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几种细菌分离物对某些环境参数的生长反应

时间:2022-10-04 来源:未知 编辑:梦想论文 阅读:
本研究旨在调查玉米细菌分离株对植物病原体的抗菌活性及其对某些环境参数的生长反应。从 Ado-Ekiti 的 AfeBabalola 大学生物科学系收集的玉米植物中获得了 24 种细菌分离物。对分离物进行生化和生理特征鉴定,鉴定为Kurthiazopfu、Morganellamorganic、Rhodococcusequi、枯草芽孢杆菌、Catabaterhongkongensis、Brevibacteriumotitidis、Lactobacillus coleohominis、Staphylococcus aureus、痤疮丙酸杆菌等。确定了它们对不同 NaCl 浓度、糖、温度以及抗生素的反应。大多数分离物能够承受它们所经历的各种环境参数。此外,八种分离物能够发酵蔗糖。细菌分离物对所测试的抗生素表现出一定程度的抗性。多重耐药菌的流行率很高,显示出对 3-8 种药物的耐药性。确定了细菌分离物对选定真菌的拮抗作用。没有一个分离株显示出对真菌病原体的拮抗潜力。然而,假定的拮抗细菌物种可以通过基因改造产生次生代谢物,从而实现生物防治。
 
关键词
 
玉米 植物,生长 反应,细菌 分离,次生 代谢 物,生防
 
 
一、简介
 
植物病害对世界农业和总体粮食安全构成威胁,其中约 75% 的病害由真菌引起 [ 1 ]。大多数农业和园艺作物都会因病原体的侵袭而造成严重的产量损失 [ 2 ] [ 3 ]。由于 1995 年发生的黑豆荚病,尼日利亚损失了大约 2500 万个 NGN [ 4 ] [ 5 ]。
 
过去,化肥和杀虫剂(包括杀菌剂)等化学物质被用于控制植物病害,从而提高生产力 [ 3 ]。然而,由于这些化学物质对环境和非目标生物的负面影响,人们一直在寻找控制植物病害的替代方法,这些替代方法包括使用微生物等 [ 3 ] [ 6 ]。几十年来,细菌一直被用作生物控制剂[ 7 ]。通常与植物相关的不同细菌及其代谢物已被确定为植物病害生物控制的重要贡献者[ 8] . 它们的作用方式与这些细菌在其静止期产生的抗生素有关。例如,已知假单胞菌的生物防治菌株可合成吩嗪羧酸、吡咯腈和 pyoluterin [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]。此外,已知通常与农业系统相关的芽孢杆菌物种参与生物防治,因为它们能够产生抗生素 [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]。
 
微生物的生长受到各种环境条件的影响,这种影响可能有利于它们的生长,也可能会延缓它们的繁殖速度和不同代谢物的合成[ 17 ]。环境参数,如温度、通气、营养或 pH 值可能成为微生物生存的限制因素。生物防治剂已被证明对不同的环境条件(如温度、pH 和水分含量)敏感,这些因素会影响它们的有效性。因此,目前的研究试图确定玉米相关细菌对某些环境条件的反应以及它们的抗菌特性。
 
2。材料和方法
 
2.1。样品收集
 
从 Ado-Ekiti 的 AfeBabalola 大学微生物学部门收集了 24 种未鉴定的细菌分离物。分离物是从玉米植物的不同部分中分离出来的。Ralstoniasolanacearum 菌株 Ogbomoso、Ralstoniasolanacearum 菌株 Saki、Ralstoniasolanacearum 菌株 Nihort、Fusarium equiseti 菌株 Saki、来自 AfeBabalola 大学 Ado-Ekiti 生物科学系的绿色木霉和 Pseudomonas spp。从伊巴丹获得。还有一种杀菌剂;代森锰锌是从 Ekiti 农场的 AfeBabalola 大学 Ado-Ekiti 收集的。
 
2.2. 细菌分离物的表征
 
根据标准程序 [ 18 ] 进行革兰氏染色后,根据其形态、培养和生化特征鉴定未鉴定的细菌分离物。
 
2.3. 不同温度下分离菌的生长特性
 
进行该测试以确定可以在营养琼脂板上在不同温度(4°C、25°C、37°C​​、50°C)下生长 24 小时的生物。生长的存在表明有机体可以耐受温度 [ 19 ]。
 
