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谷氨酸脱氢酶 (GDH) 合成的 RNA 是一种基于非遗传密码的 RNA，适用于揭示遗传密码对代谢调控（转录、翻译、siRNA 等）施加的结构限制。已在整株植物中诱导 GDH 合成的 RNA 以敲除目标 mRNA 群体，从而产生无过敏原的植物表型；富含脂肪酸、必需氨基酸、莽草酸、白藜芦醇等。下文用于研究 GDH 合成 RNA 结构特性的方法包括 GDH 同工酶的纯化、同工酶合成 RNA、RNA 逆转录为 cDNA、测序cDNA 的计算，G+C 含量的计算，与基于遗传密码的 DNA 相比，通过 PCR 扩增分析稳定性；由 GDH 的单个六聚体同工酶合成的 RNA 的生化特征。单一产物条带由 GDH 合成 RNA 的 cDNA 的 PCR 扩增产生，而多个条带由基于遗传密码的 DNA 扩增产生。cDNA 具有广泛的 G+C 含量（35% 至 59%），而基于遗传密码的 DNA 具有较窄的 G+C 含量（50% 至 60%）。GDH β6 同源六聚体同工酶合成富含 A+U 的 RNA，而 a6 和 α6 同源六聚体同工酶合成富含 G+C 的 RNA。因此，由 GDH 合成的 RNA 不同于基于遗传密码的 RNA。体外化学反应显示 GDH 合成的 RNA 将总 RNA 降解为较低分子量的产物。因此，GDH合成的RNA是RNA酶。消除遗传密码对 RNA 施加的结构限制，释放出 RNA，使其成为一种具有特异性降解不需要的转录物的酶。GDH合成RNA的RNA酶活性在细胞中普遍存在；它很容易通过用矿物营养素等处理植物来诱导，并且可以简化植物酶学和分子生物学研究项目中的实验方法。

 

关键词

 

RNA 酶合成,非遗传密码 RNA ,克隆载体 DNA , Touch-Down PCR ,移码序列同源性

 

 

一、简介

 

谷氨酸脱氢酶 (GDH EC 1.4.1.2) 是一种多亚基酶，可聚合核糖核苷三磷酸以产生独立于任何模板的 RNA [ 1 ]，但取决于酶的二项式六聚体亚基组成，这是一种受代谢环境控制的特性 [ 2 ][ 3 ]。因此，GDH合成的RNA不具有遗传性。植物 GDH 合成大量 RNA [ 4]. 无论还原或氧化反应条件如何，都可以合成相同的 RNA 序列和群体。GDH 在所有生物体中均有功能。GDH 合成 RNA 的代谢性质为研究基于遗传密码和基于非遗传密码的 RNA 之间的化学对比提供了机会，以区分它们的生物学功能。GDH 合成的 RNA 与许多 mRNA 具有序列同源性 [ 1 ]。它们调节总 RNA 丰度 [ 5 ]。GDH 合成 RNA 已被逆转录成 cDNA 并测序，导致沉默寡核苷酸的大规模制备，这些寡核苷酸通常用作监测 mRNA 浓度的工具，以及协调生化途径的代谢网络 [4 ]]. GDH 同工酶已在整个植物中被诱导合成选定的 RNA 组，这些 RNA 敲除目标 mRNA 群体，从而产生植物代谢变异体，这些变异体专门积累许多具有饮食重要性的代谢物。具体来说，无过敏原的低亚油酸花生[ 6 ]、富含脂肪酸的花生[ 3 ]、富含必需氨基酸的花生[ 7 ]、超高营养白藜芦醇含量的花生种子[ 8 ]、富含莽草酸的Phyla榆属植物[ 9 ]；和加倍的生物质产量 [ 4]是通过释放 GDH 合成 RNA 的 mRNA 降解活性而实现的一些生物技术里程碑。RNA 酶和转录物沉默的机制是已知的 [ 10 ][ 11 ][ 12 ]，但 GDH 合成的 RNA（基于非遗传密码的 RNA）降解总 RNA（基于遗传密码的 RNA）的化学机制尚不清楚讨论了 [ 5 ]。已经详细研究了 RNA-RNA 相互作用 [ 13 ][ 14 ][ 15 ]，但尚未研究非遗传密码 RNA 和基于遗传密码的 RNA 之间溶液中的同源比对相互作用。本文开启了关于 GDH 合成的 RNA 和总 RNA 部分之间的体外反应的对话。

 

在 GDH 合成的 RNA 作为酶的生物技术应用之后，与基于遗传密码的 RNA 相比，需要表征它们的化学性质。编码的化学反应有很多对比

 

RNA 和非编码 RNA [ 16 ][ 17 ][ 18 ][ 19 ][ 20 ]。然而，编码和非编码 RNA 都是遗传性的。重要的是比较基于遗传密码和基于非遗传密码的 RNA，以便开始揭示遗传密码对代谢调节（siRNA 沉默、转录、复制、翻译、基因组结构等）施加的限制和自由。研究 RNA 广义分子特性的方法围绕着计算 G+C 和 A+T 组成以及 RNA 转化为 cDNA 后的最近邻碱基堆积相互作用 [21]，包括可能的分子内结合位点的算法分析[ 13 ]]. 尽管 G+C 含量已被反复应用于核酸结构的描述 [ 16 ][ 17 ][ 18 ][ 20 ]，但基因组中 G+C 差异分布的生化基础尚未得到讨论。核酸的其他结构特性受与氢键相关的稳定性、熔解和退火温度、顺磁性和静电不稳定性、与蛋白酶和配体的相互作用 [22][23 ] [ 24 ]控制]. 包括 G+C 含量在内的大多数特性可以通过对 cDNA 进行聚合酶链式反应 (PCR) 扩增来推断，这是下文介绍的一种实验方法。GDH 合成的 RNA 和基于遗传密码的 RNA 之间的结构差异阐明了 GDH 合成的 RNA 的催化特性。

 

2。材料和方法

 

2.1. 实验动物的处理

 

