大肠杆菌中过表达的有机汞裂解酶 (MerB)捕获并分解有机汞化合物,并且已通过中子辐照的放射性分析检测到。当细菌在 24 至 72 小时内生长时,转基因大肠杆菌从培养溶液中捕获大量汞,回收率约为 80%。由于改良的大肠杆菌没有汞代谢的附加基因,细菌可以通过细胞内的 MerB 酶将汞紧紧地固定住,不会将其释放到培养基中。后期,72小时后,细菌恢复率较低;它可能受到细菌生长中未分解的汞化合物的影响。细菌的恢复能力不会因添加 MerB 生成试剂 (IPTG) 而改变。汞原子的定量值是通过反应堆中子从滤纸上的干燥电池或溶液中发射的γ射线来估算的,可用于对含有汞原子的细菌进行无损检测。在这种方法中,一个从受污染溶液中有效回收有毒汞的系统在不破坏样品的情况下得到了存档,即所谓的电池内分析。
关键字
有机汞,裂解酶,放射性,无损分析
一、简介
汞,尤其是一些有机汞化合物,如甲基,对环境和人类健康构成威胁 [ 1 ]。当前,在全球范围内防止汞污染面临着紧迫的挑战。日本对汞污染的调查由来已久,并从日本水俣市发生的汞中毒灾难(即水俣病[2] )中吸取了教训。此外,Mukai 等人。[ 3] 报道了一种通过使用氯气沉淀甲基汞几乎可以完全去除废液中无机汞的方法(称为共沉淀法)。后来,科学家们专注于生物修复和基因工程的发展。已经进行了许多研究工作来开发复杂的化学反应和测量装置来确定残留汞的数量;然而,转换方法(从有机汞到无机汞)及其应用方法尚待开发。利用能够分解汞化合物的微生物 [ 4 ] 对对抗汞污染至关重要。有效地实现这一点并使用合成净化剂作为一种经济的环保技术是很重要的。
需要解决的最重要问题是确定过度表达的细菌细胞系是否“主动”吸收溶剂中的有机汞。在活细胞中的一般酶促反应中,当底物在溶液中的摄取超过其扩散系数时,就会出现诱导底物摄取的系统。在耐汞细菌菌株中,溶液中的有机汞化合物通过位于细胞外膜上的基因产物(蛋白质)MerP 和 MerG 以及存在于内膜上的 MerE 和 MerT 携带至细胞 [5 ]。有机汞降解酶 (MerB) 在细胞内“通过自由扩散”降解。在复合结构内转移后,MerA 产生无机汞并将其排泄到细胞外。
本研究重点关注 MerB 蛋白,它最初是作为一种细菌酶被分离出来的 [ 6 ]。他们还研究了它的各种物理特性。车等。[ 7 ] 提出了一种解毒和释放途径,其中 MerB 催化从甲基汞中去除 Hg(II),然后 MerA 转化为 Hg(0) 无机汞。在这项开创性的研究之后,科学家们在使用耐汞细菌方面取得了显着进展。例如,Di Lello P. 等人。[ 8] 提出了 MerA-MerB 复合物的断裂和去除阻力机制,并通过核磁共振 (NMR) 方法互连。然而,主要反应机理的细节(即活性部分与汞化合物底物的关系、反应途径等)并未阐明。2009 年,两支加拿大队 [ 9 ] [ 10] 独立提出了 MerB 的晶体结构分析,提出了打破碳-汞键的反应方案。这种耐汞菌株被 Mer 基因组的一系列表达蛋白分离成无机汞,然后释放到细菌细胞壁外,导致随后的汞污染。因此,必须提高汞的收集率,使其保留在细菌细胞内;即,成分滞留在细胞膜内外的状态。定量评估方法也有待开发。ICP 质谱法是一种精确定量汞原子和计算溶液中汞含量的方法,但它无法获得细菌细胞中保留的汞量。在此处,我们检查了基因工程 MerB 表达菌株捕获汞的有效性。辐照反应堆中子用于激活汞原子作为细菌细胞,并应用激活分析来检测细胞中发射的伽马射线。
2。材料和方法
2.1. 酶表达与培养
来自耐汞区域(R831b 质粒)细菌的 MerB 基因是化学合成的(GenScript Co. Ltd.)。由 6xHis 融合的重组 MerB(1-206 个氨基酸残基)是在大肠杆菌(E. coli) BL21B 中用 pET28a 载体(Takara Bio. Co. Ltd.)生产的。为了分离 MerB 酶,可在亲和层析中使用 His 标签 (6xHis)。为防止培养过程中汞和其他物质的吸收,使用了极简大肠杆菌培养基,仅含有磷酸盐、硫酸铵、柠檬酸、甘油和微量金属溶液;(NH 4 ) 2 SO 2 6.86 g/1L,KH 2 PO 4 1.56 g,Na 2 HPO4 5.16 g,C 6 H 17 N 3 O 7柠檬酸铵 0.49 g,MgSO 4 0.3 g,甘油 1 g,CaCl 2 0.5 mg,FeCl 3 0.18 mg,ZnSO 4 0.18 mg,CuSO 4 0.16 mg,MnSO 4 0.15 mg , CoCl 2 0.18 毫克,EDTA 20.1 毫克。接种液体培养基后,从培养基溶液过滤器中取样 1 mL,然后使用 0.22 μm Amicon 过滤器(Milipore Co. Ltd.)分离细菌细胞和溶液,从而在 37˚C 下振荡培养和取样(图1 ).
