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目前工作的目的是分离芽孢杆菌属。具有高脂肪酶活性；使用生化和分子方法来表征分离物；使用芽孢杆菌分离物生产脂肪酶，并研究所产生的脂肪酶的生化和生物物理特性。六十五芽孢杆菌从土壤中分离出 20 个分离株来自瓜尔豆田土壤 (G)，15 个分离株来自 Abusabein 田间土壤 (B)，15 个分离株来自太阳花田土壤 (S) 和 15 个分离株来自石油污水 (O)。筛选产生脂肪酶的分离物；使用显色板的方法。定量测定酶活性。以含有金属盐、Tween-20 和橄榄油的生产培养基为底物，在深层发酵 (SMF) 条件下生产脂肪酶，在 24、48、72 和 96 小时的不同时间，确定了脂肪酶活性的最适 pH、温度和动力学以及。分离物显示出最高的脂肪酶活性，被鉴定为芽孢杆菌。在三个分离株 G14、O1和B10酶活性最高，稳定性最好。分离株 G14、O1 和 B10 的脂肪酶活性最高，分别为 63.4、41.2 和 28.3 U/ml。结果表明，分离株 G14、O1 和 B10 的脂肪酶活性最适 pH 为 8.0、6.0 和 6.0，最适温度为 40、60 和 75。° C，分别。发现分离株 O1 和 B10 的脂肪酶在 90 ˚C 孵育 120 分钟后更耐热Vmax和 Km值分别为17.6、135和 24.4 μmole ∙ min −分别为1和 1.3、1.6 和 0.681 mM。根据这些结果，芽孢杆菌属。具有高脂肪酶活性和热稳定性，可用于促进苏丹的食品、医药、造纸、洗涤剂、农化工业和污染控制。

 

关键词

 

芽孢杆菌,脂肪酶,生化特性,石油 污水

 

一、简介

 

脂肪酶在自然界中广泛存在，细菌脂肪酶、真菌脂肪酶和霉菌脂肪酶等微生物脂肪酶因其生产成本低、稳定性和可用性高于动植物脂肪酶而受到青睐。主要由真菌、霉菌或细菌产生的脂肪酶；大多数脂肪酶是在细胞外形成的 [ 1 ]。基于总销量，脂肪酶被认为是继蛋白酶和淀粉酶之后的第三大酶类。由于其广泛的应用范围，脂肪酶生产是一项价值十亿美元的业务 [ 2 ]。芽孢杆菌脂肪酶因其生物技术潜力而备受关注，这导致枯草芽孢杆菌的几种脂肪分解酶的分离以及芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属的其他物种[ 3 ]。脂肪酶的许多应用包括特种有机合成、脂肪和油的水解、脂肪改性、食品加工中的风味增强、外消旋混合物的拆分和化学分析 [ 4 ]。

 

脂肪酶（甘油酯水解酶 EC 3.1.1.3）是需求量很大的酶，在工业中具有重要的商业应用。脂肪酶刺激甘油三酯水解成甘油和游离脂肪酸。真正的脂肪酶会分解甘油的乳化酯和长链脂肪酸，例如三醇和三棕榈酸甘油酯 [ 5 ]。脂肪酶广泛应用于油脂加工、洗涤剂和乳制品加工、精细化学品和药物的合成、造纸工业和化妆品的生产[ 6 ]。在工业废料、植物油加工厂、奶牛场、被油污染的土壤等不同生境中发现了产生脂肪酶的微生物 [ 7 ]]. 微生物脂肪酶通过创新技术将石油废水解毒和降解为一体 [ 8 ]。目前的工作旨在筛选芽孢杆菌属。使用酚红平板琼脂测定法生产脂肪酶，使用生化和分子方法（RAPD 分析）鉴定分离物，并表征脂肪酶的生化特性。

 

2。材料和方法

 

2.1. 采样

 

50 个土壤样品采集自沙巴特的喀土穆大学农场（根际深度 10 厘米的瓜尔豆、阿布萨因和向日葵田），土壤呈碱性；pH 8.5，呈咸粘土。此外，从工业区 Omdurman 的流出油中采集了 15 个样品。每个样品都放入经过消毒的塑料包装中并转移到实验室，并在室温下保存。

 

2.2. 芽孢杆菌分离物的分离

 