花生 (Arachis hypogeae Floor Runner cv.) 种子在 5% 酒精溶液中灭菌 10 分钟，用去离子水冲洗，然后种植在五个重复的培养皿中的湿滤纸上。矿物质营养素的组成为：N+N+N+K+S+S（1 L 75 mM NH 4 Cl、4 mM KCl、100 mM Na 2 SO 4）；N+P+K+K+K（1 L 25 mM NH 4 Cl、20 mM Na 3 PO 4、12 mM KCl）；N+P+S+S+S+S（1 L 25 mM NH 4 Cl、20 mM Na 3 PO 4、200 mM Na 2 SO 4）；N+P+P+P（1 L 25 mM NH 4 Cl，60 mM Na 3 PO 4). 对照物用蒸馏水润湿。每个培养皿种植约 8 - 10 粒种子，并允许在 24˚C - 28˚C 的温室温度和 70% - 80% 的相对湿度以及得克萨斯州五月份的温度和阳光条件下发芽。温室用遮光布遮光 50%。每天更换滤纸并用新鲜的矿物溶液重新润湿。应用的矿物盐组合物基于化学计量组合，以模拟 GDH 同工酶 [ 25 ][ 26 ] 的二项式亚基多肽组合物，并以摩尔比与种子的靶分子相互作用。完整的胚芽出现后，停止发芽；并将幼苗储存在-30℃冰箱中。

 

2.2. 总RNA

 

使用酸性苯酚/氯仿 (pH 4.5) 方法从花生幼苗中提取总 RNA [ 27 ]。

 

2.3. GDH同工酶的纯化

 

通过在 4˚C 下用每毫升含有 5 个单位的 RNase A 的100 mL 缓冲液 [ 28 ] 均质化，从 N+N+N+K+S+S 处理的花生幼苗 (20 g) 中纯化 GDH，以及DNase 1. 匀浆液离心（5000×g，15 min，4℃），上清-80℃冷冻，室温解冻，使线粒体断裂，确保DNA和总RNA具有被降级。再次离心（9000×g，4℃，30 分钟）后，上清液进行硫酸铵分级沉淀，制备级等电聚焦（IEF；Rotofor，Bio-Rad，Hercules，USA），然后透析如前所述的分数 [ 4]. Rotofor 级分 (0.2 mL) 通过天然 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)（100 V，16 小时，4˚C）纯化，以去除其他蛋白质和核酸污染。GDH 同工酶用 0.05 M Tris 碱溶液从电泳凝胶中洗脱（30 分钟，100 V），在洗脱室的零下温度下，如前所述 [29] 的小型全凝胶洗脱器 (Bio-Rad )。每个洗脱通道分别收集洗脱的 GDH 电荷异构体部分，并储存在 -30°C。

 

2.4. GDH 合成 RNA

 

在含有 0.87 mM NH 4 Cl、3.5 mM CaCl 2、10.0 mM α-酮戊二酸 (α-KG)、0.23 mM NADH、0.6 mM 每种 riboNTP、5 U RNase 抑制剂、5 U 的 DNase 1 和 5.0 μg 放线菌素 D。通过添加 0.2 mL 冷冻电泳纯化的 GDH 电荷异构体开始反应，如前所述 [29]，每 mL 含有约 500 μg蛋白质。用 0.1 M Tris-HCl 溶液使反应的最终体积达到 0.4 mL 和 pH 8。反应在 16˚C 下孵育过夜（16 小时），并通过 GDH 的苯酚-氯仿 (pH 4.5) 提取停止。用乙醇沉淀RNA。RNA合成进行了3次以验证结果的可重复性。

 

2.5. 限制性片段差异显示 PCR

 

使用随机六聚体引物，用从 N+N+N+K+S+S 处理的幼苗中纯化的 GDH 电荷异构体合成的 2 μg 每种产物 RNA 合成 cDNA。产物 cDNA (5 μg) 在 65˚C 下用 Taq 1 限制酶（5 单位）消化 2 小时。为了与基于遗传密码的 DNA 的化学性质进行比较，pCR4-TOPO 载体 DNA (5 μg) 在另一个微管中用 Taq 1 限制酶（5 单位）类似地消化。将接头、32 P 标记的延伸引物和选择性展示探针组合（Display Systems Biotech, Vista, CA USA）连接到限制性片段的末端。适配器、延伸引物和显示探针的核苷酸序列属于其制造商 Display Systems Biotech, Vista, CA USA 的专有信息。

 

根据 Display Systems Biotech, Vista, CA, USA 的“接触式”限制性片段双显示 (RF-DD) PCR 方法扩增模板 DNA (0.5 μg)。初始变性为 96˚C 1 分钟。对于前 10 个循环：变性在 96˚C 30 秒，退火在 60˚C 30 秒，对于第一个循环，然后每个循环将退火温度降低 0.5˚C，直到退火温度为 55˚C 10个周期后达到；72°C 延伸 1 分钟。PCR 继续进行另外 25 个循环：变性（96°C，30 秒）、退火（55°C，30 秒）、延伸（72°C，1 分钟）；最终伸长率（72˚C，5 分钟）。Display Systems Biotech 试剂盒中的所有 64 个显示探针都用于差异显示 PCR。在聚丙烯酰胺测序凝胶电泳后，通过放射自显影术使差异条带/产物可视化。将选定的 cDNA 和载体 DNA 片段亚克隆到 pCR4-TOPO 载体中，并转化到 TOP10 One Shot Chemically Competent（非致病性）大肠杆菌（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，然后在卡那霉素选择性平板上过夜生长。每个平板挑出多达 15 个阳性转化体菌落，并在含有 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中培养过夜。使用质粒试剂盒（Novagen，Madison，WI）纯化质粒，并使用 T7 和 T3 引物对所选重组质粒的插入 cDNA 或载体 DNA 片段进行测序，MWG Biotech Inc., High Point, North Carolina, USA。使用 M13 引物（Invitrogen Life Technologies，加利福尼亚州）；琼脂糖凝胶电泳分离；产品带被紫外线可视化，并进行了照片记录。

 

2.6. GDH 合成的 RNA 与总 RNA 之间的反应

 

