、黑曲霉 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 (AnABF) 和青春双歧杆菌 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 (BaABF)。T. maritima 木聚糖酶是一种 GH10 家族木聚糖酶,它有一个活性位点,可以容纳装饰有侧链的木糖残基,产生小尺寸的寡糖产品,与 GH11 木聚糖酶相反,GH11 木聚糖酶表现出对木聚糖骨架中未取代区域的偏好 [18 ]]. 两种 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 AnABF 和 BaABF 分别是 ABF-m 和 ABF-d3 特定类别的成员。ABF-m 从阿拉伯木聚糖中去除单取代的阿拉伯呋喃糖 (Araf) 残基,而 ABF-d3 从阿拉伯木聚糖中的 O-2,3-二取代 Xylp 中去除 O-3 Araf [19 ]。这些酶中每一种酶的作用都会相互作用地影响彼此之间的切割模式和产物的最终结果,从而导致结构变异的多样性扩大 [ 20 ]。
 
小麦不溶性阿拉伯木聚糖经组合酶切得到的可溶性上清液经分级分离得到含阿魏酸的低聚糖(FOS)(图2). 与其他部分相比,FOS 部分由酚酸部分组成,如 320 nm 处的吸光度所示。从洗脱模式来看,FOS 部分比其余部分相对更疏水。基于木糖当量,FOS 产率(第 37 - 46 部分)约为 10 - 13%,包含 WIA 消化物中 98% 的阿魏酸含量。如“方法”部分所述,基于木糖当量(通过苯酚-硫酸法)和 FA 含量(通过碱性水解样品的 HPLC 分析),木糖:FA 的比例在 ~55:1 的范围内。FOS 应用于 Sephadex LH20 柱,进一步分离成
 
 
 
图 2。酶消化的 WIA 的疏水色谱分离。色谱柱:2.5 × 50 cm,Amberlite XAD-2;流速:0.7毫升/分钟;逐步洗脱:450 H 2 O,800 ml CH 3 OH/H 2 O (1:1 v/v),收集的级分:12 ml/管。
 
一个主峰在 320 nm 处显示吸光度(表明酚酸),并且在苯酚-H 2 SO 4测定中呈阳性(表明碳水化合物是中性糖)。
 
FOS 在初始测试中显示出对大肠杆菌菌株 ATCC 8379 生长的抑制作用。使用测试微生物大肠杆菌 ATCC 8379 筛选酶衍生的 FOS 的生物活性特性。在每组实验中,微生物的初始接种被小心地控制在 1 × 10 3 cfu/ml 滴度,以便在相同的起始条件下进行比较。图 3 (a) 显示抑制作用随着浓度的增加而增加,在 0.07% w/v 时实现了对细胞生长的完全抑制,这是 MIC(最小抑制浓度)值。抗菌效果可持续三天甚至更长时间(图 3 (b))。
 
来自 LH20 柱的 FOS 主峰通过 HPLC 凝胶渗透色谱分析显示 MW 的峰 ≃1.3 kD(基于支链淀粉标准曲线)(图 4)。这个大小范围通常被认为属于低分子量低聚糖的范畴。寡糖的小尺寸可能是促进其通过细胞膜的一个因素。抗菌寡糖的报道一般是指低分子量分子,由三聚体、四聚体和五聚体组成。高分子量范围内的低聚糖已被证明会阻止有效的体内利用,并且通常在功能和生物活性方面无效 [ 21 ] [ 22 ]。目前的结果似乎支持小分子
 
 
 
图 3。(a) 活性 FOS 对细胞生长的影响。大肠杆菌 (ATCC 8739) 在 35˚C 的 MH 肉汤中过夜培养,稀释至适当的滴度浓度,并添加不同浓度的 FOS(0.008% 至 0.17%)。继续培养 16 小时。通过测量A 600适当稀释的细胞培养物来确定细胞生长,并且基于转换曲线计算cfu/ml密度。(b) 活性 DOS 对细胞生长的时程效应。大肠杆菌 (ATCC 8739) 在 35˚C 的 MH 肉汤中过夜培养,稀释至适当的滴度浓度,并添加浓度为 0.065% 和 0.086% 的果寡糖。孵育持续 4 天,并在 16、40、64 和 88 小时取样。通过测量 A 600确定细胞生长适当稀释细胞培养物,并使用转换曲线计算 cfu/ml 细胞密度。所有实验一式两份进行。图中数据点上的垂直条表示标准偏差。在某些情况下,与轴刻度相比,sd 非常小,条形可能不清晰可见。
 
 
 
图 4。活性 FA-oligo 物种的 HPLC 凝胶渗透色谱。使用 Ultrahydrogel 120 柱(Waters,4.6 × 250 mm)在配备串联连接的 UV-Vis 和 RI 检测器的 Shimadzu LC-10 AD 系统上进行分析。流动相是在室温下以0.3ml/min的流速流动的H 2 O。(a) RI 和 (b) UV-vis 315 nm 检测。
 
大小可能有助于细胞膜的粘附和渗透,并增加与细胞内成分和过程的潜在相互作用。值得注意的是,HPLC 上的主峰可能不一定代表单一结构,但可能是具有相似大小的寡核苷酸种类的混合物,反映出凝胶基质上的相同排斥模式。
 