芽孢杆菌的分离按照[ 9 ]进行。从每个样品中取出 10 g 并溶解在 90 ml 蒸馏水中。土壤悬浮液在 80˚C 下加热 15 分钟。制备了土壤和流出油的五种稀释液（10 -1、10 -2、10 -3、10 -4和10 -5）。并且用0.1ml的加热稀释液（10 -3、10 -4、10 -5）接种（通过铺板法）每个样品的6个营养琼脂平板，并在37℃有氧培养24小时。然后纯化菌落并为进一步的工作做好准备。

 

2.3. 芽孢杆菌分离物的常规鉴定

 

根据 [ 10 ] [ 11 ]进行了每个芽孢杆菌分离株的纯培养物鉴定。

 

2.4. 细菌分离物的分子特征

 

分子RAPD技术

 

使用 [ 12 ]描述的基于 CTAB 的方案从芽孢杆菌分离株中提取 DNA 。根据 [ 13 ]，使用 RAPD-PCR 技术在分子水平上对分离物进行分类。由三个 Primer，(1) OPL3 (5-CCA GCA GCT T-3)，Primer (2) OPL8 (5-AGC AGG TGG A-3)，和 Primer (3) OPQ1 (5-GGG ACG ATG G-3 ).

 

2.5. 酚红橄榄油平板琼脂筛选脂肪酶活性

 

筛选了典型的芽孢杆菌分离株以产生脂肪酶。使用显色板测定，其制备如下[ 14 ]。使用酚红 (0.1%) 以及 1% 脂质底物橄榄油、10 mM CaCl 2和 2% 琼脂，使用 0.1 N NaOH 将 pH 值调整至 7.3 - 7.4。然后，将平板与来自不同分离物的年轻培养物孵育 24 小时，然后在 37˚C 下孵育 7 天。之后应检查板的颜色是否从粉红色变为黄色。

 

2.6. 脂肪酶生产

 

该酶是从纯化的分离物中产生的，这些分离物在橄榄油/酚红平板试验中显示出阳性反应。被测菌株在 100 ml 锥形瓶中于 37°C 下培养，其中含有 50 ml，生产培养基的肉汤含有蛋白胨 0.2%、NH 4 H 2 PO 4 0.1%、NaCl 0.25%、MgSO 4 ∙7H 2 O 0.04% , CaCl 2 ∙2H 2 O 0.04%, 橄榄油 2 ml 和 Tween-20 2 至 3 滴。在每个烧瓶中接种一个充满细菌培养物的环，并在 37˚C 下孵育。将 pH 调节至 pH 7。根据 [ 15 ]，在孵育期（24、48、72 和 96 小时）后通过以 6000 rpm 离心 10 分钟从生产培养基中提取脂肪酶。

 

2.7. 脂肪酶测定

 

脂肪酶活性根据 [ 16 ] 进行测定，稍作修改，使用棕榈酸对硝基苯酯 (p-NPP) 作为底物。将酶溶液 (50 µl) 添加到 950 µl 底物溶液中，底物溶液由一份溶液 A（3.0 mM pNPP 的 2-丙醇溶液）和九份溶液 B（100 mM 磷酸钾缓冲液 pH 7.0，0.4% Triton X-100）组成和 0.1% 阿拉伯树胶），使用前新鲜配制。将反应混合物在 37˚C 下孵育 20 分钟，并在 410 nm 处读取吸光度。脂肪酶活性和比活性按以下公式计算：

 

脂肪酶活性（U / ml） =一个*乙C* D * E(1)

 

在哪里，

 

A——释放的对硝基苯酚的μmol；

 

B——总体积；

 

C——分光光度法测定所用体积；

 

D——测定中所用酶的体积；

 

E——孵化时间。

 

2.8. 脂肪酶的表征

 

2.8.1. 最适酸碱度

 

根据 [ 7 ] ，在 pH 值 4、5、6、7 和 8 的 100 mM 磷酸盐缓冲液中制备底物溶液。反应混合物由 50 µl 酶提取物和 950 µl 底物溶液组成，孵育前使用 HCl 或 NaOH 将混合物调节至所需 pH。将反应混合物在 37˚C 下孵育 20 分钟，然后在 410 nm 处测定光密度 (OD)。