GDH 合成的 RNA 和总 RNA 制剂在 0.1 M Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.0 中标准化为 5 µg/µL 的浓度。反应在置于冰上的 8 个编号的微型离心管中进行。管 1 含有 100 µg 对照花生的总 RNA，以及 100 µg GDH 合成的 N+N +N+K+S+S 处理花生的 RNA。管 2 含有 200 µg 对照花生的总 RNA。管 3 含有 100 µg N+P+K+K+K 处理花生的总 RNA 和 100 µg GDH 合成的 N+N+N+K+S+S 处理花生的 RNA。管 4 含有 200 µg GDH 合成的 N+N +N+K+S+S 处理花生的 RNA。管 5 含有 100 µg N+P+S+S+S+S 处理花生的总 RNA 和 100 µg GDH 合成的 N+N+N+K+S+S 处理花生 RNA。管 6 含有 200 µg GDH 合成的 N+N+N+K+S+S 处理花生的 RNA。管 7 含有 100 µg N+P+P+P 处理花生的总 RNA 和 100 µg GDH 合成的 N+N+N+K+S+S 处理花生的 RNA。第 8 管含有 200 µg 对照花生的总 RNA。向每个管中添加 1 μL 的 0.6 mM ribo-NTP 混合物；反应的最终体积用 0.1 M Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8 调至 50 µL。管 1、2、3、4、5 和 7 进行热循环：预热（96˚C，30秒）。然后 40 个冷循环（5˚C，1 分钟），暖循环（37˚C，2 分钟）。最终储存 (5˚C)。管 6 和 8 留在冰上。反应程度通过 7 µL 每种反应溶液的 2% 琼脂糖凝胶电泳来证明。凝胶用溴化乙锭溶液染色；并拍照。使用 UN-SCAN-IT 凝胶数字化软件（Silk Scientific, Inc., Orem, Utah, USA）对 RNA 条带强度进行数字化。

 

2.7. RNA 的结构和功能表征

 

为了给 GDH（RNA 酶）合成的 RNA 分配推定的功能，它们的 cDNA 序列被用作查询来搜索花生 taxid 3818 数据库（Arachis hypogaea）的 NCBI 核苷酸-核苷酸（不包括 EST）BLAST (blastn) [30 ]。类似地，为了鉴定克隆的 pCR4-TOPO 载体 DNA 的片段，将测序的片段用作查询以搜索 NCBI 核苷酸-核苷酸 blastn。推定的功能被分配给得分最高的比对，并考虑到 PCR 产物相应琼脂糖凝胶电泳条带的分子量。为了比较 GDH 合成的 RNA 之间的序列同源性，使用了 NCBI BLASTN 2 序列比对算法 [ 31 ]。

 

2.8. DNA物理性质

 

将 DNA 序列应用于 Kibbe 方程 ( http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html ) 以准确计算胞嘧啶和鸟嘌呤并计算 G+C 含量、最近邻和解链温度 ( Tm) 考虑碱基堆积能。

 

3。结果与讨论

 

3.1. G+C 含量和扩增均匀性

 

单个产物条带由 GDH 聚合 RNA 的插入 cDNA 的 PCR 扩增产生（图 1），而多个产物条带由载体插入 DNA（基于遗传密码的 DNA）的扩增产生，尽管 Tm 应用于“ touch-down”PCR 是严格的（表 1），并且 PCR 方案是在相同的条件下使用相同的试剂混合物同时进行的。因此，GDH合成RNA的cDNA存在扩增稳定性和均一性，而基于遗传密码的DNA存在扩增不稳定性。建议使用“Touchdown”PCR 来避免不完全启动 [ 32 ][ 33 ][ 34 ]，并提高 PCR 扩增的特异性和灵敏度[35 ]，但许多带有载体 DNA 插入片段的重组质粒（图 1泳道 14、22、23、24、27 和 29）未产生主要 PCR 产物条带，因此表明插入载体片段的化学性质干扰了DNA 链的完全解离。链的这种不完全熔化解离可能来自非常

 

 

 

图 1。与基于遗传密码的 DNA 相比，GDH 合成的 RNA（基于非遗传密码）的 cDNA 的聚合酶链反应扩增。通过接触式 PCR 进行扩增，然后等分试样在含有溴化乙锭的 2% 琼脂糖凝胶上进行电泳。凝胶电泳后拍照。GDH 合成的 RNA 的 cDNA 位于泳道 1-13、15-20。基于遗传密码的 DNA 位于泳道 14、21-29。X是DNA分子量标记。

 

 

a = GDH 合成的 RNA 的 cDNA（基于非遗传密码）。b = 基于遗传密码的 DNA。

 

高最近邻堆叠碱基相互作用和高 G+C 成分。GDH 合成 RNA 的 cDNA 的 G+C 含量在 35% 到 59% 的范围内变化，而编码 DNA 片段的载体的 G+C 含量在 50% 到 60% 的较窄范围内变化（表1） . 因此，由 GDH 合成的 RNA 是经过修饰的 RNA，其 cDNA 表现出不同于基于遗传密码的 DNA 的化学性质。

 

载体 DNA 的高 G+C 含量（表 1）与之前的观察结果一致 [ 20 ][ 36 ][ 37 ][ 38 ]，即基因组中编码 DNA 片段的长度受到结构限制，与其较高的相关G+C 含量与较差的 G+C 区域相比 [ 39 ]。但 DNA 的高 G+C 含量增加了基因的稳定性 [ 37 ]。先前关于 G+C 含量重要性的研究将富含 G+C 的区域与缺乏 G+C 的区域进行了比较 [ 36] 基于遗传密码的 DNA。此处介绍的编码 DNA 序列的 G+C 含量与 GDH 合成 RNA 的 cDNA 之间的比较是进一步阐明核酸化学和功能的基线。因此，编码功能对基因组施加了更高的 G+C 含量相关结构约束，而 RNA 的 GDH 合成最小化了 G+C 相关结构约束。

 

最近邻相互作用是影响核酸稳定性的主要因素，AT配对总是不稳定的[ 21 ]。最近邻效应将 GDH 合成 RNA 的 cDNA 和基于遗传密码的 DNA 插入片段的 Tm 值增加到相同程度（表 1）。与载体 DNA 插入片段中较窄的范围 (50% - 60%) 相比，GDH 合成 RNA 的 cDNA 的 G+C 含量范围较宽 (35% - 59%) 表明 GDH 合成的 RNA 的 cDNA 具有更高的 A+T 含量会至少破坏 cDNA 双螺旋结构中的某些局部部分。据报道，局部螺旋构象变化可以发挥生物学功能 [ 40]]. 这种 DNA 稳定性的相对差异可以解释 GDH 合成 RNA 的 cDNA 的 PCR 扩增产物的均匀性与载体 DNA 插入片段的 PCR 产物的不均匀性形成对比（图 1 ）。因此，DNA 聚合酶在 GDH 合成 RNA 的 cDNA 的 PCR 中比在基于遗传密码的载体 DNA 片段中更有活性。

