组合化学一直是现代药物发现和生物技术研究活动的焦点。这是一个合成大量分子多样性库并筛选目标特性的概念。本报告旨在说明酶技术的应用,使用组合化学的概念作为植物纤维生物转化的新方法。柑橘果胶经过组合酶消化,以创建具有不同结构变体的果胶低聚糖文库。分馏和筛选的重复循环导致分离和鉴定具有抗菌活性的活性 oligoGalA 物种。
关键字
组合酶,聚半乳糖醛酸酶,果胶酸裂解酶,果胶, 低聚糖
一、简介
组合化学的中心思想是合成感兴趣分子的不同群体,并筛选群体中表现出理想和有用特性的少数变体。一个简单的有机分子,其核心结构带有五个随机排列的取代,理论上会导致总共 3125 个结构变体。在每个位置随机分配 20 个天然氨基酸的五肽文库将产生一个包含 320 万种不同肽的组合文库。组合化学技术因其在药物发现和生物技术 [ 1 ] [ 2 ] 、农业科学 [ 3 ] 以及农业和食品 [ 4 ] [ 5 ] 中的应用而受到广泛审查。] 。创建组合文库的关键技术可分为化学和生物学方法。前者包括固相合成及其对有机小分子、肽和寡核苷酸文库的改进。生物学方法使用遗传密码作为前体,在噬菌体、大肠杆菌和酵母等微生物中表达随机文库。这方面的最新发展是动态组合化学的创建,通过该化学库在热力学控制下进化 [ 6 ]。
植物细胞壁多糖由装饰有各种类型取代的聚合物主链组成。例如,木聚糖包含一条 β-1,4-连接的吡喃木糖链,其修饰有至少六种类型的侧基。同样,木葡聚糖、果胶和其他物质由多种侧基取代组成,可以被特定的酶靶向。这些侧基的存在及其位置、密度和连接类型会影响主链聚合物的酶促降解模式,反之亦然。这些协同相互作用决定了所产生的寡糖片段的结构结果。因此,使用酶通过外科手术单独和/或依次去除侧基部分,构成一个组合设计,用于生成大量结构多样的低聚糖库,这些低聚糖将转化为不同且独特的反应性和功能特性。通常可以使用高通量方法筛选具有目标生物学和/或功能特性的候选者。这种组合酶方法应该适用于探索生物聚合物降解各个方面的新结构和功能。为了证实“组合酶技术”的新概念,我们应用该设计从柑橘果胶中生产果胶低聚糖库。重复分离和筛选导致分离出具有抗菌活性的活性果胶低聚糖种类(通常可以使用高通量方法筛选具有目标生物学和/或功能特性的候选者。这种组合酶方法应该适用于探索生物聚合物降解各个方面的新结构和功能。为了证实“组合酶技术”的新概念,我们应用该设计从柑橘果胶中生产果胶低聚糖库。重复分离和筛选导致分离出具有抗菌活性的活性果胶低聚糖种类(通常可以使用高通量方法筛选具有目标生物学和/或功能特性的候选者。这种组合酶方法应该适用于探索生物聚合物降解各个方面的新结构和功能。为了证实“组合酶技术”的新概念,我们应用该设计从柑橘果胶中生产果胶低聚糖库。重复分离和筛选导致分离出具有抗菌活性的活性果胶低聚糖种类(为了证实“组合酶技术”的新概念,我们应用该设计从柑橘果胶中生产果胶低聚糖库。重复分离和筛选导致分离出具有抗菌活性的活性果胶低聚糖种类(为了证实“组合酶技术”的新概念,我们应用该设计从柑橘果胶中生产果胶低聚糖库。重复分离和筛选导致分离出具有抗菌活性的活性果胶低聚糖种类(图 1)。
图 1。组合酶消化产生不同结构寡糖文库的简化示意图。
2。材料和方法
2.1. 材料
柑橘果胶购自 Sigma(圣路易斯,密苏里州),用乙醇洗涤 3 次并在 50˚C 烘箱中干燥。半乳糖醛酸、diGalA 和 triGalA 购自 Sigma (St. Louis, MO)。所有果胶分解酶均来自 Megazyme (Wicklow, Ireland)。大肠杆菌 (ATCC 8739) 获自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯,弗吉尼亚州)。培养基购自 Difco (Leeuwarden, The Netherlands)。DEAE Sepharose FF 树脂和 Sephadex G-10 柱购自 GE Health Science (Pittsburg, PA)。HPTLC 板购自 Analtech (Newark, DE)。所有化学品和溶剂均为分析级或 HPLC 级。
