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乙酰胆碱酯酶 (AChE) 是负责乙酰胆碱裂解的重要酶。对该酶活性的研究使用人工底物乙酰硫代胆碱，因为其催化产物硫胆碱在与 Elman 试剂 5,5'-二硫双-(2-硝基苯甲酸 (DTNB) 反应时很容易产生光吸收产物。乙酰胆碱的水解不能用这种方法测定。等温滴定量热法可以测定两种底物的水解，除了酶和底物外不需要其他试剂。比较乙酰胆碱 (ACh) 和乙酰硫代胆碱水解中获得的动力学值(ATCh)，以西维因作为抑制剂，使用量热技术评估这两个反应的动力学特性。该方法可以通过催化过程中发生的热交换显示两种底物的水解。此外，它还允许评估西维因（一种常见的杀虫剂）对 AChE 的抑制作用。结果显示两种底物获得的值相似，乙酰胆碱（酶的天然底物）的值略高。来自 ATCh 和 ACh 的酶参数值彼此相似，使用西维因的抑制常数也相似，表明使用 ATCh 处理 ACh 的任何方法都是可行的。从 ITC 获得的结果显示了量热法所达到的精度。结果显示两种底物获得的值相似，乙酰胆碱（酶的天然底物）的值略高。来自 ATCh 和 ACh 的酶参数值彼此相似，使用西维因的抑制常数也相似，表明使用 ATCh 处理 ACh 的任何方法都是可行的。从 ITC 获得的结果显示了量热法所达到的精度。结果显示两种底物获得的值相似，乙酰胆碱（酶的天然底物）的值略高。来自 ATCh 和 ACh 的酶参数值彼此相似，使用西维因的抑制常数也相似，表明使用 ATCh 处理 ACh 的任何方法都是可行的。从 ITC 获得的结果显示了量热法所达到的精度。

 

关键词

 

乙酰胆碱酯酶,乙酰胆碱,乙酰硫胆碱,等温滴定量热法,西维因

 

一、简介

 

乙酰胆碱酯酶 (AChE) (3.1.1.7) 是科学文献中研究得最好的酶之一，部分原因在于它在神经传递过程中的生理作用，以及 AChE 显示出的非常高的效率，它具有很大的转换数 [ 1 ] [ 2 ]。AChE 负责在脊椎动物和无脊椎动物的神经肌肉接头和中枢神经系统的突触间隙中裂解乙酰胆碱 (ACh) [ 3 ] [ 4 ]。它在进化过程中高度保守。由于它在昆虫中的重要性，它是许多用作杀虫剂的物质的目标 [ 5] 。AChE 抑制剂具有制药和商业上的重要性，副作用应该是一个需要考虑的重要问题 [ 6 ]。

 

西维因是一种氨基甲酸酯类有机化合物，是 AChE 的经典非竞争性抑制剂，广泛用作杀虫剂 [ 7 ]。这类农药的急性中毒主要影响农业工人，造成短期和长期的健康损害 [ 8 ]。临床状况包括统称为胆碱能综合征的症状，其中包括流涎、腹泻、支气管分泌过多，在严重的情况下，还会出现精神障碍甚至死亡 [ 8 ] [ 9 ]。

 

可通过测定 AChE 活性来确认西维因中毒。光谱分析包括确定 AChE 活性参数的标准方法。它们广泛用于世界各地的实验室。Ellman 方法 [ 10 ] 是使用人工底物乙酰硫胆碱 (ATCh) [ 11 ]间接获得 AChE 动力学值的常用方法。对于几种酶，AChE的产物和底物不适合用UV-VIS吸光度或荧光直接评价，因此，只要反应过程不能用分光光度技术观察，ACh的裂解就可以了。另一方面，通过等温滴定量热法 (ITC) 进行的量热测定虽然不容易执行，但返回值相当准确 [ 12] 。ITC 的优点是只使用酶和底物，不需要任何额外的化合物来产生可测量的信号，并且可以分析 AChE 的天然底物反应 [13 ]。

 

ITC 测量物理化学过程中的热交换，通常用于结合分析；然而，该技术还可以测定酶动力学 [ 14 ]。当测定池中发生反应时，池内的系统会释放或吸收热量。这会导致由维持电池内部温度的电子设备提供的功率下降（放热反应）或增加（吸热反应）。这会生成一个热分析图，显示设备 [ 12 ]施加的热流 (μcal/s) 。