 

有人提出，由 GDH 合成的 RNA 可能通过同源序列介导的 RNA 干扰活性来调节 mRNA 丰度 [ 4 ][ 6 ][ 7 ]。在描述与沉默效率相关的特征时，Chan 等人。[ 16 ] 确定了 siRNA 低 G+C 含量的重要性，表明 siRNA G+C 含量与 RNAi 效率呈负相关。刘等人。[ 19 ] 计算出高效的 siRNA 往往富含 A+U（G+C 含量为 44.0% 至 47.8%），而低效的 siRNA 往往富含 G+C（GC 含量为 52.7% 至 55.2%）。 GDH 合成的 RNA 的 cDNA 的较低 G+C 含量（表 1) 解释了 GDH 合成的 RNA 作为 siRNA 的效率。mRNA 中用于结合 GDH 合成 RNA 的同源靶序列也富含 A+U。相反，基于遗传密码的 DNA 中较高的 G+C 含量（表 1）可以解释它们的一些低效 siRNA 活性 [ 41 ]。mRNA 中用于结合基于遗传密码的 siRNA 的靶序列也富含 G+C。一些出版物指出，与反义技术相比，基于遗传密码的 siRNA 构建体的高 G+C 含量似乎是高效 siRNA 技术在医学或制药应用中的绊脚石 [19] [ 42 ]]. GDH 合成的 RNA 有助于规避一些基于遗传密码的 siRNA 结构限制，因为 GDH 实施合成以响应植物、组织和细胞的普遍代谢环境。我们已经改变了几种作物的代谢环境，并成功地去除了特定的有毒和抗营养成分 [ 3 ][ 4 ][ 6 ][ 9 ]。此外，哺乳动物 GDH 合成 RNA。

 

基于遗传密码的DNA和基于非遗传密码的DNA的G+C含量之间的差异（表1）以及基于非遗传密码的DNA的扩增均匀性（图 1）表明基于遗传密码的DNA具有顺磁性和静电性能 [ 22 ][ 23 ][ 24]与基于非遗传密码的 DNA 不同。因此，当 GDH 合成的 RNA（RNA 酶）以正确的方向排列并在沉默生化反应期间与其同源 mRNA（基于遗传密码的 RNA）相互作用时，不同顺磁介电 RNA 分子之间的共谋力可能是如此之大，以至于由此产生的能量可以液化总 RNA，这是两种 RNA 中稳定性较差的一种（图 2）。

 

3.2. 基于遗传密码的 RNA 与非遗传密码 RNA 之间的反应

 

总 RNA 与 GDH 合成的 RNA 之间的反应导致总 RNA 降解（图 2）。泳道反应程度的数字像素化比较 1（图 2：对照花生总 RNA 与 N+N+N+K+S+S 处理花生的 GDH 合成的 RNA 之间的反应），2（总 RNA对照花生，热循环后），4（N+N+N+K+S+S处理花生的GDH合成的RNA，热循环后），6（N+N+N的GDH合成的RNA +K+S+S处理的花生，热循环前）和8（对照花生的总RNA，热循环前）显示，泳道1出现了分子量低于5S RNA条带的新降解条带。

 

泳道3比较（图2：N+P+K+K+K处理花生总RNA与N+N+N+K+S+S处理花生GDH合成RNA反应），2（对照花生总RNA，热循环后），4（N+N+N+N+K+S+S处理花生GDH合成RNA，热循环后），6（N+N+GDH合成RNA N+K+S+S 处理的花生，在热循环之前）和 8（未处理的对照花生的总 RNA，在热循环之前）也显示在 16S 和 5S rRNA 条带之间出现新的降解 RNA 条带，而这些条带在泳道 3 中的 GDH 合成 RNA 和总 RNA。

 

 

 

图 2. GDH 合成的 RNA 与总 RNA 之间的体外反应。在 8 个试管中证明了 GDH 合成的 RNA 酶活性。反应 1（泳道 1）是对照花生的总 RNA 与 N+N+N+K+S+S 处理花生的 GDH 合成 RNA 混合。反应 2（泳道 2）是对照的总 RNA。反应 3（泳道 3）是 N+P+K+K+K 处理花生的总 RNA 与 GDH 合成的 N+N+N+K+S+S 处理花生的 RNA 混合。反应 4（泳道 4）是 N+N+N+K+S+S 处理花生的 GDH 合成 RNA。反应 5（泳道 5）是 N+P+S+S+S+S 处理花生的总 RNA 与 GDH 合成的 N+N+N+K+S+S 处理花生的 RNA 混合。反应 6（泳道 6）是 N+N+N+K+S+S 处理花生的 GDH 合成 RNA。反应 7（泳道 7）是 N+P+P+P 处理花生的总 RNA 与 GDH 合成的 N+N+N+K+S+S 处理花生的 RNA 的混合物。反应 8（泳道 8）是对照花生的总 RNA。反应 1、2、3、4、5 和 7 进行了热循环；反应 6 和 8 不是。反应后，将等分的反应物进行电泳（2% 琼脂糖凝胶），然后对凝胶拍照。

 

类似地，N+P+S+S+S+S 处理的花生总 RNA 与 N+N+N+K+S+S- 的 GDH 合成的 RNA 之间的反应 5（图 2：泳道 5 ）与对照相比，经处理的花生表现出相当大的 RNA 条带损失（泳道 2、4、6 和 8）。

 

同样，N+P+P+P 处理花生的总 RNA 与 N+N+N+K+S+S 处理花生的 GDH 合成的 RNA 之间的反应 7（图 2：泳道 7）显示与对照（泳道 2、4、6 和 8）相比，RNA 条带明显丢失。

 

