在生物系统中裂解硫酸酯的硫酸酯酶是值得特别关注的关键酶,因为它们在有机硫 (OS) 矿化和无机硫 ()释放中起着重要作用。在这项研究中,进行了体外实验,以评估产气杆菌中市售的芳基硫酸酯酶 (EC 3.1.6.1) 对 S 键合底物的水解作用。评估酶-底物相互作用以确定:1) 水解速率,2) 催化效率,3) 热稳定性,以及 4) 这种酶的最佳 pH 值。芳基硫酸酯酶表现出对对硝基苯基硫酸盐(4-硝基苯基硫酸钾(p核动力源))。观察到该酶的最佳活性出现在 pH 7.1 时。最佳温度为 37°C,但范围为 35°C - 45°C。在最佳 pH 和温度下, p NPS 水解酶的表观K m和K cat 分别确定为 1.03 mM 和 75.73 μM/min。这项工作定义了芳基硫酸酯酶 (EC 3.1.6.1) 的催化和动力学特性,并确定了硫酸酯酶活性测试的最佳条件。由此产生的信息有助于阐明单个酶对特定反应的贡献,而不是依赖于传统的总酶活性测量。
关键词
酶,硫酸酯酶,有机硫 矿化
一、简介
硫酸酯酶是一个异质酶家族,构成了生物学和工业上重要的蛋白质组,并且在水解硫酸盐生物分子中的硫酸盐基团中起着关键作用 [1 ]。国际生物化学与分子生物学联合会 (IUBMB) 根据核苷酸序列相似性 [2]、底物特异性和对抑制剂的敏感性[ 3 ]将其分为 EC 3.1.6.1 - EC 3.1.6.18 的 17 个类别。虽然是黑芥子磺基水解酶;myrosulfatase (EC 3.1.6.5) 于 1964 年从该组中移除,公认的主要类别包括芳基硫酸酯酶 (EC 3.1.6.1)、类固醇硫酸酯酶 (EC 3.1.6.2)、葡糖硫酸酯酶 (EC 3.1.6.3)、软骨硫酸酯酶 (EC 3.1. 6.4) 和烷基硫酸酯酶 (EC 3.1.6.19) [4 ] [ 5 ]。
据记载,硫是植物和动物生长发育的重要组成部分,也是活细胞中发生的多种反应的重要组成部分 [ 6 ]。然而,过去 20 年工业源 S 排放量的减少、含 S 杀菌剂和杀虫剂使用的减少、低 S 化肥的使用增加以及高产作物导致 S 可用性较低 [7] [ 8 ]。长期以来,人们一直认为土壤中植物有效硫缺乏是导致全球作物生产延迟成熟、植物发育不良和叶脉间萎黄病的原因 [9] [ 10 ]。
在大多数农业土壤中,无机硫含量通常远低于有机结合硫含量 [ 11 ]。因此,植物通常无法获得有机 S 化合物。硫酸酯是好氧土壤中最重要的有机硫储备,占此类土壤中总硫的 70% 左右 [ 12 ]。因此,有机 S 化合物必须通过硫酸酯的生化水解或通过 C 键合 S 的微生物矿化来转化,以释放无机物 所以2 -4个植物吸收前[ 13 ]。芳香族酯-硫酸盐分子的水解由位于周质的硫酸酯酶催化,该酶从有机 S 分子部分切割硫酸盐。
硫酸酯酶组的酶是释放的主要成分 所以2 -4个来自有机硫化合物。硫酸酯酶被发现存在于细胞内或与细胞成分结合,并且是非生物的或作为完整细胞的细胞外分泌物,或从源自细胞膜的死细胞或裂解细胞中释放[14 ]。本研究关注的酶,例如,芳基硫酸酯酶是一类硫酸酯酶,在广泛的土壤中均检测到细胞外和细胞内两种形式,其活性已被用作有机酯生化矿化的潜在指标。土壤中的硫酸盐 [ 15 ] [ 16] 。已经表明,土壤中的芳基硫酸酯酶既有植物来源也有微生物来源,它们在土壤根际的改变会导致土壤微生物群落的生态和功能发生变化。因此,土壤微生物群落的变化会影响酶的活性,并可能显着影响植物 S 的生化矿化 [ 15 ] [ 17 ]。据报道,芳基硫酸酯酶活性与总 SOM 之间存在显着正相关 [ 18 ]。邓和塔巴塔拜 [ 18]指出,芳基硫酸酯酶的作用与土壤有机碳含量高度相关,表明有机质在保护土壤酶方面起着至关重要的作用。在许多情况下,土壤有机质中 S 的矿化增加了用于植物营养的 S 供应 [ 6 ]。