抑制机制可能与活性物质的独特结构特性有关。一些类别的酚类化合物的抗菌活性归因于活性双键的存在和酸部分的缔合 [ 23 ]。双键具有亲电性,可以参与多种反应,导致生物分子交联和失活。在木质纤维素材料的水解中发现了酚类化合物的抗菌活性,与普通防腐剂苯甲酸钠相当 [ 24]]. 源自阿魏酰多糖的阿魏酰寡糖已被证明具有生物活性。从竹笋细胞壁制备的阿魏酰化阿拉伯木聚糖三糖 FAXX 抑制轴蛋白刺激的水稻植物细胞生长 [ 25 ]。该研究还表明,阿魏酰基取代基对于抑制作用是必需的,但 FAXX 的糖基部分对于发挥全部活性也很重要。来自玉米麸皮和小麦糊粉层的阿魏酰寡糖已被证明可以抑制 α-葡萄糖苷酶的蔗糖酶和麦芽糖酶活性以及葡萄糖吸收 [ 26 ]。麦麸低聚糖显示出比游离阿魏酸更高的抗氧化活性,并且在动物研究中显示出体内抗氧化应激保护作用 [ 27 ]。
 
在类似的研究中也报道了其他功能性寡糖。藻酸盐低聚糖由主链中的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸组成,已被报道可增强针对念珠菌和曲霉菌细胞生长的选定抗生素作用 [ 28 ] [ 29 ]。酸性(含葡萄糖醛酸)低聚木糖,尤其是醛戊糖醛酸,是某些革兰氏阳性菌的有效抑制剂 [ 21 ]。通过内切多聚半乳糖醛酸酶和果胶酸裂解酶消化柑橘果胶获得的果胶水解产物产生具有抗菌特性的活性果胶寡聚物 [ 30]]. 抑制机制可能归因于果胶酸裂解酶的消除反应导致的不饱和结构(反应性双键)、取代基的酸性(羧基侧基)和分子的小尺寸范围。有必要通过分子、生物化学、微生物学和生理学研究来表征功能性低聚糖的结构和功能连通性以及健康因果关系。
 
在本研究中,FOS 物种的活性可以被认为与一些常用食品防腐剂的活性相当,这些防腐剂通常在 0.1% 的范围内应用。使用不易消化的低聚糖 (NDO) 已成为一个蓬勃发展的行业,为食品提供各种益生元。动物饲料行业可能会发现另一种潜在用途。功能性低聚糖已被推广为动物生产中抗生素的替代品。这些所谓的天然抗菌生长促进剂 (AGP) 近年来受到越来越多的关注 [ 31 ]。这些产品的健康因果关系通常与肠道微生物群中有益细菌的增加以及肠道消化系统生理环境的改变有关 [ 32]. 在实际应用中,功能性低聚糖以亚最低抑制剂浓度使用,以调节微生物群组成。
 
4。结论
 
活性 FOS 物种来源于组合酶消化和分离,并显示抑制大肠杆菌测试生物体 ATCC 8739 的生长。估计 MIC 值与报告的其他活性低聚糖和一些常见食品防腐剂的 MIC 值相当。FOS 物种可能会发现有用的应用,作为高价值益生元的新来源或作为抗菌生长促进剂的替代品。
 
致谢
 
提及公司和/或产品仅供参考,并不意味着批准推荐该产品以排除其他可能也适用的产品。美国农业部的所有项目和服务都是在非歧视的基础上提供的,不考虑种族、肤色、国籍、宗教、性别、年龄、婚姻状况或残疾。作者声明,本文的发表不存在利益冲突。
 
利益冲突
 
作者宣称没有利益冲突。
 
参考
 
[ 1 ] Wong, DWS 和 Robertson, D. (1999) 组合化学及其在农业和食品中的应用。载于:Shahidi 等人,Eds.,Chemicals via Higher Plant Bioengineering,Kluwer Academic/Plenum Publishers,纽约,91-105。
[ 2 ] Wong, DWS 和 Robertson, G. (2004) 将组合化学和生物学应用于食品研究。农业和食品化学杂志,52,7187-7198
[ 3 ] Kennedy, JP、Williams, L.、Bridges, TM、Daniels, RN、Weaver, D. 和 Lindsley, GW(2008)组合化学科学在现代药物发现中的应用。组合化学杂志,10, 345-354。
[ 4 ] Herrmann, A.(2014 年)动态组合/共价化学:读取、生成和调节化合物和化合物混合物生物活性的工具。化学学会评论,43,1899-1933。
[ 5 ] Seneci, P.、Fassina, G.、Frecer, Y. 和 Miertus, S.(2014 年)组合化学和技术对药物发现和生物技术的影响——简短回顾。Nova Biotechnologica et Chimica,13, 87-108。
[ 6 ] Lindell, SD、Pattenden, LC 和 Shannon, J. (2009) 农业科学中的组合化学。生物有机与药物化学,17,4035-4046。
[ 7 ] Biely, P.、Singh, S. 和 Puchart, V. (2016) 复杂植物木聚糖结构的酶分解:最新技术。生物技术进展,34,1260-1274。
[ 8 ] Miller, GL (1959) 使用二亚硝基水杨酸试剂测定还原糖。分析化学,31, 426-428。
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