 

当将初始反应速率 (v 0 ) 与初始底物浓度进行比较时，对于所研究的大多数酶，都会出现矩形夸张；这些被称为 Michaelis-Menten (MM) 酶 [ 15 ]。在文献中，广泛使用线性方法来评估 MM 酶的动力学。然而，这种线性化缺乏精确性，即主要是因为在低底物浓度下获得的结果极大地影响了拟合参数 [ 16 ]。

 

本研究通过 ITC 评估了 AChE 的动力学，从而可以将其活性与天然 (ACh) 和人工 (ATCh) 底物进行比较。为了获得更好的精度，使用 Michaelis-Menten 方程的积分形式来确定实验动力学值。此外，还评估了众所周知的抑制剂杀虫剂西维因的作用，并与传统方法进行了比较 [ 5 ]。

 

2.实验

 

2.1. 材料

 

从电鱼 (Electrophorus electricus) 中提取的乙酰胆碱酯酶 AChE (EC. 3.1.1.7)，冻干，获自 Sigma-Aldrich®。使用的底物是乙酰胆碱氯化物 (A6625) 和乙酰硫代胆碱氯化物 (A5626)，均获自 Sigma-Aldrich®。

 

2.2. 酵素

 

酶原液的浓度在 280 nm 处通过分光光度法测定，使用= 125.730 M −1 ∙cm −1，结果通过使用 Ellman 方法 [ 10 ] 的比色法证实，为 3.0 mM (± 0.50)。使用浓度 30.0 pM，对于所有实验都是相同的，并且是通过从该储备液中稀释获得的。通过添加 NaCl 0.05 M 和 MgCl 2 0.01 M，在离子强度为 0.148 M 的 Tris-HCl 缓冲液 0.05 M 中进行所有测定。含有酶的缓冲液还含有 0.1 mg/L 的超纯牛血清白蛋白 (Sigma-Aldrich) . 除非另有说明，否则实验是在 pH 7.4 和 37˚C (310.15 K) 下进行的。

 

2.3. 底物和抑制剂

 

底物 ACh 和 ATCh 以 0.1 M 的浓度制备和储存，并稀释用于 0.05 M、pH 7.4、37˚C、MgCl 10 mM 和 NaCl 100 mM 的 Tris-HCl 缓冲液中。西维因分析标准品（Brand Sevin® 99.6%）以 10 M 的浓度储存在 12.38 M 甲醇的去离子水中。每个样品中甲醇的最终浓度为 0.1 mM，将相同浓度添加到对照溶液中。

 

2.4. 国际贸易委员会化验

 

在等温滴定微量热仪 VP-ITC (MicroCal® GE) 中进行测定。作者和实验室团队使用 GE 提供的设备手册中描述的程序对设备进行定期校准。默认值在文献 [ 17 ] 中有描述。通过在存在 AChE 的情况下将底物（4.0 mM ATCh 和 10 mM ACh）连续 15 次注射 8.0 μL 到样品池中来测量焓，注射之间的间隔为 120 秒。在 310.15 K 的温度下，将反应缓冲在 Tris-HCl 缓冲液 0.05 M、NaCl 0.05 M 和 MgCl 2 0.01 M (pH 7.4) 中。对照实验在不存在 AChE 的情况下进行。

 

2.5. ITC 酶法检测

 

实验溶液用真空泵（ThermoVac，MicroCal®）脱气，并在实验运行前让其达到热平衡 5 分钟。加热参考为 30 μcal/s，搅拌速度为 215 rpm。为了分析底物水解，依次注射 1、2、4、6 和 8 μl，最后一次注射直到测定结束，它们之间的间隔为 120 秒，10 mM ACh。对于 ATCh 测定，使用了相同的方案。

 

Todd 和 Gómez 在 2011 年 [ 18 ] 开发了一种直接测量产品形成速率的方法，从 dq/dt，单位时间的热流，它与 ITC 设备提供给所分析系统的功率变化成正比，如下所示在等式 (1) 中：

 

(1)

 

其中 [P] 是一定体积 (V) 内生成的产物的摩尔浓度。温度控制器提供的功率变化将温度保持在所需值 (310.15 K)。通过重新排列方程 (1)，可以确定反应速率，知道 VP-ITC 提供的功率变化，因为酶产生的热速率 (dq/dt) 等于仪器热功率的变化除以反应焓 (∆ r H˚') 和体积 [ 18 ] 。因此，在等式（2）中：