泳道 1、3、5 和 7 在不存在蛋白酶的情况下描述的反应表明 GDH 合成的 RNA 作为酶降解与其共享序列同源性的转录物，因为泳道 2 和 8 的比较表明热循环不降解总 RNA，但泳道 4 和泳道 6 显示 GDH 合成的 RNA 对热循环敏感，热循环（泳道 4）后泳道 6 中 26S rRNA 以上的高分子量条带不存在，这可能是由于它们的热循环由于 GDH 合成的 RNA 的高 A+U 含量导致不稳定（表 1). 本研究中应用的热循环温度不超过 37˚C，以避免 RNA 降解反应过程中 RNA 氢键断裂。将反应温度冷却至 5˚C 旨在使 GDH 合成的 RNA 与总 RNA 部分中的同源序列对齐。将温度升至 37˚C 以允许发生 RNA 降解反应。这表明在同源 RNA 序列的比对中可能存在化学相互作用。Meyer [ 14 ]、DiChiacchio 等人。[ 13 ]应用计算方法来揭示两个 RNA 分子之间可能的相互作用。反应 (图 2) 在 5˚C 和 37˚C 之间进行热循环，以提高同源序列比对率、总 RNA 降解率，并持续从 RNA 酶表面分解反应产物。我们通过向反应混合物中添加核糖核苷三磷酸来播种反应（图 2），以便将平衡位置进一步向右移动。

 

结果（图 2）是通过来自处理过的花生的总 RNA 与 GDH 从不同处理的花生中合成的 RNA 之间的交叉反应获得的。当总RNA和GDH合成的RNA来自同一处理的花生时，没有反应（结果未显示）。这表明花生中的总 RNA 群体与通过普遍的 GDH 同工酶调节 RNA 合成的机制处于稳态关系。这是通过诱导 GDH 合成 RNA [4 ] [ 7 ][ 8 ][ 9 ][ 26 ] 随意产生植物代谢变异体（表型）的生化基础。

 

同样，花生的不同总 RNA 对相同的 GDH 合成 RNA（泳道 1、3、5 和 7）的分子反应不同，进一步表明总 RNA 的每个 mRNA 图谱针对特定的代谢表型/变体 [ 4 ]。

 

因此，交叉反应（图 2）是 GDH 合成的 RNA 在体内降解转录物的体外证明。可能是，但不知道，实验背后的生化机制涉及用亲核试剂、亲电试剂、矿物肥料、N-羧甲基壳聚糖、生化调节剂和农药是诱导GDH合成的RNA酶活性降解同源mRNA的集合如图2. 而且，植物代谢对环境的分子反应是植物酶学和分子生物学研究的一个巨大学科领域，对植物系统、作物生产、林业、自然和环境资源管理以及园艺的科学研究很重要。RNA 作为酶已在剪接过程中得到证实 [ 10 ][ 43 ][ 44 ]，但在通过基于非遗传密码的 RNA 降解调节 mRNA 丰度方面并未得到证实。

 

3.3. RNA 的 G+C 和 A+U 含量的生化合成

 

体外证明 GDH 合成的 RNA 作为酶的功能引发了关于 RNA 结构的讨论（表 2和表 3）。由每个 GDH 六聚体同工酶合成的 RNA 寡核苷酸阐明了 G+C 含量的化学频率，因为不是比较多肽的等电点 (pI) 值，而是根据核酸序列重复和同源性来可视化 GDH 生物学功能（表2 ) 类似于遗传密码序列重复。GDH 具有由三个不同亚基多肽组成的非等位基因结构 [ 1 ]。编码酸性更强的亚基（a 和 α）的基因 (GDH 1 ) 是杂合的，并且是共显性的；和基因 (GDH 2) 编码酸性较低的亚基 (β) 是纯合子。28 种六聚体同工酶的二项式分布模式 [ 45 ] 是一个蛋白质群体阵列，显示了天然聚丙烯酰胺凝胶景观上的亚基关系。通过零下电泳分馏过程可以从天然丙烯酰胺凝胶板中纯化活性 GDH 同工酶，该过程保留了每个六聚体异构体的结构完整性和催化功能。系统的成对序列同源性比较 [ 31]显示GDH β6同源六聚体同工酶合成的RNA(#19)与GDH a6同源六聚体同工酶合成的RNA(#18)不存在序列匹配，与RNA(#17)不存在序列匹配) 由 GDH α6 同源六聚体同工酶合成 (表 2和表 3 )。这是令人惊讶的，因为该酶的三个亚基多肽（a、α 和 β）具有共同的抗原特性 [ 26 ]。然而，由 GDH α6 同源六聚体合成的 RNA (#18) 与由 GDH α6 同源六聚体同工酶合成的 RNA (#17) 具有三重同源性匹配。GDH 合成的 RNA 的全局同源性比较（表 2)对N+N+N+K+S+S处理花生的分析表明，大部分是由α-亚基和α-亚基多肽混合比例组成的六聚体同工酶合成的；由三个亚基多肽组成的混合同工酶合成的 RNA 频率较低。经核苷酸处理的花生合成的 RNA 的一级结构更为复杂，因为 GDH 的 28 种六聚体同工酶几乎全部被诱导 [ 1 ]。因此，在 GDH 合成的寡核苷酸 RNA（表 2）中重复的加/加和加/减序列代码（比对）似乎让人联想到核酸生物学代码的可能雏形。全局同源性比较（表2) 还揭示了所有具有低 G+C 含量的 RNA 都是由 GDH β6 同源六聚体同工酶合成的。相反，所有具有高 G+C 含量的 RNA 都是由富含 α-亚基和/或 α-亚基多肽的 GDH 六聚体同工酶合成的。因此，在核糖核苷三磷酸聚合产生RNA酶的过程中，

 

 

β6同源六聚体GDH异构体优先选择ribo-ATP和UTP作为底物；而α6、a6及其组合优先选择ribo-GTP和ribo-CTP作为底物。这些生化方面的考虑为基因组中富含 G+C 区域的压倒性优势与 A+T 富含区域的频率较低的重复发表提供了力量 [20][ 36 ] [ 37 ]。GDH 六聚体同工酶通常用于合成核酸杂交探针，以研究顽固的药用植物 Phyla dulcis [ 9 ][ 46 ] 的生化途径。改为应用基于遗传密码的杂交探针的研究 [ 47]没有敲除编码单萜合酶的 mRNA，而基于 GDH 合成 RNA 酶的杂交探针的研究已经敲除编码单萜合酶的 mRNA（Osuji 未发表的结果）。这说明了 GDH 合成的 RNA 酶的效率。