2.2. 果胶的酶解
将柑橘果胶以 1% 的浓度溶解在水中,用 NaOH 将 pH 值调节至 5.0。添加多聚半乳糖醛酸酶 (300 U),在 30°C 下孵育两个时间点。将反应混合物冷却至室温,调节至pH 8.0,合并并充分混合。添加氯化钙至终浓度为 2 mM,将混合物分成等体积,向其中添加四剂量的果胶酸裂合酶(50 至 400 U)并在摇动水浴中孵育。在每个时间间隔,将反应混合物调节至pH 2.0。以 1:1 v/v 的比例加入乙醇,然后离心以去除沉淀物。将收集的上清液加热至 80°C 10 分钟以使酶失活。通过真空蒸发除去乙醇,然后冻干。
2.3. 高效薄层色谱
将果胶寡聚物样品应用于 20 × 10 cm HPTLC 硅胶 F254 板,并使用 EtOAc/HOAc/1-PrOH/HCOOH/H 2 O (25:10:5:1:15) 显影。通过用KMnO 4试剂(3 g KMnO 4、20 g K 2 CO 3、5 ml 5% NaOH水溶液和300 ml H 2 O)喷雾观察寡核苷酸片段的不饱和度。然后用含有 1 mg/ml orcinol 的 10% H 2 SO 4甲醇溶液喷洒板,然后在 90˚C 下加热以观察低聚糖。
2.4. 离子交换层析
使用 DEAE Sepharose FF 柱 (2.5 × 60 cm) 在室温下进行阴离子分离。首先将酶消化物(2 g 在 50 ml 水中)调节至 pH 5.0,然后上柱,然后用 0 至 0.7 M NaCl 的梯度洗脱。流速为0.5毫升/分钟。通过 A 235读数测量馏分的不饱和度,通过 DNSA 方法 [ 7 ] 测量还原糖,通过苯酚-硫酸法 [ 8 ] 测量总碳水化合物。
2.5. 高效液相色谱分析
活性 oligoGalA 物种的分析在配备 UV-vis 检测器的 Shimadzu LC-10 AD 系统上进行,使用阴离子交换 Sorbax SAX 柱(4.6 × 250 mm)和 0.1 M 醋酸钠 pH 5.4 作为流动相室温下流速为 0.3 毫升/分钟。凝胶渗透色谱 (GPC) 使用 Ultrahydrogel 柱 (7.8 × 300 mm) 进行,用水作为流动相,流速为 0.3 ml/min。支链淀粉标准品用于 MW 校准。
2.6. 生长实验和培养条件
将冷冻干燥的大肠杆菌 (ATCC 8739) 用 1 ml 无菌 Difco TM MH (Mueller Hinton) 肉汤再水化并划线接种到 MH 琼脂平板上。制备 5 ml 过夜培养物并测量 600 nm 处的吸光度。培养物用 MH 肉汤稀释至终浓度为 1 × 10 3cfu/ml 基于标准曲线。将活性果胶 oligoGalA 物种以特定浓度溶解在 MH 肉汤中,过滤除菌(2 μm HT Tuffryn 膜注射器过滤器,Pall Corporation),并添加到稀释的大肠杆菌培养物中。通过使用酶标仪(SpectraMax M2,Molecular Devices,CA)测量适当稀释的细胞培养物在 600 nm 处的吸光度来确定细胞生长。基于半乳糖醛酸的标准曲线,通过苯酚-硫酸法测定寡核苷酸浓度。最小抑菌浓度 (MIC) 由标准微量稀释法确定。它被定义为在过夜培养后抑制微生物可见生长的最低抗菌浓度 [ 9 ] [ 10 ]。
3。结果与讨论
组合酶消化后获得的反应混合物通过乙醇沉淀分级分离以产生与较高分子量聚合果胶分离的果胶低聚糖。产率约为 40-60%。低聚糖在 HPTLC 分离中显示出不同程度的链长和不饱和度(图 2)。
图 2。HPTLC 分离柑橘果胶的酶消化物。泳道 1:玉米糖浆;泳道 2:果胶寡糖。将样品点在二氧化硅 GHL 板上,在乙酸乙酯/乙酸/1-丙醇/HCOOH/H 2 O (25:10:5:1:15) 中显影,然后喷洒 KMnO 4试剂,如“方法”中所述。