2.4. 不同pH下分离菌的生长特性
 
进行该测试以识别可以在不同 pH 值(2、4、6、8、10)下生长的生物。根据制造商的程序制备营养肉汤 (Lab M),并使用二甲胂酸盐和琥珀酸缓冲溶液(商品名)将其 pH 值调节至 2、4、6、8 和 10。将制备的肉汤接种微生物并在 37°C 下培养 24 小时。使用 SP 600 分光光度计(商品名)在 600 nm 波长处通过吸光度确定生长的存在。
 
2.5. 不同NaCl浓度细菌分离株的生长特性
 
进行该测试以识别可以在不同浓度的 NaCl(1%、2% 和 3%)下生长的生物。根据制造商的程序制备营养琼脂并将NaCl添加到培养基中。制备的琼脂接种微生物并在 37°C 下孵育 24 小时。生长的存在表明有机体可以利用盐分并在高盐度下生存[ 19 ]。
 
2.6. 抗生素敏感性试验
 
使用琼脂盘扩散法进行抗菌药敏试验。与 0.5 McFarland 标准相比,新鲜分离物悬浮在蛋白胨肉汤中。使用无菌拭子将每个分离物接种到无菌 Mueller Hinton Agar 平板的表面上,以确保在划线时均匀分布。让板干燥10分钟,并使用无菌镊子将抗生素盘放在琼脂板的表面上。然后将板倒置并在 37°C 下孵育 24 小时。抗菌盘包括革兰氏阴性盘,作为革兰氏阴性菌的阳性对照;Augmentin (30 µg)、氧氟沙星 (5 µg)、庆大霉素 (10 µg)、萘啶酸 (30 µg)、呋喃妥因 (200 µg)、复方新诺明 (25 µg)、阿莫西林 (25 µg) 和四环素 (25 µg)。对于革兰氏阳性菌,红霉素 (5 µg)、庆大霉素 (10 µg)、Augmentin (30 µg)、链霉素 (10 µg)、四环素 (10 µg)、氯霉素 (10 µg)、氯唑西林 (5 µg) 和复方新诺明 ( 25 微克)。然后根据临床和实验室标准研究所测量和记录抑制区[20 ] 。测试一式两份进行,以确保可靠性[ 21 ]。
 
2.7. 不同糖类细菌分离株的生长特性
 
进行该测试以识别可以生长和利用 2 种糖(葡萄糖和蔗糖)的有机体,以确定有机体是否可以发酵糖。根据制造商的程序制备糖溶液,并将 5 ml 分配到具有达勒姆管的试管中。将制备的溶液接种有机体并在 37°C 下孵育 24 - 72 小时。淡黄色表示阳性,阴性未观察到颜色变化,达勒姆管中的气体产生也表示阳性结果。
 
2.8. 细菌分离株对测试真菌和假单胞菌的拮抗作用。
 
将每种细菌分离物划线在已经准备好的 PDA 板上,并将真菌塞放置在距离细菌分离物 23 毫米处,一式两份。然后将板在 25°C 下孵育 1-7 天。仅用真菌接种的培养皿用作对照处理 根据 Kucuk 和 Kivanc [ 22 ] 确定拮抗作用。对于假单胞菌属。形成一条垂直的条纹。
 
2.9。杀菌剂对选定真菌的影响
 
进行该测试是为了鉴定可以在所选杀菌剂存在下生长的生物体。根据制造商的程序制备培养基PDA,并将0.01g、0.02g和0.03g的杀真菌剂添加到培养基中。然后用真菌塞接种中毒培养基,并分别在 25˚C 下孵育(Ogunmefun 等人,2015)。
 
培养基上的生长表明有机体可以在杀真菌剂存在的情况下存活。
 
3. 结果
 
3.1。细菌分离株对不同环境参数的生长反应
 
来自玉米植物的细菌分离物对 NaCl 和温度的生长响应如表 1 所示。在 1% 时观察到最大增长,然后是 2%,在 3% 时出现增长下降。来自玉米植物的细菌分离物对在营养肉汤中生长的不同 pH 值的生长反应如表 2所示。从 pH 2 到 8 的吸光度逐渐增加。还观察到,在 pH 2 时从 Catabaterhongkongensis 1 获得的生长最少,而最高的是红球菌 1。除河弧菌外,在 pH 10 时的吸光度也有所降低。
 