芳基硫酸酯酶(芳基硫酸酯磺基水解酶,EC 3.1.6.1)是一类参与硫酸化多糖脱硫的糖磺基水解酶。催化芳基硫酸酯键水解,生成芳基化合物和无机硫酸盐( 所以2 -4个). 芳基硫酸酯酶存在于包括哺乳动物、细菌、真菌和高等植物在内的广泛生物体中,尽管它们起源于不同物种 [ 19 ] [ 20 ] ,但它们的一级结构彼此相似。从假单胞菌 [ 21 ] [ 22 ]、肠杆菌 [ 23 ]、鼠伤寒沙门氏菌 [ 24 ]、克雷伯氏菌 [ 25 ] 和沙雷氏菌 [ 26 ] 等细菌中分离出芳基硫酸酯酶已有多项报道。
芳基硫酸酯酶 (ARS) 是硫饥饿期间微生物产生的硫酸盐饥饿诱导 (SSI) 蛋白之一。最近的研究表明,在细菌中,这些蛋白质可能是针对 S 限制的细胞反应中的关键酶 [ 14 ] [ 27 ] [ 28 ]。芳基磺基水解酶与芳香族硫酸酯的脱硫有关。在铜绿假单胞菌中,体内抑制作用可追溯到两个独立的效应物,即亚硫酸盐和硫化物或半胱氨酸,而在肺炎克雷伯菌中,硫酸盐和半胱氨酸相互独立地抑制芳基硫酸酯酶合成 [26 ]] 。根据底物特异性和对抑制剂的敏感性,芳基硫酸酯酶被分为 I 型和 II 型。I 型酶对硫酸对硝基苯酯 (pNPS) 和磷酸对乙酰苯酯底物具有特异性,并且会被氰化物 [ 29 ] [ 30 ] 抑制。II 型酶对对硝基儿茶酚硫酸盐 (pNCS)(2-羟基-5-硝基苯硫酸盐)的催化作用更强,并被磷酸盐和硫酸盐抑制 [14 ]。然而,为了在限制硫酸盐的条件下生存,微生物必须合成 SSI 蛋白以满足其 S 需求 [ 14 ]。
对于催化反应,酶作为催化剂的能力及其对过渡态改变底物的相似亲和力可以通过比较 K cat /K m与相似条件下相应反应的速率常数来评估在没有催化剂的情况下[ 31 ]。一些酶催化慢反应,而另一些酶参与快速反应。那些催化缓慢反应的酶很受关注,因为它们为过渡态类似物的抑制提供了敏感靶点 [ 32 ]。底物的立体化学和立体异构结构或与其相连的元素类型也会影响水解速率 [ 33] 。酶在其活性位点上具有特定的原子构型,对特定酶的底物进行任何修饰都可能使酶变性,从而使蛋白质失效。时间、pH、温度和酶浓度等参数共同影响酶活性。
由于没有确定土壤酶反应或水解的标准方法,我们对硫酸酯酶在矿化有机硫(尤其是土壤中)中的确切作用和功能的理解在某种程度上受到所用方法限制的限制。对硝基苯硫酸盐 (pNPS) 是一种广泛用于测定土壤芳基硫酸酯酶活性的底物;但是,它可能无法准确反映各种土壤硫酸酯酶的相对水解情况。因此,了解酶在具有不同底物浓度的纯系统中的行为并确定单个蛋白质对特定反应的贡献,而不是像传统测定方法那样依赖总酶活性,将提高我们对酶水解的理解在陆地和水生环境中。
通过这项研究,我们专注于一种来自产气杆菌的市售硫酸酯酶。选择该酶是因为大多数关于芳基硫酸酯酶合成调节的早期工作都是用产气杆菌进行的 [ 34 ]。该生物体在含有甲硫氨酸、牛磺酸或硫酸胆碱作为硫源的培养基中生长时合成芳基硫酸酯酶(非抑制条件)。综合是;然而,使用无机硫酸盐或任何被认为是硫酸盐转化为半胱氨酸的直接中间体的硫化合物作为硫源进行抑制[ 34] 。目标是确定芳基硫酸酯酶 (EC 3.1.6.1) 的催化和动力学特性,使用有机 S 化合物作为底物。本文报道了产气杆菌酶的特征。获得的信息还将有助于科学预测有机质分解或降解和土壤元素转化过程中的限速步骤 [ 35 ]。
2。材料和方法