 

(2)

 

焓的变化可以从功率曲线确定的面积得到，直到它返回基线，在消耗整个底物（S Total）后，它等于总反应热 [ 18 ] ，如等式所示(3):

 

(3)

 

在这些步骤之后，速率和底物浓度的值可用于通过应用于米氏方程 (4) 来确定动力学参数、k cat、一级速率常数和 K m、米氏常数。也可以通过 Eyring 方程 (5) 确定激活的热力学参数：

 

(4)

 

(5)

 

其中 k B是玻尔兹曼常数 (1.3805 × 10 −23 J/K)，h 是普朗克常数 (6.6256 × 10 −34 J/s)，Δ ‡ H 和 Δ ‡ S 是活化的焓和熵，T 是温度和 R 气体常数 (8.3145 J/K mol) [ 19 ] 。

 

2.6. 综合米氏

 

由于其公式化，可以将 Michaelis-Menten 写成通过对方程 [ 20 ] 积分获得的线性和对数函数的叠加。在酶动力学方法中，重要的是观察从开始到反应结束的整个时间内底物和产物的浓度。综合 MM 方程是一种更适合酶促反应的方法，因为通常的动力学反应表示为依赖于时间的产物或底物浓度 [ 21 ]。集成 Michaelis-Menten 的主要优点包括不需要微分数据来获得初始速度，以及能够高精度地确定这些初始速度 [ 22 ]。

 

尽管如此，该函数是隐式的，具有多个变量，可以借助基本软件程序 [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] 通过数值方法求解，在等式（6）中：

 

(6)

 

其中，t 是观察时间，S 0是初始底物浓度，P t是直到时间 t 由一定浓度的酶 [酶] 形成的总产物。对于与竞争性抑制剂的反应，抑制常数 K i可以通过等式（7）计算已知抑制剂浓度 I 和周转数 k cat ：

 

(7)

 

2.7. 分析

 

使用 Origin 9.0 分析量热数据，并使用 Origin 9.0、GraphPad Prism 6.01 或 Microsoft Office Excel 2013 生成图表。

 

实验一式三份进行。对于每个结果，使用了统计加权分析，其中考虑了与每个变量相关的误差。使用赤池信息标准 (AIC) 的 F 检验来验证回归之间的相似性。正态性使用 Shapiro-Wilk 检验进行测试，假定 P 值始终优于 0.05，并且使用学生 t 检验评估两组。线性回归为每个分析调整了权重 1/y 2 。数据表示为平均值 (±SEM)。

 

3. 结果

 

3.1. 电离焓

 

电离焓 Δ i H˚ 的值是从文献 [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] 中获得的。因此，反应的表观焓 Δ r H˚' 是给定摩尔数的反应焓和电离焓的总和。结果，使用了Δ i H˚ = ?12.00 (±0.66) kJ/mol 的值。

 

AChE 对 ACh 的水解给出 Δr H˚ = ?29.76 (±2.19) kJ/mol（图 1 (a)）。同样，ATCh 的水解显示 Δ r H˚ = ?24.81 (±1.70) kJ/mol（图 1 (b)）的值，与 ACh 观察到的值相比略低。

 

3.2. 活化能

 

使用 Eyring 方程的线性分析 1/y 2作为权重调整，以减少误差的平方和，因为 y 轴 ln(k cat /T) 进行

 

 

 

图 1。从 ITC 获得的两种底物的焓能。在 (a) 中有 ACh 的等温曲线。在同一实验中的两种不同注射方案中，使用 4 mM ACh 获得标准焓。允许系统在 37˚C 达到热平衡。平衡期 120 秒后，每 10 分钟连续注射 8 μl 40.0 mM ACh。通过等式 (3) 计算焓，并从数据中减去对应于稀释热的基线，并校正为 AChE 浓度 30.0 pM。在 (b) 中，协议中 ATCh 10.0 mM 的等温曲线仅通过注射器进行 8 μL 注射，并在含有 30.0 pM AChE 和缓冲液的细胞中进行滴定。

 

大多数实验误差大于 x 轴，1/T。表 1中可以观察到不同温度下的量热测定结果​​，特别是两种底物所表现出的 Δ ‡ G˚ 值的显着相似性。

 