3.2. 细菌分离株对抗生素的敏感性模式
 
革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌敏感性分别见表3和表4。据观察,所有克
 

细菌
分离物
NaCl上的生长 温度 (°C)
1 2 3 4 25 37 50
中华金龟子 1 + + + - + + -
厌氧球菌 + + + + + + -
金黄色葡萄球菌 1 + - - + + + +
银棒杆菌 + + + - + + -
梭状芽孢杆菌 + + + + + + -
异类 + + + + + + +
变形杆菌 + + + + + + +
铜绿假单胞菌 + - - + + + +
Leifsonia 水生的 + + + + + + -
库尔蒂亚佐夫 + + + - + + -
摩根大通 + + + + + + +
马红球菌1 + - - - + + -
枯草芽孢杆菌 + - - + + + +
大熊猫2 + + + + + + +
耳炎短杆菌 + - - + + + +
红球菌 2 + - - + + + -
乳酸杆菌 + + + + + + +
金黄色葡萄球菌 2 + + + + + + +
红球菌 3 + + + + + + -
痤疮丙酸杆菌 + + + + + + -
口腔奈瑟菌 + + + + + + +
三尾链状杆菌 + + + - + + +
嗜肺军团菌 + + + + + + -
河流弧菌 + + + + + + +

表 1。玉米植物细菌分离株对 NaCl 和温度的定性生长响应。
 
键:+ = 正,- = 负。
 
除庆大霉素(31.25%)和链霉素(50%)外,阳性菌对所用抗生素的耐药性超过 50%(表 3)。超过 50% 的革兰氏阴性菌对所测试的抗生素表现出 100% 的耐药性。一般来说。Alistipesindistinctus、Proteus vulgaris 和 Vibrio fluvialis 对所有抗生素均耐药(表 4)。
 
3.3. 细菌分离株对选定真菌的拮抗作用
 
没有一种细菌分离物对真菌有任何拮抗作用。板上的两种生物同时生长,互不干扰。然而,与仅在 PDA 平板上培养相比,在存在杀菌剂的情况下,真菌的菌丝体生长减少。
 

细菌
分离物
酸碱度范围
2 4 6 8 10
中华金龟子 1 0.42 0.58 1.51 1.51 0.70
厌氧球菌 0.67 0.95 1.42 1.47 0.78
金黄色葡萄球菌 1 0.52 0.97 1.37 1.49 0.75
银棒杆菌 0.60 1.48 1.31 1.50 0.70
梭状芽孢杆菌 0.78 0.52 1.45 1.27 0.53
异类 0.62 1.42 1.51 1.50 1.41
变形杆菌 0.67 1.45 1.51 1.51 1.33
铜绿假单胞菌 0.57 0.90 1.29 1.49 0.65
Leifsonia 水生的 0.67 0.54 1.47 1.51 0.47
库尔蒂亚佐夫 0.53 0.54 1.50 1.50 0.54
摩根大通 0.69 1.13 1.51 1.52 0.55
红球菌 1 0.93 0.52 1.36 1.46 0.54
枯草芽孢杆菌 0.57 0.55 1.51 1.33 0.70
大熊猫2 0.57 0.61 1.51 1.50 0.47
耳炎短杆菌 0.55 0.58 1.30 1.50 0.77
马红球菌2 0.58 0.53 1.28 1.00 0.54
乳酸杆菌 0.58 0.64 1.34 1.26 0.48
金黄色葡萄球菌 2 0.58 0.5 6 1.48 1.45 0.98
马红球菌3 0.49 0.54 1.35 1.24 0.63
痤疮丙酸杆菌 0.57 0.73 1.21 1.25 0.86
口腔奈瑟菌 0.71 0.69 1.48 1.50 1.23
三尾链状杆菌 0.53 0.55 1.32 1.48 0.72
嗜肺军团菌 0.52 0.60 1.49 1.52 0.47
河流弧菌 0.72 0.75 1.50 1.51 1.40