 

应用的化学计量矿物溶液（N+N+N+K+S+S；N+P+K+K+K；N+P+S+S+S+S；和 N+P+P+P）选择花生发芽是因为与水处理相比，它们不延迟幼苗胚根的出现。有 299 种矿物质常量营养素的化学计量组合模仿 GDH 的六聚体亚基结构。我们在组织培养室中种植了五月份的花生种子，

 

质粒 1：cDNA 插入片段

 

Arachis hypogaea 草酸氧化酶 (OxOxl) mRNA，EU024476.1 TGAGTCCTGACCGATAGCGCCAATGCGTTGAGTACCTTCAACGCCAAGAACGTCAACTACCAGCGCACGCCGCACTTCAAGAACAAACCCGGCACGCGGCATAGCGATGAGTCCTGACCGGGTACGCAGTCTACGAGACCAGTA。

 

质粒 2：cDNA 插入片段

 

花生 hypogaea profilin (Ara h5) mRNA AF059616.1

 

GATTTTATTTAGGAGGTATTGGGAACGAATTGGAATGTAATAATATTGATTCATAGAGATCCAGAAGAAAAAGAATAATCTTCTACTTTGAGAATAATAAAAAAAGAAAAGTGTTCAATTGGAACATGAAAACGTGACCTGACTGAATACTGGTCTCGTAGACTGCGTACCCGGTCAGGACTCATCGCTACGTTAGCGTCTCTGAGGCGCGCTATTCTACAATCTTAAAAACCCCTGTCAACCCTTTAAATTGCTTTTAAGACAATGATTTGCGCTTCTTTCTGATTTCTTCTTGGGGAGAAGAAACCCGTGGGCTGACGTTGCTGCGGGGCGCACTTTACAAGCCTTTGCCTTACAGTTCAACGCCCTATCGGTCAGGACTCATAAGGGC

 

质粒 3：cDNA 插入片段

 

花生泛素结合酶 (UBC) mRNA，AY769917.2

 

GAGTCCTGACCGATAGTGAATAGGTCGTTGTGTTTCATGAGGCCTCCTTGATACTCATGAACTACAGATATTGACGTCAAAAATAATTCAAATAAGTTGTCCGACAATGCTGATGAGTCCTGACCGGGTACGCAGTCTACGAGACCAGTAAG公司

 

质粒 4：cDNA 插入片段

 

花生 2 型金属硫蛋白 (MT2d) mRNA，DQ665256.1

 

GAGTCCTGACCGATAGGAGATCAAGGCACCCCATGTCTTGAGGGTGGGACGGTTATTTGCTCAGGATAATAAAGGGCGGTTTCAGTTCAAGTGCCTGAGCTTATATAGCGATGAGTCCTGACTGGGTACGCAGTCTACGAGACCAGTAAGG

 

质粒 5：cDNA 插入片段

 

Arachis hypogaea mRNA for ABA 8'-hydroxylase (CYP707A2 gene), cultivar yueyou 7, mRNA HG764751.1

 

GAGTCCTGACCGATAGCGGCCTGCATGCTCATGTTGCCAGTCTTGCCACCAGTTCAGGAGCCGGGAACTGACCTACGCCATTTTTGTAAACACCGGTAGAAGAGGAATAAGGACTCCCGGAAGTGTGCCAAGTCACCAAGGTTTCAACTTCGGGTACGCAGTCTACGAGACCAGTAAG

 

质粒 8：cDNA 插入片段

 

花生 hypogaea 品种 fuhua 8 谷氨酸脱氢酶 1 (GDH1) mRNA，KT933119.1

 

ACTGGTCTCGTAGACTGCGTACCCGGTCAGGACTCATCGCTACGTTAGCGTCTCTGAGGCGCGCTATTCTACAATCTTAAAAACCCTGTTCAACCCTTTAAATTGCTTTTAAGACAATGATTTGCGCTTCTTTCTGATTTCTTCTTGGGGAGAAGAAACCCGTGGGCTGACGTTGCTGCGGGGCGCACTTTACAAGCCTTTGCCTTACACTTAGATAGAACGCCCGTACGAGTCAG公司

 

质粒 9：cDNA 插入片段。

 

Arachis hypogaea 菌株 E2-4-83-12 delta-12 脂肪酸去饱和酶 (FAD2B) 基因，JN544190.1

 

TGAGTCCTGACCGATAGCCTGCCTAAACCTTCTTGAAGTAGTGGCGGCGGTCGTTTTCGGTGACTGTCTGCTGGAAAATGTCCGTCCAGAAATCCCGCTCCATTACGTCCTGGTGAAACATCACCCCGCAGATAACCTCCATCGGGTTGCACTTCAAAAGCTCGGCAACCTTCACGGCCTGCTTGACGCTCATTTCATGTTTCCGCCTTGCATAGCTAGGAGTCGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGGTCGTAGCTA

 

质粒 10 cDNA 插入片段。

 

Arachis hypogaea cultivar fuhua 8 谷氨酸脱氢酶 1 (GDH1) mRNA，序列 ID：KT933119.1

 

CTGGTCTCGTAGACTGCGTACCGGGTCAGGACTCATCGCTACGTTAGCGTCTCTGAGGCGCGCTATTCTACAATCTTAAAAACCCTGTTCAACCCTTTAAATTGCTTTTAAGACAATGATTTGCGCTTCTTTCTGATTTCTTCTTGGGGAGAAGAAACCCGTGGGCTGACGTTGCTGCGGGGCGCACTTTACAAGCCTTGCCTTACACTTAGATAGAACGCCGTACGAGTCAG公司

 

质粒 11：cDNA 插入片段。

 

Arachis hypogaea 品种 JL24 苯丙氨酸解氨酶 (PAL) mRNA，GU477587.1

 

ACTGGTCTCGTAGACTGCGTACCCGACTAGTGAGCTATTACGCTTTCTTTAAAGGGTGGCTGCTTCTAAGCCAACCTCCTAGCTGTCTAAGCCTTCCCACATCGTTTCCCACTTAACCATAACTTTGGGACCTTAGCTGACGGTCTGGGTTGTTTCCCTTTTCACGACGGACGTTAGCACCCGCCGTGTGTCTCCCATGCTCGGCACTTGTAGGTATTCGGAGTTTGCATCGGTTTGGTAAGTCGGGATGACCCCCTAGCCGAAACAGTGCTCTACCCCCTACAGTGATACATGAGGCGCTACCTAAATAGCTATCGGTCAGGACTCATAAGGG