实验在不同温度下进行；因此，可以评估 k cat值随温度升高而增加。学生 t 检验显示两种底物的 Δ ‡ G˚ (p = 0.85) 的结果相似，因为它们具有结构相似性。尽管如此，Δ ‡ H˚ 和 TΔ ‡ S˚的值彼此明显不同，显示乙酰胆碱（图 2 (a)）与乙酰硫代胆碱（图 2 (b)）不同的驱动反应。

 

3.3. 动力学参数

 

同步非线性回归分析 (SNLR) 使用针对 MM 方程调整的数据的同步分析，抑制动力学参数的结果见图 3，它显示了k cat和 K m值获得的结果。k cat可以定义为每单位时间酶转化的分子数，或一级常数，否则，K m是正反反应常数之间的比率 [ 19 ] [ 27 ] 。酶学分析通常从“催化效率”的角度进行检查，其中比率 k cat /K m被视为酶的相对处理能力的有用指标 [ 28 ]。在存在不同浓度的西维因（一种经典的竞争性抑制剂）的情况下，可以计算出 K i [ 29 ] 的值。K i可被认为是减少反应所需的抑制剂量；该值越小，抑制剂越有效 [ 30 ] 。ACh 和 ATCh 的结果显示在图 3的图表中。猫_当使用 Akaike 的信息标准 (AIC) 进行 F 检验时，两种分析的值在统计上是相等的，其中 ACh 在所有实验中均等的概率 > 88.21%，而对于 ATCh，它们均等的概率 > 61.77%。

 

 

 

 

图 2。在不同温度下获得的催化常数的 Eyring 线性分析。ACh 在五个温度下进行分析，ATCh 在四个温度下进行分析，并调整为 Eyring 方程，方程 (5)，其中可以获得激活的热力学参数 Δ‡ H 和Δ ‡ S。图 (A) 表示线性回归对于 ACh 并具有相关系数，r = −0.9926。在 (B) 中是 ATCh 的设置，其中 r = ?0.9747。

 

3.4. 通过综合 Michaelis-Menten 方程的动力学参数

 

Michaelis-Menten方程的综合形式直接通过每次注射后的初始底物浓度同时分析每次形成的各种浓度的产物。这是一种迭代非线性分析方法，通过最小二乘法拟合，返回k cat和K m值。为此，在一个简单的程序（例如 Microsoft Office Excel®）中创建一个表格，以便 t、S 0、P t和 [Enzyme] 的所有值在列中并排对齐 [ 23 ] [ 31 ]。使用求解器工具，在程序中，您可以使用等式 (6) 和 (7) 执行分析。结果见表2。

 

4。讨论

 

根据获得的数据，两组的Δ ‡ G˚ ACh 和 ATCH的值非常相似 (p = 0.8426)，这是合理的，因为两者具有结构相似性，因此需要类似的化学步骤才能达到过渡态。然而，ATCh 中的氧被硫取代反映了一种底物对另一种底物的焓因子激活的差异 (p = 0.0001)，其中 ACh 的 Δ ‡ H˚几乎是 ATCh 观察到的两倍。这可能是由于酶对原始底物的过渡态比对修饰的底物具有更大的特异性。虽然激活熵的值，Δ ‡S˚, 在这两种情况下都增加，对这种变化的评论必须小心，即使在一般的碱催化中，如酶脱酰作用中发生的那样。该反应具有一个具有很大空间自由度的过渡状态，尽管活化状态下熵的变化不仅取决于反应的内在因素，还取决于反应发生的环境 [32 ]。

 

 

 

图 3. 底物 ACh 和 ATCh 的 MM 方程 (4) 的非线性回归分析。除了 ITC 图之外，存在和不存在抑制剂时 310.15 K 的动力学图。在 (a) 用于 ACh 的 MM 方程的 SNLR，(b) 用于 ACh 的 ITC 测定，(c) 用于 ATCh 的 MM 方程的 SLNR，和 (d) 用于 ATCh 的 ITC 测定。抑制剂浓度为μmol/L。量热测定通过连续注射间隔 150 秒进行，包含 1、2、4、6 和 8 μl 的增加体积，直到完成，20 mM ACh 或 ATCh，在设备在 37˚C 达到热平衡后。热功率的变化是从基线偏移中获取的，使用等式 (2) 转换为速率。该速率进一步用于通过 MM 方程、方程 4 获得动力学值。同时进行了 SNLR 分析，得到 Ki值，以及 K m和 k cat。