细菌细胞生长24小时。添加异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 可很好地诱导 MerB 表达,并在 72 小时后进行取样。
图 1。含有 MerB 蛋白/基因的大肠杆菌培养示意图和用于放射性分析的培养基取样。
2.2. 激活分析
将获得的样品吸附在池上的滤膜和溶液上的1cm 2滤纸上。带有样品的纸已干燥。然后,通过研究堆 (KUR) 的 Pn-2 端口进行活化分析。通过以下程序进行中子活化分析以确定每个电池样品中的汞 (Hg) 量。使用气动样品传输系统 (Pn-2) 对细胞样品进行中子辐照 [ 11] 在 KUR 20 分钟,热功率为 5 MW。在中子辐照 12 至 14 天后,使用 Ge 探测器 (CANBERRA GC4020) 测量辐照样品的伽马射线光谱。测量时间从大约 4000 秒到 150,000 秒不等,具体取决于伽马射线的计数率。光峰面积对应于 279 keV 伽马射线,它是在203 Hg ( t 1/2 : 46.6 d) 的 β 衰变之后发射的。该面积由 Covell 方法估计 [ 12 ]。细胞/sup 比率计算为应用衰减校正后细胞和 sup 样品的估计光峰面积之间的比率。
3。结果与讨论
3.1. 中子辐照的活化分析
表 1显示了在激活分析过程中从每个样本中获得的值。
生长 (小时) |
电池/电池 | IPTG |
实时时间/秒 (秒) |
峰面积 (@279keV) |
%错误 | CPS | 误差(绝对值) |
净 CPS (CPS-BG) |
比率 (细胞/总计) |
24 | 细胞 | + | 5836 | 4940 | 1.6 | 8.46E−01 | 1.35E−02 | 8.46E−01 | 0.75 |
24 | 晚饭 | + | 12844 | 3558 | 3.1 | 2.77E−01 | 8.56E−03 | 2.77E−01 | |
24 | 细胞 | − | 4061 | 5033 | 1.6 | 1.24E+00 | 1.99E−02 | 1.24E+00 | 0.87 |
24 | 晚饭 | − | 28391 | 5195 | 2.9 | 1.83E−01 | 5.28E−03 | 1.83E−01 | |
24 | 细胞 | + | 147677 | 5823 | 3.3 | 3.94E−02 | 1.30E−03 | 3.94E−02 | *无汞控制 |
24 | 晚饭 | + | 54795 | 1271 | 9.7 | 2.32E-02 | 2.25E−03 | 2.32E-02 | |
72 | 细胞 | + | 21652 | 2153 | 4.6 | 9.94E−02 | 4.57E−03 | 9.94E−02 | 0.30 |
72 | 晚饭 | + | 30627 | 7160 | 3.2 | 2.34E-01 | 7.48E−03 | 2.34E-02 | |
72 | 细胞 | − | 2741 | 920 | 7.3 | 3.36E−01 | 2.45E−02 | 3.36E−01 | 0.65 |
72 | 晚饭 | − | 14655 | 2646 | 4.1 | 1.81E−01 | 7.40E−03 | 1.81E−01 | |
72 | 晚饭 | − | 12194 | 2180 | 4.6 | 1.79E−01 | 8.22E-03 | 1.79E−01 | |
72 | 细胞 | + | 6000 | 182 | 19.5 | 3.03E−02 | 5.92E−03 | 3.03E−02 | *无汞控制 |
72 | 晚饭 | + | 51367 | 1077 | 10.8 | 2.10E−02 | 2.26E-03 | 2.10E−02 |
表 1。辐射和排放值的统计数据。
表中的比率列(细胞/总计)表示细胞中的汞与细胞和上清液中的汞总量之比。在此计算中,NET CPS(每秒计数)的值通过背景 (BG) 减法进行校正。NET CPS 的变化如图 2所示。