将低聚糖应用于 DEAE Sepharose FF 柱,将果胶消化物分离成主要部分:A、B、C 和 D,它们都是不饱和的(在 235 nm 处显示吸光度)并且与苯酚-H 2 SO 4呈阳性化验(建议碳水化合物检测)(图 3)。然而,与其他馏分 D(合并的馏分 92 - 105)不同,它不与 DNSA 反应,表明它不是还原糖。从色谱图中的洗脱模式来看,果胶寡聚物级分 D 比其他三个级分相对更具阴离子性。
果胶寡聚组分 D 对大肠杆菌菌株 ATCC 8739 的生长显示出意想不到的抑制作用。回收并冻干这种活性寡聚 GalA 物种,并使用阴离子交换和凝胶渗透柱通过 HPLC 进一步分析。它基本上由使用 RI 和 UV235 检测器的 HPLC 凝胶渗透柱上的一个主峰组成(图 4)。
酶衍生寡糖的筛选导致在活性 oligoGalA 物种中检测到抗菌活性。在每组实验中,微生物的初始接种被小心地控制在 0.5 × 10 3 cfu/ml 滴度,以便在相同的起始条件下进行比较。图 5显示抑制效果随着浓度的增加而增加,在 0.4% w/v 时实现了对细胞生长的完全抑制,这是 MIC(最小抑制浓度)值。抗菌效果可持续至少三天甚至更长(图 6)。
抑制机制可能与活性物质的独特结构特性有关。由于果胶酸裂合酶的消除反应,它具有高度不饱和的结构,正如在 235 nm 处的吸光度测量所证实的那样。活性寡聚物对高锰酸盐氧化也高度敏感,产生一条带粉红色背景的亮黄色条带
图 3。酶消化柑橘果胶的阴离子交换色谱分离。柱:DEAE Sepharose FF,2.5 × 60 cm,流速:0.5 ml/min,梯度洗脱:0 至 0.7 M NaCl。
图 4。活性 oligoGalA 物种的 HPLC 分析。使用 (a) Sorbax SAX 色谱柱 (4.6 × 250 mm) 在配备紫外-可见检测器和 RI 检测器的 Shimadzu LC-10 AD 系统上进行分析。流动相为 0.1 M 醋酸钠 pH 5.4,室温下流速为 0.3 毫升/分钟;(b) Ultrahydrogel 凝胶 120 柱,以 H 2 O 为流动相。
图 5。增加活性 oligoGalA 物种对细胞生长的浓度效应。大肠杆菌 (ATCC 8739) 在 35˚C 的 MH 肉汤中过夜培养,稀释至适当的滴度浓度,并添加各种浓度的 oligoGalA(0.005% 至 0.8%)。继续培养 24 小时。通过测量A 600适当稀释的细胞培养物来确定细胞生长,并且基于转化曲线计算cfu。
图 6。活性 oligoGalA 物种对细胞生长影响的时间过程。大肠杆菌 (ATCC 8739) 在 37˚C 的 MH 肉汤中过夜培养,稀释至适当的滴度浓度,并添加 0.01% 的寡核苷酸。孵育持续 3 天,每 12 小时和 24 小时取样一次。通过测量A 600适当稀释的细胞培养物来确定细胞生长,并且基于转换曲线计算cfu/ml细胞密度。
高效薄层色谱法。凝胶渗透色谱表明该物种的大小范围为 1.2 kDa,通常被认为在低分子量寡糖的范围内。果胶水解物主要由酸性低聚糖组成,因为果胶的母体结构具有羧酸侧基。
活性寡核苷酸中反应性双键的存在可能是其对细胞生长的抑制作用的促成因素。某些类别的酚类化合物的抗菌活性归因于反应性双键的存在、酸部分的缔合以及促进膜渗透性的能力 [11 ]。双键是亲电子的,很容易参与各种反应,导致生物分子的交联和失活。在木质纤维素材料的水解中发现了酚类化合物的抗菌活性,可与普通防腐剂苯甲酸钠相媲美 [ 12 ]。
寡糖的小尺寸可能是促进通过细胞膜的重要因素。高分子量范围内的低聚糖已被证明会阻止有效的体内利用,并且不会发挥功能和生物活性。文献中报道的许多抗菌寡糖都是低分子量分子,由三聚体、四聚体和五聚体组成 [ 13 ] [ 14 ]。目前的结果似乎支持这样的建议,即小分子尺寸允许穿透细胞膜,并与细胞内成分和过程相互作用。