 

。使用积分 Michaelis-Menten 方程进行数学分析的结果。

 

Cabib 和 Wilson (1956) [ 33 ]工作中标准焓变的活化值介于 140 - 190 kJ/mol 之间，但是，他们确定活化能随温度变化。如图所示，活化熵很高，这表明处于过渡态的酶和底物之间存在很大的混乱，这可能是 AChE 用来提高反应速率的步骤 [33 ]。然而，熵因素也很重要，乍一看，这会让人产生反应无精打采的想法，但事实并非如此。

 

在所有分析中，与 ACh 相比，使用 ATCh 的酶速度值较低。这可能是由于酶与其天然底物的过渡态比合成底物具有更多相互作用的事实而发生的。如前所述，酶的催化效率由 k cat /K m给出，该值的二阶常数 k 1假定反应的限制步骤是否为底物和酶之间的碰撞频率。这只能在 k cat值足够大而不被视为限制步骤时假设，并且在 [S] 非常小的情况下给出的方法，二阶常数 k -1，对于酶-底物复合物，游离酶和底物的解离可以忽略不计。

 

综合 MM 的值类似于通过非线性回归分析对两种底物获得的值。然而，由于在每个综合 MM 分析中只评估了一条曲线，因此无法考虑实验波动观察到的偏差。

 

分析所有结果，可以验证在没有抑制剂的情况下两种底物的K m值之间的相似性，这是由于酶对底物的亲和力相似。由于 K m是酶-底物复合物形成比与底物催化生成产物的表观比值，低 K m值意味着需要较低浓度的底物才能实现最大动力学速率。相似的 K m值显式相似的亲和力，但这种解释只解决了部分问题 [ 34 ]。

 

获得的 K i值表明西维因的抑制常数很低，而且两种底物的抑制常数相似。这可能反映了西维因作为抑制剂，进入酶的活性位点，与酶阴离子位点的芳香族氨基酸相互作用，阻断底物进入酶的峡谷[4 ]。考虑到作为减慢反应所需的抑制剂的量；该值越低，抑制剂越有效。因此，由于 AChE 对 ACh 的特异性很大，需要更高的抑制剂浓度来从活性位点置换 ACh，但对于 ATCh 则相反，较低浓度的抑制剂已经能够将西维因从 AChE 活性位点带出，当与乙酰胆碱相比。

 

值得注意的是，普通非线性回归的值与通过对两种底物使用集成 MM 分析获得的值非常相似。在最近的酶学领域中，存在经典 Michaelis-Menten 方程的积分形式，其中可以通过作为时间函数形成的产物浓度直接获得催化常数的解 [21 ]。然而，通过方程的直接积分找到的方法是隐含的，其中获得它的数学过程更加耗费精力。这项工作中使用的方法在其他地方得到支持 [ 23]，其中在接近零的时间内形成的产物浓度是根据时间测量的，无需使用微分来确定速度。在这种方法中，信息等于提供更经典测试所需的信息，但在一次分析中可以确定催化常数和改变抑制剂浓度，还有抑制常数。

 

5.结论

 

尽管在两种底物结构中观察到差异，但由于它们与酶的不同相互作用，常数值略有变化。这也在不同的 K i中得到证明值，虽然非常接近，但 ACh 的值更高，表明需要更多的抑制剂来移动酶活性位点的天然底物。另一种可以节省时间并返回更精确值的分析是 Michaelis-Menten 的积分形式，尽管在这项工作中使用了隐式形式，需要更强大的计算。通过该分析获得的值与通过方程的开放显式形式的经典分析获得的值相当。因此，ITC 的稳健性启发了反应的酶动力学和热力学参数值，甚至更好地使用更精确的数学方法。虽然传统的分光光度法更可行，但这项工作显示 ACh 和 ATCh 之间具有可比性的动力学值，虽然不完全相同，

 

致谢

 

这项研究得到巴西卫生部 (n. 17217.9850001/12-025) 的支持。作者在身后感谢 Marcelo M. Santoro 教授在这项工作中提供的不可估量的帮助。

 

利益冲突

 

作者宣称没有利益冲突。

 

参考

 

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[ 4 ] Dvir, H.、Silman, I.、Harel, M.、Rosenberry, TL 和 Sussman, JL (2010) 乙酰胆碱酯酶：从 3D 结构到功能。化学-生物相互作用，187，10-22。

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