如图 2所示, 即使在考虑测量误差后,与介质中的总汞量(72+ 除外)相比,电池中的汞量也会转移到细菌中。细胞生长的早期阶段(实验的前 24 小时)的特点是将近 80% 的汞转移到细菌中,无论是否添加 IPTG。使用过的细菌细胞含有大肠杆菌菌株,其中掺入了 MerB 表达基因,不存在其他代谢汞的 Mer 基因组。因此,在被吸收和分解后,有机汞保留在 MerB 的酶分子中。将有机汞转化为无机汞或将其释放到溶液中似乎是不可能的。因此,由于酶中汞原子的紧密结合,不会将汞重复释放到溶液中。此外,当过程的第一天和第三天不添加 IPTG 时,汞捕获量更高。即使没有 IPTG 诱导,使用的菌株也会在细胞分裂过程中产生 MerB 蛋白。建议在细菌生长期期间 MerB 的自然增加和强制增加之间的差异可以忽略不计。因此,添加 IPTG 的效果很低。72 小时后,转移到 72 小时样品中细菌细胞的汞量(+ 或 - in 因此,添加 IPTG 的效果很低。72 小时后,转移到 72 小时样品中细菌细胞的汞量(+ 或 - in 因此,添加 IPTG 的效果很低。72 小时后,转移到 72 小时样品中细菌细胞的汞量(+ 或 - in图 2)无论是否存在 IPTG 都会降低。因此,由于从细胞生长开始就将 5 mM 的 CH 3 HgCl 2添加到培养液中,汞本身可能会阻碍细菌细胞的生长。因此,仅针对汞吸收的收集方法比长期细菌更有效
图 2。汞在溶液和电池中的迁移率。标有 (+) 号的行表示添加了 IPTG。标有 (-) 符号的行表示缺少 IPTG。呈现的两组显示了在培养开始时和 72 小时后汞的迁移率。
当生长曲线呈上升趋势时(即细菌生长期)进行生长处理。然而,由于在长期培养中强制产生 MerB,IPTG 诱导的细菌细胞被认为具有更高的汞吸收。
3.2. 酶含有汞
重要的是我们有 MerB 酶捕获汞的证据,即使图 2显示细胞部分的汞迁移率很高。通过该酶与CH 3 HgCl 2的混晶分析还表明,在化合物分解后,汞以汞原子的形式保留在酶分子的活性位点中(图3 )。
通过使用过表达的MerB并与有机汞化合物(CH 3 HgCl 2 )混合来进行结晶。一周内获得晶体,数据收集在日本 SPring-8 完成。图 3显示 MerB 在晶体堆积中形成二聚体,单体包含一个汞原子(在左侧,描绘的红色球体)。这种结构分析是在酶与CH 3 HgCl 2的共结晶下进行的,但是只有Hg原子,没有任何其他与Hg原子周围的甲基相对应的电子密度图(图3右)。这表明 MerB 分解 CH 3 HgC1 2并且将CH 3 -Hg之间的键断开成单独的Hg原子。在细菌培养过程中,过表达的 MerB 可能会以这种方式捕获汞原子。(天然和 Hg 结合形式的坐标将存入蛋白质数据库 (PDB))。
4。结论
在此,将具有有机汞降解酶 (MerB) 基因表达的细菌细胞培养在培养基中。通过激活分析评估汞对这些细菌细胞的吸收。表达 MerB 的菌株显示出显着的吸收。我们还提供了汞捕获的证据
图 3。MerB 二聚体的示意图(左)和分辨率为 1.42 Å 的 96、159Cys 和 99Asp 上的电子密度图(右)。汞原子由红色球体表示。使用 PyMOL Molecular Graphic System 程序(版本 1.2r3pre,Schrodinger,LLC)准备图片。
通过酶的晶体结构分析测定酶与有机汞的化合物。因此,建议采用既不破坏细菌细胞也不需要任何预处理的摄取检测方法和细胞内分析。虽然一些研究,特别是锰捕获 [ 13 ] [ 14 ] 最近取得了成功,但这种细胞内放射性分析是一种简单且无损的评估细菌持有可变金属的技术,而不是在光谱学之前。
在这项研究中,汞原子保留在酶分子中,不会矿化或通过与 MerA 互连而释放到细菌细胞外,因为仅使用表达 MerB 的细菌细胞。因此,等摩尔的收集是可能的,因为一个汞原子与一个酶分子结合。这种酶在 N 末端融合了一个 6xHis 标签,可以用 Ni 凝胶补充。因此,利用亲和柱色谱法,可以随着细菌细胞的生长从汞污染的溶液或土壤溶液中容易地收集汞原子,这有望对土壤改良有效。
致谢
这项工作部分得到了住友基金会 2017 年(YM)和京都大学基金会 2017 年(YM)的资助。我们还根据提案 2016-2018JAXPCG#2-6 感谢 JAXA 的工作人员。同步辐射实验是在 SPring-8 的批准 2017AB6760、2018AB6856 和 2019AB6956 下进行的,并为 BL44XU 工作人员的 X 射线数据收集提供了帮助。
笔记
*通过细胞内辐射测量法捕获和评估有机汞。
利益冲突
作者声明本文的发表不存在利益冲突。
参考
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[ 4 ] Stembal, T.、Markic, M.、Ribicic, N.、Briski, F. 和 Sipos, L. (2005) 从克罗地亚北部的地下水中去除氨、铁和锰 - 试点植物研究。过程生物化学,40, 327-335。
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