2.1. 有机硫酸盐化合物和酶
在本研究中,无需进一步纯化即可使用来自产气杆菌的对硝基苯硫酸酯(4-硝基苯硫酸钾)(pNPS) 底物(图 1 )和芳基硫酸酯酶。有机硫酸盐化合物和酶均购自美国密苏里州圣路易斯的 Sigma-Aldrich。
2.2. 测定缓冲液和条件
制造商报告的芳基硫酸酯酶的最佳 pH 值为 5.0,最佳温度为 37˚C。据报道,在适当的 pH 值和温度下,一个单位 (U) 的酶每小时可释放 1.0 µmol 对硝基儿茶酚硫酸盐。芳基硫酸酯酶的两种浓度(0.05 U∙mL -1和 0.033 U∙mL -1)用于水解对硝基苯硫酸盐底物 (pNPS)。pH、温度和时间对酶底物的影响
图 1。基板结构。
反应是通过在 10˚C 到 80˚C 的各种温度下孵育来确定的;pH 范围为 2 至 9,时间范围为 1 至 10 小时,使用 pNPS 底物浓度为 Km 的 5 倍[ 36 ]。
2.3. 动力学测定
用于建立测定中动力学参数的底物浓度范围为 0 至 12 mM。通过测量无机物的速率来估计酶活性 所以2 -4个(产品)使用 Tabatabai 和 Bremner [ 4 ] 以及 Dodgson 和 Spencer [ 37 ]描述的方法发布和测定。将硫酸盐化合物(底物)溶解在 0.5 M 醋酸盐缓冲溶液中,pH 值为 5.8,最终酶浓度为 0.05 U∙mL -1和 0.033 U∙mL -1。所有反应混合物均在 3 mL 的总体积下进行。在温育结束时,通过向产物中加入0.5N NaOH和0.5M CaCl 2来终止反应。产生的黄色强度(由于解放 所以2 -4个来自 pNPS 底物)用分光光度计(Thermo Electron Corp. 型号:Genesys 10 UV)在 400 nm 处测量。标准曲线源自已知浓度的分光光度读数 所以2 -4个用于计算测试溶液中的硫酸盐浓度。通过在没有酶的情况下孵育底物来建立对照,以校正由于化学水解而释放的无机 S。无机量 所以2 -4个发行是通过比色法确定的。将所得数据对底物浓度作图。无机硫释放的初始速率与底物浓度的关系符合 Michaelis-Menten 方程:
V=V最大限度[ ] _钾米+ [小号](1.2)
为了研究孵育时间、温度和 pH 值对酶活性的影响,在使用过量底物 (1.0 mM) 的同时改变这些条件。Michaelis-Menten 酶模型用于确定动力学参数。使用 GraphPad Prism 4.00 版统计软件(GraphPad Prism Software, Inc. Ca, USA)通过非线性回归分析计算常数(K m ) 和最大速率 (V max )。
确定温度系数 (Q 10 ) 的测量间隔为 10˚C(在 20˚C 和 80˚C 之间);而活化能 (E a ) 是使用 Arrhenius 方程评估的。除非另有说明,实验一式三份进行。
3。结果与讨论
3.1. 活化能和动力学参数
从细菌来源(产气杆菌)获得的芳基硫酸酯酶活性数据被拟合到 Michaelis-Menten 酶动力学以确定所用底物的K m和 V最大值。V max取决于酶浓度,定义为酶饱和时获得的速度。K m值被认为是酶对底物的亲和力的量度。K m值越低,酶对底物的亲和力越高 [ 38 ]。在这项研究中,来自产气杆菌的纯化芳基硫酸酯酶的 K m值导致浓度为 1.03 mM。相比之下,K m在另一项研究中,从产气杆菌中纯化的芳基硫酸酯酶的值为 0.187 mM [ 39 ]。铜绿假单胞菌活性以从 4-硝基儿茶酚硫酸盐中释放的硫酸盐来衡量,并评估为 0.10 5 mM [ 40 ]。Okamura 等人,[ 34 ] 报道了从产气克雷伯菌 (Klebsiella aerogenes) 细菌中纯化的芳基硫酸酯酶具有更高的 K m值 (9.0 mM)。虽然这些酶能够水解各种芳香族硫酸酯,但在我们的研究中获得了较低的值,表明酶对 pNPS 具有高亲和力。K m的变化似乎反映了底物浓度的差异以及酶的类型和来源。