 

2.8.2. 最佳温度

 

用于确定最佳温度 [ 17 ]；稍作修改，反应混合物按上述方法制备。pH混合物对应于各自酶的确定的最适pH。将混合物在以下每个温度下孵育 20 分钟；40˚C、45˚C、50˚C、55˚C、60˚C、65˚C、70˚C、75˚C、80˚C、85˚C或90˚C，之后脂肪酶活性被如前所述确定。

 

2.8.3. 热稳定性的测定

 

热稳定性是在水溶液 [ 17 ] 中测定的。稍作修改后，脂肪酶制剂在 50℃、60℃、70℃、80℃ 或 90℃ 下预孵育 10、20、30、40、50、60、70、80、90、预孵育期后 100、110 或 120 分钟，将样品冷却，并在由相应酶确定的最佳温度下孵育，并如前所述估计酶的活性。

 

2.9. 酶动力学

 

脂肪酶底物 pNPP 的米氏常数根据 [ 18 ] 确定。通过一些修饰，pNPP 代替 pNPL（月桂酸对硝基苯甲酸），并通过与浓度范围为 0.05 至 5.0 mmol/l 的底物与来自三个已选择分离物的脂肪酶一起孵育来浓缩。根据 Hanes-Woolf 图计算常数值。

 

3。结果与讨论

 

3.1. 酚红橄榄油平板琼脂筛选脂肪酶活性

 

对所有分离物进行显色板测定；培养基颜色由红转黄呈阳性表明脂肪酶是由不同的芽孢杆菌菌株产生的。脂肪分解生物体释放的游离脂肪酸会降低 pH 值，导致颜色发生变化，表明脂肪酶的形成 [ 19 ]。因此，发现分离株是脂肪酶生产者，能够利用底物（橄榄油）产生黄色色带。这一结果与 [ 20 ] [ 21]，他们证明在脂肪酶测定中使用酚红具有高度可重复性，灵敏度水平在 15 分钟内低至 0.5 对硝基苯基棕榈酸酯 (p-NPP) 酶单位。因此，通过使用橄榄油作为酚红琼脂中的脂质底物，脂肪分解活性的存在可以通过黄色着色来指示。该测定基于游离脂肪酸从细菌脂肪分解反应中释放出来的原理。来自芽孢杆菌分离物的脂肪酶在液体生产培养基中产生。作为一种更准确的定量方法，支持显色板测定，用于筛选产生脂肪酶的芽孢杆菌。分离物的脂肪酶活性介于 3.4 U/ml（分离物 O3）至 63.4 U/ml 分离物 G14（表 1). 在测试的分离株中，三个分离株 B10、O1 和 G14 显示出高脂肪酶生产潜力，平均脂肪酶活性分别为 28.3、41.2 和 63.4 单位/毫升。

 

 

3.2. 生化和生物物理特性

 

3.2.1. pH行为

 

来自分离物 O1、B10 和 G14 的脂肪酶的最佳 pH 值（图 1）通过将脂肪酶暴露于一系列 pH 条件来确定。来自每个分离物的每个脂肪酶制剂的最适 pH 值和不同脂肪酶制剂的 pH 行为如图 1所示。发现来自分离物（O1、B10 和 G14）的脂肪酶的最佳 pH 值介于 4 和 9 之间。每个分离物的脂肪酶的最高活性在 pH 6.0 和 8.0 时测量。该结果与先前报道的短小芽孢杆菌 RK 31 在 pH 6.0 [ 7 ]、枯草芽孢杆菌 KL在 pH 8.0 [ 22 ] 的脂肪酶最适 pH 值一致。]; 然而，通过改变酶和底物的结构并抑制反应的催化作用，pH 值的变化对酶活性有不同的影响 [ 17 ]。

 

3.2.2. 最佳温度

 

脂肪酶的最适温度结果如图2所示。图 2中提到了在不同温度下与 pNPP 溶液孵育 20 分钟后，来自不同分离物的每种脂肪酶的活性。分离的 O1 脂肪酶在 60˚C 时表现出最高活性，而分离的 B10 和

 

 

 

图 1。三种芽孢杆菌分离物产生的脂肪酶制剂的 pH 行为。其中，G14 = 从瓜尔豆油田分离的细菌 O1 = 从石油污水中分离的细菌 B10 = 从 Abusabein 油田分离的细菌。