表 2。玉米植物细菌分离株对营养肉汤中不同 pH 值的比较生长响应。
 
4。讨论
 
细菌多样性在人类生存中特别重要,因为它们构成了地球上的大多数物种。它也被认为是最有用的资源之一,在生物修复和生物勘探中具有重要意义[ 23 ]。
 
在这项研究中,考虑了不同的参数,例如对不同 pH 值、温度和 NaCl 的响应。环境因素可能会影响植物病原体、生物防治剂及其相互作用机制 [ 24 ]。发现所有 24 种细菌都是中温菌,因为它们在最高温度 37°C 下生长。13 个分离株在 50˚C 下生长,表明它们是嗜热菌。Javed 等人也进行了类似的观察。[ 25 ]。芽孢杆菌属 已被证明可以在包括温泉在内的恶劣环境中生活和生存[ 26 ] [ 27 ]。
 

有机体 复方新诺明 (25 µg) 氯唑西林 (5 µg) 红霉素 (5 µg) 庆大霉素 (10 µg) 奥格门汀 (30 µg) 链霉素 (10 µg) 四环素 (10 µg) 氯霉素 (10 µg)
中华金龟子 1 21(S) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
厌氧球菌 15(一) 0 (右) 0 (右) 20 (S) 0 (右) 20 (S) 13(右) 16 (S)
金黄色葡萄球菌 1 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
银棒杆菌 46 (S) 23 (S) 19 (S) 13(一) 16 (S) 20 (S) 23 (S) 14(一)
Leifsonia 水生的 0 (右) 0 (右) 0 (右) 19 (S) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
库尔蒂亚佐夫 0 (右) 0 (右) 0 (右) 19 (S) 0 (右) 18 (S) 0 (右) 15(一)
马红球菌 1 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
枯草芽孢杆菌 41 (S) 0 (右) 11(右) 29 (S) 0 (右) 19 (S) 0 (右) 0 (右)
香港大杆菌 2 46 (S) 0 (右) 0 (右) 20 (S) 0 (右) 16 (S) 15(一) 0 (右)
耳炎短杆菌 0 (右) 0 (右) 0 (右) 22 (S) 0 (右) 14(一) 0 (右) 33 (S)
红球菌 2 0 (右) 0 (右) 0 (右) 18 (S) 0 (右) 21 (S) 0 (右) 29 (S)
乳酸杆菌 26 (S) 0 (右) 18 (S) 30 (S) 0 (右) 26 (S) 18 (S) 20 (S)
金黄色葡萄球菌 2 20 (S) 0 (右) 0 (右) 24 (S) 0 (右) 11(右) 14(一) 18 (S)
红球菌 3 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
痤疮丙酸杆菌 16 (S) 18 (S) 25 (S) 28 (S) 32 (S) 15(一) 18 (S) 13(一)
三尾链杆菌 0 (右) 0 (右) 0 (右) 23 (S) 0 (右) 22 (S) 0 (右) 33 (S)
敏感性 (%) 43.75 12.57 18.75 68.75 12.50 50 18.75 37.5
反抗 (%) 56.25 87.43 81.25 31.25 87.50 50 81.25 62.5

表 3。选定的革兰氏阳性菌对抗生素的抗生素敏感性模式。
 
关键:I——中等,S——易感,R——抗性。
 
所有分离物在 pH 2、4、6、7、8 下生长,而 17 个分离物在 pH 10 生长,这与 Javed 等人的工作相反。[ 25 ]。还观察到,所有 24 种生物都在 1% NaCl 浓度下生长,而只有 18 种生物在 2% NaCl 浓度下生长,17 种生物在 3% NaCl 浓度下生长。在 2% 和 3% 的浓度下生长减少,因为它们对光敏感,不能耐受高盐度。贾拉等人。[ 28 ] 报道内生细菌可以耐受高达 4% 的 NaCl 浓度。
 
所有分离株都对商业抗生素表现出不同程度的耐药性。尽管 C. equi 1 和 3 是从不同来源获得的,但它们都对抗生素具有抗药性。在本研究中研究的革兰氏阴性菌中观察到最高程度的耐药性。Osibote 等人也进行了类似的观察。[ 29 ]。伊罗哈等人。[ 30 ] 认为,微生物中的抗生素耐药性问题可能是由于特定物种对某些抗生素的天然耐药性、抗生素耐药性在物种间的转移以及使用亚治疗剂量的抗生素所致。
 