酶的最大速度 (V max ) 揭示了当催化剂被底物完全饱和时,单位时间内酶分子转化为产物的底物分子数 [ 41 ]。我们的结果表明来自产气杆菌的酶的 V max为 75.7 uM/min。
酶周转数 K cat表示每个酶位点每单位时间转化为产物的底物分子数。本研究中的酶活性为 1.5 × 10 3 s -1,其中;等于动力学常数。高 K cat值表明催化底物反应的酶特异性更高。塔子松等。[ 42 ]和伯格等人。[ 41 ] 报道说,大多数与其生理底物相关的酶的 K cat通常在 1 到 10 4 s -1的范围内。特异性常数,K cat /K m, 合并了用于测量酶底物反应催化效率的所有反应步骤的速率常数。本次评估中的K cat /K m值为 8.7 × 10 5 M −1 ∙s −1。通常高 K cat /K m值表示酶对底物的亲和力较高。
3.2. 底物浓度、时间、温度和 pH 值对活性的影响
芳基硫酸酯酶似乎对所用底物 (pNPS) 显示出绝对特异性。在各种底物浓度下测量底物水解的初始速率(图 2)。反应速度随着底物浓度的增加而增加。在 4 mM 时,反应可能遵循零级动力学。温育时间对芳基硫酸酯酶活性的影响如图3所示。活性随时间呈线性长达两个小时,用于评估动力学参数。然后曲线失去曲线线性,这表明酶饱和或产物抑制。产气杆菌硫酸酯酶在 35˚C 至 45˚C 之间稳定。芳基硫酸酯酶的最适温度为 37˚C,如图 4所示. 该酶在接近 39˚C 的温度下具有活性,但在温度 > 40˚C 时失活。分子的动能会随着温度的升高而增加,从而导致更频繁的碰撞和
图 2。底物浓度对芳基硫酸酯酶活性的影响。
图 3。孵育时间对芳基硫酸酯酶活性的影响。
图 4。温度对芳基硫酸酯酶活性的影响。
增加反应速率。在达到最佳温度后增加动能会导致氢键和疏水相互作用分裂。活性位点开始变形,酶变性。观察到多种底物和相同酶的各种最佳温度可能是由于底物结合后在催化剂上引起的构象变化。在蛋白质上诱导的构象变化可能会延迟或加速氢和疏水相互作用的崩溃 [ 43 ]。
pH 值的变化会影响酶活性位点的离子形式,从而改变活性和反应速率。酶是含有氨基酸的蛋白质,具有碱性、中性或酸性侧基,这些侧基根据 pH 值带正电或带负电。因此,如果底物含有离子基团,pH 可能会导致结构、最大反应速率 (K m )、酶稳定性和底物对酶的亲和力发生构象变化 [ 44 ]。使用Km [ 45 ]的 5 倍浓度,在 3.0 至 9.0 的 pH 范围内确定纯化酶的最佳 pH 值。该酶在 pH 值 6.0 至 7.5 范围内具有活性,pNPS 在 pH 值 7.1 时发生最大水解(图 5). 在较高的 pH 值下,酶活性逐渐降低。含有 pNPS 的芳基硫酸酯酶的 pH 值比供应商报告的值高两个单位。
活化能(E a )基于Arrhenius方程(方程(1.3))计算。
ln k = ( -乙A/右)( 1 /吨) + ln A(1.3)
E a是通过绘制 lnk 与 1/T 的线性关系的斜率计算得出的(图 6)。E a值表示为推动反应向前必须克服的能垒。E a值几乎等于反应物和过渡态之间的能量差 [ 46 ]。计算得出的本研究的硫酸酯酶 E a范围为 18.0 至 36.1 kJ∙mole −1。