 

质粒 12：cDNA 插入片段

 

Arachis hypogaea 品种 JL24 苯丙氨酸解氨酶 (PAL) mRNA,ID: GU477587.1

 

TGGTCTCGTAGACTGCGTACCCGACTAGTGAGCTATTACGCTTTCTTTAAAGGGTGGCTGCTTCTAAGCCAACCTCCTAGCTGTCTAAGCCTTCCCACATCGTTTCCCACTTAACCATAACTTTGGGACCTTAGCTGACGGTCTGGGTTGTTTCCCTTTTCACGACGGACGTTAGCACCCGCCGTGTGTCTCCCATGCTCGGCACTTGTAGGTATTCGGAGTTTGCATCGGTTTGGTAAGTCGGGATGACCCCCTAGCCGAAACAGTGCTCTACCCCCTACAGTGATACATGAGGCGCTACCTAAATAGCTATCGGTCAGGACTCATAAGGG

 

 

表 3。一些 cDNA 插入片段和基于遗传密码的（载体）DNA 插入片段。

 

温室、田间地块和温室高架床，并用化学计量的常量矿物质营养液处理它们；并自1998年以来对GDH合成RNA的RNA酶活性研究取得了一致的良好结果[ 2 ]。

 

3.4. GDH 合成 RNA 的功能结构

 

GDH 合成的寡核苷酸 RNA 中重复的加/加和加/减序列匹配的可能性（表 2）可能类似于核酸遗传密码，这促使人们讨论遗传密码与 GDH 合成的 RNA 中的重复序列之间的功能关系。将 GDH 合成的 RNA 的 cDNA 插入质粒并测序（表 3）。质粒 1 的 cDNA 插入片段（图 1）与编码花生草酸氧化酶的 mRNA 共有一个正负序列匹配（表 2). 质粒 2 的 cDNA 插入片段与编码 arachin h5（profilin）的 mRNA 共享一个加/加序列匹配。质粒 3 的 cDNA 插入片段与编码泛素结合酶的 mRNA 共享一加/加序列匹配。质粒 4 的 cDNA 插入片段与编码花生 2 型金属硫蛋白的 mRNA 共有一个正/负序列匹配。质粒 5 的 cDNA 插入片段与编码花生品种悦优 7 ABA 8'-羟化酶的 mRNA 共有一个正/负序列匹配 [ 48]. 质粒7的cDNA插入片段与编码花生品种福华8号谷氨酸脱氢酶1的mRNA具有一正/正序列匹配。质粒9的cDNA插入片段与编码花生菌株E2-4-83-的mRNA具有一正/负序列匹配。 12 delta-12 脂肪酸去饱和酶。质粒 10 的 cDNA 插入片段与编码花生品种福华 8 号谷氨酸脱氢酶 1 的 mRNA 共享正/正序列匹配，后者是 GDH 合成的沉默 RNA 的第二个拷贝。质粒 11 的 cDNA 插入片段与编码花生栽培品种 JL24 苯丙氨酸解氨酶的 mRNA 共享一个加号/加号序列匹配。质粒 13 的 cDNA 插入片段共有三个序列匹配，其中两个是正/正，有 +2/+1 移码，一个是负/负，有 -2/-3 移码到编码花生 β-酮脂酰-的 mRNA ACP 合成酶 II。这是 GDH 合成的 RNA 的复杂三点结合，用于更广泛的序列覆盖和编码酮脂酰-ACP 合酶的 mRNA 的完全沉默。因此，GDH合成的RNA（基于非遗传密码的RNA）的每个插入cDNA是特定mRNA（基于遗传密码的RNA）的单位序列代码。

 

质粒 14 的 DNA 插入片段与 gnl|uv|U37573.1 噬菌粒载体 pBK-CMV 的一段相匹配，是 TOPO TA 克隆载体的一个组成部分。

 

质粒 15 的 cDNA 插入片段与花生 Ara h5 mRNA 共享加号/加号序列匹配，是 GDH 合成的该 RNA 的第二个拷贝。这些证据表明 GDH 合成 RNA 是可重复的，尽管它是模板独立的。质粒 16 的 cDNA 插入片段与编码花生丝裂原活化蛋白激酶 2 (DQ068453.1) 的 mRNA 共有两个正/负序列匹配；以及编码花生丝裂原活化蛋白激酶 3 (EU182580.2) 的 mRNA。因此，由 GDH 合成的同一 RNA 片段与两种不同的 mRNA 具有同源性。这是复杂机制的另一个例子，可能涉及沉默 RNA 质量作用效应（有机化学反应）对 GDH 合成 RNA 的 mRNA 沉默。49]. 质粒 18 的 cDNA 插入片段与编码花生三酰甘油脂肪酶 1 的 mRNA 共享正/正序列匹配。质粒 19 的 cDNA 插入片段与编码花生丝裂原活化蛋白激酶 3 (EU182580.2) 的 mRNA 共享三个正/正序列匹配); 具有编码花生丝裂原活化蛋白激酶2(DQ068453.1)的mRNA；以及编码花生丝裂原活化蛋白激酶 1 (DQ068452.1) 的 mRNA。质粒 19 与质粒 16 不同。因此，GDH 合成了两种不同的沉默 RNA 片段，它们靶向编码丝裂原活化蛋白激酶的 mRNA 中的不同位点。这是复杂机制的另一个例子，涉及重复的 RNA 酶质量作用对 mRNA 沉默的影响。

 