 

 

 

图 2。三种芽孢杆菌分离物产生的脂肪酶制剂的温度曲线。其中，G14 = 从瓜尔豆油田分离的细菌 O1 = 从石油污水中分离的细菌 B10 = 从 Abusabein 油田分离的细菌。

 

分离物 G14 分别在 75˚C 和 40˚C 时释放出最高活性。表皮葡萄球菌(MTCC 10656)产生脂肪酶的最适温度为40˚C [ 23 ]，而凝结芽孢杆菌为 40˚C [ 24 ]，芽孢杆菌为 60˚C [ 18 ] [ 25 ]，因为据报道，芽孢杆菌生产脂肪酶的最佳温度。[ 26 ] [ 27 ] H-257 和Bacillus thermoleovorans ID-1 为75˚C ；与正在进行的研究结果的相似性与以前的研究结果一致。

 

3.2.3. 脂肪酶的热稳定性

 

在每种酶的最适温度下在水溶液中测量脂肪酶的热稳定性；（参见图 3-5）显示了在 50˚C、60˚C、70˚C、80˚C 和 90˚C 下暴露不同时间后制剂的脂肪酶活性。在 90˚C 孵育 120 分钟后，分离物 G14 的脂肪酶完全失活，而分离物 O1 的脂肪酶在 90 分钟后失去活性，但在 100 分钟内保持活性。也在 80˚C 下失去活性并在 90 分钟内保持活性。来自分离物 B10 的脂肪酶在 90˚C 下 80 分钟内失去活性，并在 90 分钟内保持活性。在所有温度下检测的三个分离株均显示出高活性。由于蛋白质的独特性质及其热稳定性，脂肪酶在高温下的热稳定性表明其适合工业应用和商业化[17 ]。

 

 

 

图 3。分离物 O1 在不同温度下暴露不同时间后的脂肪酶制剂的酶活性。该数据表示为在最佳温度下 20 分钟的活性。

 

 

 

图 4。在不同温度下暴露不同时间后，来自分离株 B10 的脂肪酶制剂的酶活性。该数据表示为在最佳温度下 20 分钟的活性。

 

 

 

图 5。在不同温度下暴露不同时间后，来自分离株 G14 的脂肪酶制剂的酶活性。该数据表示为在最佳温度下 20 分钟的活性。

 

3.3. 脂肪酶动力学

 

在 0.01 M 磷酸钾缓冲液和不同 pNPP 浓度作为底物（0.05、0.5、1.0、2.5 和 5 mM）中，在各自脂肪酶的最佳 pH 和温度下测量来自芽孢杆菌分离物 O1、B10 和 G14的脂肪酶动力学。来自分离物 G14、OI 和 B10 的脂肪酶的 V max和 K m值分别为 17.6、135 和 24.4 µmole/min 以及 1.3、1.6 和 0.681 mM。[ 28 ] 发现从嗜热脂肪芽孢杆菌HU1 中纯化的脂肪酶的 K m和 V max值分别为 0.235 mM 和 161.2 mmol/min/mL，正如 [ 29 ] K m和 V max报道的那样值分别为 105.26 mmol 和 0.116 mmol∙min −1 ∙g −1，来自芽孢杆菌。ITP-001 使用橄榄油作为底物。

 

4。结论

 

使用形态学、生物化学和分子方法 (RAPD-PCR) 可以清楚地识别芽孢杆菌。在 48 小时的孵育期后，发现分离物 G14（从瓜尔豆土壤分离物）的最大脂肪酶活性为 63.4 U/ml。分离株 O1 和 B10 的最适 pH 值为酸性 (pH 6)，而 G14 为碱性 (pH 8)。Isolate B10在75℃的最适温度下脂肪酶活性更高，这将使其更适合生产脂肪酶用于洗涤剂行业或所有依赖较高温度的行业。在 90˚C 热处理后，分离物 G14 显示出最低的稳定性。来自分离物 G14、OI 和 B10 的脂肪酶的 V最大值分别为 17.6、135 和 24.4 µmole/min，Km 值分别为 1.3、1.6 和 0.618 mM。

 

利益冲突

 

作者宣称没有利益冲突。

 

参考

 

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