图 5。pH 值对芳基硫酸酯酶活性的影响。
图 6。芳基硫酸酯酶活性的 Arrhenius 方程图。
温度系数 (Q 10 ) 用于衡量生物或化学系统因温度升高 10˚C 而发生的变化率。本研究中的Q 10是通过计算 10˚C 温度变化对孵育期间酶活性的影响而获得的。酶活性遵循以下等式(1.4):
Q 10 = 给定温度下的活性/给定温度下的活性 - 10˚C (1.4)
在 20˚C 和 80˚C 之间,产气杆菌酶的平均 Q 10范围为 1.90 - 0.61。
4。结论
基于这项研究和其他研究,酶的水解速率、催化效率、热稳定性和最佳 pH 值可能取决于酶来源和底物的立体化学或立体异构结构。观察到硫酸酯酶的最适 pH 为 7.1。观察到的动力学差异,由关于该主题的其他可用报告证明,表明酶是不同的并且具有不同的功能。几种微生物表现出多种芳基硫酸酯酶活性,这些活性通常受到多种 S 化合物的抑制。对单个酶的调节知之甚少;然而,有证据表明对合成有不同的监管控制。
致谢
这项工作是阿拉巴马州师范大学阿拉巴马农工大学 Winfred Thomas 农业研究站和北卡罗来纳州立大学罗利市作物与土壤科学系的贡献。本文中提及的贸易商或制造商名称仅供参考,并不构成阿拉巴马农工大学或北卡罗来纳州立大学的认可、推荐或排除。该研究得到了 USDA-NIFA、Evans-Allen Grant# ALAX 011 的支持。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
[ 1 ] Barbeyron, T.、Brillet-Guéguen, L.、Carré, W.、Carrière, C.、Caron, C.、Czjzek, M.、Hoebeke, M. 和 Michel, G. (2016) 匹配硫酸化生物分子的多样性: 创建反映底物特异性的硫酸酯酶分类数据库。公共科学图书馆一号,11 号,e0164846。
[ 2 ] De Hostos, EL、Schilling, J. 和 Grossman, AR (1989) 莱茵衣藻周质芳基硫酸酯酶编码基因的结构和表达。分子和普通遗传学 MGG,218、229-239。
[ 3 ] Dodgson, KS, White, GF 和 Fitzgerald, JW (2018) 微生物来源的硫酸酯酶。CRC 出版社,博卡拉顿。
[ 4 ] Tabatabai, MA 和 Bremner, JM (1970) 土壤的芳基硫酸酯酶活性。美国土壤科学学会期刊,34, 225-229。
[ 5 ] Tabatabai, MA 和 Bremner, JM (1970) 影响土壤芳基硫酸酯酶活性的因素。美国土壤科学学会期刊,34, 427-429。
[ 6 ] Riffaldi, R.、Saviozzi, A.、Cardelli, R.、Cipolli, S. 和 Levi-Minzi, R. (2006) 受土壤特性影响的硫矿化动力学。土壤生物学和肥力,43, 209-214。
[ 7 ] Crozier, C.、Hoyt, G. 和 Hardy, D.(2014 年)土壤事实:北卡罗来纳州作物的硫肥。NC State Extension Publications,罗利。
https://content.ces.ncsu.edu/sulfur-fertilization-of-north-carolina-crops
[ 8 ] Raper, TB, Mcclure, AT, Yin, F. 和 Brown, B. 硫磺和田纳西中耕作物 硫磺和田纳西中耕作物 2.