有报道称,酸性(含葡萄糖醛酸)木聚糖可抑制革兰氏阳性菌 [ 13 ] 。藻酸盐低聚糖由主链中的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸组成,也被认为会破坏细菌生物膜的形成 [ 15 ] [ 16 ]。需要进一步研究将酸性基团的功能方面与抗菌作用联系起来。
本研究中的活性果胶寡聚物可被认为可与一些常用食品防腐剂相媲美,这些防腐剂通常在 0.1% 的范围内应用。不可消化的低聚糖 (NDO) 作为功能性食品成分已广受欢迎。近年来,低聚糖也作为抗生素的替代品作为动物生产中的抗微生物生长性能促进剂 (AGP) 得到推广 [ 17 ]。AGP 和 NDO 的健康因果关系通常与微生物区系的改变有关,因此与肠道系统的生理状况有关 [ 18 ]。在这两个方面,低聚糖通常以次最低抑制剂浓度使用,以调节微生物群组成。
4。结论
已经开发出一种新的组合酶方法来创建用于功能筛选的不同结构的寡糖库。一种酶衍生的果胶低聚糖已被分离出来,并显示可抑制测试生物体 ATCC 8739 的生长。MIC 值估计为 0.4%,与其他报道的低聚糖和一些常见食品防腐剂相比具有优势。活性果胶寡聚物可用作抗菌生长促进剂的替代品或高价值防腐剂的新来源。因此,本研究证明了组合酶方法的科学性和实际应用。
致谢
提及公司和/或产品仅供参考,并不意味着批准推荐该产品以排除其他可能也适用的产品。美国农业部的所有项目和服务都是在非歧视的基础上提供的,不考虑种族、肤色、国籍、宗教、性别、年龄、婚姻状况或残疾。作者声明,本文的发表不存在利益冲突。
利益冲突
作者声明本文的发表不存在利益冲突。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
[ 1 ] Kennedy, JP、Williams, L.、Bridges, TM、Daniels, RN、Weaver, D. 和 Lindsley, GW(2008)组合化学科学在现代药物发现中的应用。组合化学杂志,10, 345-354。
[ 2 ] Seneca, P.、Fassina, G.、Frecer, V. 和 Miertus, S.(2014 年)组合化学和技术对药物发现和生物技术的影响——简短回顾。Nova Biotechnologica et Chimica,13, 87-108。https://doi.org/10.1515/nbec-2015-0001
[ 3 ] Lindell, SD、Pattenden, LC 和 Shannon, J. (2009) 农业科学中的组合化学。生物有机与药物化学,17,4035-4046。
[ 4 ] Wong, DWS 和 Robertson, G. (2004) 将组合化学和生物学应用于食品研究。农业和食品化学杂志,52,7187-7198。
[ 5 ] Wong, DWS 和 Robertson, G. (1999) 组合化学及其在农业和食品中的应用。载于:Shahidi 等人,Eds.,Chemicals via Higher Plant Bioengineering,Kluwer Academic/Plenum Publishers,纽约,91-105。
[ 6 ] Herrmann, A.(2014 年)动态组合/共价化学:读取、生成和调节化合物和化合物混合物生物活性的工具。化学学会评论,43,1899-1933。
[ 7 ] Miller, GL (1959) 使用二亚硝基水杨酸试剂测定还原糖。分析化学,31, 426-428。
[ 8 ] Masuko, T.、Minami, A.、Iwasaki, N.、Majima, T.、Nishimura, S.-I。和 Lee, YC (2005) 通过苯酚-硫酸法在微孔板中分析碳水化合物。分析生物化学,239,69-72。