细菌
分离物
奥格门汀 (30 µg) 氧氟沙星 (5 µg) 庆大霉素 (10 µg) 萘啶酸 (30 µg) 呋喃妥因 (300 µg) 复方新诺明 (25 µg) 阿莫西林 (25 µg) 四环素 (25 µg)
梭状芽孢杆菌 0 (右) 23 (S) 0 (右) 28 (S) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
刺梨 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
变形杆菌 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
铜绿假单胞菌 0 (右) 31(S) 0 (右) 25 (S) 15(一) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
摩根大通 0 (右) 14(一) 0 (右) 16 (S) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
口腔奈瑟菌 0 (右) 16 (S) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
嗜肺军团菌 0 (右) 22 (S) 0 (右) 16 (S) 11(右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
河流弧菌 0 (右) 15(一) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右) 0 (右)
敏感性 (%) 0 37.5 0 50 0 0 0 0
反抗 (%) 100 62.5 100 50 100 100 100 100

表 4。选定的革兰氏阴性菌对抗生素的抗生素敏感性模式。
 
关键:I——中等,S——易感,R——抗性。
 
微生物的鉴定和表征,可用作生物防治剂或生物活性化合物的生产者,对现代和生态相容的农业具有重要意义 [ 31 ]。抗生素通常与竞争和/或寄生协同作用 [ 20 ]。这项调查的结果表明,在 25°C 在 PDA 上测试的真菌测试病原体中,没有一种细菌对真菌测试病原体具有拮抗作用。
 
五、结论与建议
 
尽管本研究中使用的细菌分离株均未表现出对分离的真菌病原体的拮抗作用,但可以对分离株进行基因改造以产生可用于生物防治的次生代谢物。此外,由于一些分离株是嗜热的,因此需要进一步的工作来测试它们在高温下对真菌病原体的拮抗特性。
 
利益冲突
 
作者宣称没有利益冲突。
 
参考
 
[ 1 ] Kutama, AS (2012) 尼日利亚苏丹大草原地区高粱头和黑穗病的流行病学和控制研究。植物学博士论文(未发表),1-4。
[ 2 ] Fagwalawa, LD, Kutama, AS 和 Yakasai, MT (2013) 植物病害控制的当前问题:生物技术和植物病害。Bayero 纯粹与应用科学杂志,6, 121-126。
[ 3 ] Kumar, S. (2014) 印度的植物病害管理。进步和挑战。非洲农业研究杂志,9,1207-1217。
[ 4 ] Kutama, AS、Emechebe, AM 和 Aliyu, BS (2011) 评估种子处理杀菌剂在控制尼日利亚苏丹大草原地区由 Sporisoriumreilianum 引起的高粱头黑穗病的效果。植物病理学与植物健康杂志,1, 93-98。
[ 5 ] Kutama, AS, Emechebe, AM 和 Aliyu, BS (2011) 一些接种技术对尼日利亚苏丹大草原高粱黑穗病 (Sporisoriumreilianum) 发病率和严重性的现场评估。热带生物与环境科学杂志,8, 292-296。
[ 6 ] Mark, GL, Morrisey, JP, Higgini, P. 和 O'Gara, F. (2006) 基于分子的策略来利用环境生物技术应用的假单胞菌生物控制菌株。FEMS 微生物学生态学, 56, 167-177。
[ 7 ] Landa, BB, Navas-Cortes, JA 和 Jimenez-Diaz, R. (2004) 温度对与抑制鹰嘴豆枯萎病的生物防治潜力相关的植物-根际细菌相互作用的影响。植物病理学,53,341-352。
[ 8 ] Gnanimanicakam, S. (Ed.) (2007) 植物相关细菌。斯普林格,纽约。
[ 9 ] Chin-A-Woeng, TFC, Thomas-Oates, JE, Lugtenberg, BJJ 和 Bloemberg, GV (2001) 引入绿刺假单胞菌 PCL1391 的 phzH 基因扩展了产生吩嗪-1-羧酸的假单胞菌属的生物防治能力范围. 菌株。分子植物-微生物相互作用,14, 1006-1015。
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