质粒 21 的 DNA 插入片段与 gnl|uv|J01636.1 大肠杆菌乳糖操纵子 lacI、lacZ、lacY 和 lacA 基因（PCR 4 TOPO TA 克隆载体的一个组成部分）的一段相匹配。质粒 22 的 DNA 插入片段与 pBR322 的 gnl|uv|J01749.1 片段相匹配，pBR322 是 PCR 4 TOPO TA 克隆载体的一个组成部分。质粒 23 的 DNA 插入片段与 gnl|uv|U37573.1 噬菌粒 pBK-CMV 的一段相匹配。质粒 24 共享序列的 DNA 插入片段与 gnl|uv|X65311.2 载体 pGEM-7Zf(−) 的一部分相匹配，TOPO TA 克隆载体的组成部分。质粒 25 的 DNA 插入片段与 gnl|uv|X65310.2 载体 pGEM-7Zf(+) 的一部分相匹配，TOPO TA 克隆载体的组成部分。质粒27的DNA插入片段与一段gnl|uv|NGB00350.1 Invitrogen pZErO-2载体多克隆位点匹配，TOPO TA 向量的组成部分。质粒 29 的 DNA 插入片段与 gnl|uv|U37573.1 噬菌粒载体 pBK-CMV 的一段相匹配，是 TOPO TA 克隆载体的一个组成部分。克隆载体 DNA 插入片段 14、23 和 29 的长度不同，来自 TOPO TA 载体的相同 pBK-CMV 部分。

 

因此，GDH 合成的 RNA 寡核苷酸单元（表 3）代表了识别总 RNA 中特定 mRNA 靶标的生物学密码，RNA 酶活性（图 2）是消除不需要的 mRNA 的生化机制。

 

3.5. GDH 合成 RNA 的生物技术应用

 

体外证明 GDH 合成的 RNA 的 RNA 酶活性揭示了一种节省时间、空间和精力的植物基础研究实验的智能方法，因为植物代谢对环境的反应的初步调查可以在生长的缩小规模下进行专门为总 RNA 和 GDH 纯化收集足够组织的小室、温室和田间地块；植物对矿物质营养素、生化调节剂、农用化学品和其他异生素的表型反应在生化交叉反应中进行和解释，如图 2所示. 总RNA的降解越严重，生化途径受到的抑制越多，植物的表型特征也就越明显。可以标记 GDH 合成的 RNA 酶，以区分其与图 2中交叉反应中的总 RNA 部分的身份。

 

消除遗传密码对 RNA 施加的结构限制，释放出的 RNA 成为一种酶，可以特异性降解不需要的转录本，而不是像双链 siRNA 那样基于碱基配对，而是基于同源序列比对识别（图 2 ）。这种描述普遍存在的 GDH 合成 RNA 的天然 RNA 酶活性的新生生化知识在基础酶学和分子生物学研究中可能是最重要的，因为该活性很容易液化同源转录本，而不是互补转录本。RNA 沉默和剪接过程的发现 [ 10 ][ 43 ][ 50 ][ 51]释放了一种新的生物学，自发地提升了人类在医学和农业研发科学领域的天真想象力。在过去十年中，基于遗传密码的 siRNA 机制推迟了一些预期的技术突破。然而，对植物进行的生化实验 [ 1 ]-[ 9 ][ 25 ][ 26 ][ 29 ][ 45 ][ 46 ] 继续直观地表明在 RNA 水平上存在广泛而普遍的代谢网络控制系统，但在某种程度上与基于遗传密码的 siRNA 系统不同的化学装置 [ 10 ][ 43 ][ 50 ][51 ]。更生动地说明了广义化学沉默装置的 RNA 逻辑（图 2）。因此，基于非遗传密码的 RNA 酶可以提供更广泛的分子方法来控制植物系统中不需要的转录物的数量。

 

GDH 还合成沉默其自身编码的 mRNA 的单位寡核苷酸（表 3），这是一种完美的反馈策略，用于在环境条件有利于植物快速生长时控制和自动关闭 RNA 酶浓度。从此以后，通过将矿物营养素、其他农业化学品、N-羧甲基壳聚糖或生化调节剂溶液的化学计量混合物应用于植物，无需重建任何基因，就可以简单而具体地控制植物细胞中转录本种群的丰度。这是对大多数植物酶学和分子生物学研究中科学研究思想的相当大的简化。

 

GDH 合成的 RNA 的 cDNA 是 Northern 印迹工具，用于揭示细胞中众多代谢网络和生化调节的分子机制。由于 GDH 合成的 RNA 在重复加/加、减/减和/或加/减同源方向匹配转录序列 [ 4 ][ 7 ][ 8 ][ 9 ]，cDNA 链作为标记探针与转录本的结合是失败证明，因为两条链都可能与 Northern 杂交中的相同转录本结合，从而提高 Northern 条带的检测效率。因此，通过 GDH 合成 RNA 酶是一种替代算法设计的生物技术 [ 52 ][ 53 ]] siRNA 和 Northern 探针。然而，GDH 合成的 RNA 用于生化途径和代谢网络协调的实验。目前还没有算法设计的杂交探针和siRNA用于研究生化途径的整合/区分调控。GDH 合成的 RNA 结构中的移码扩大了 mRNA/RNA 酶相互作用的跨度，以改善 mRNA 的破坏。

 

在应用算法设计的 siRNA 沉默转录本时，据报道，siRNA 的功效受靶转录本丰度和周转率的限制 [54] [ 55 ]]. 与作为对照的未处理生物体相比，来自实验生物体的总转录物提取物的转录组分析进一步加剧了转录物周转率的生物学现象。这种未经处理的对照完全是一种实验性处理，但化学环境条件未知。应该有第二个控制生物体，其具有已知的化学环境条件，容纳特定的控制目标转录物。在诱导 GDH 合成 RNA 酶实验中，除了对照作物外，还有第二个对照作物容纳对照 GDH [ 7 ] [ 26]. 尽管对照作物的转录物显示了实验生物观察到的许多周转率和丰度，但容纳对照 GDH 的对照作物的转录物丰度较低，显示出明显不同于实验生物体的周转率降低模式生物体，从而明确和准确地解释来自 siRNA 分析实验的 Northern 印迹和转录组结果 [ 8 ][ 9 ]。这些考虑强调了将 GDH 合成的 RNA 酶测定作为植物系统分子生物学研究项目中必要控制的重要性。

 

资金和致谢

 

This research project was supported by the Evans Allen fund made available to Prairie View A & M University, Prairie View, Texas by USDA NIFA. Appreciation to Drs. Peter Ampim, and Aruna Weerasooriya for discussions on the stoichiometric compositions of the mineral salt mixes.

 

Conflicts of Interest

 

The authors declare no conflicts of interest.

 

References

 

[1] Osuji, G.O., Brown, T.