一种常规合成的不同分子大小的硫代和氰基修饰的单链聚 (dNTP) 序列 (20n - 200n) 和相同长度的常规聚 (dNTP) 和聚 (NTP) 物种是通过俄罗斯联邦生物有机产品集团和 ThermoFischer, Inc. 提供的良好服务获得的，然后测试它们对催化活性的影响β-来自 HL-60、WERI-1A 和 Y-79 细胞染色质的类似 DNA 聚合酶以及DNApol中的亲和模式β-poly(dNTP)/ (NTP) 对，分别。超短线 (50 n - 100n) 不同结构的单链 poly(dNTP) 序列及其对癌症特异性 DNA 聚合酶的抑制作用β已被发现。这种现象对于肿瘤中 DNA 修复抑制和随后的 DNA 修复相关短聚 (dNTP) 片段的抗癌活性的可能意义已首次在其药效团揭示潜力方面得到强调。因此，这项工作提出了一项实验性尝试，以提升当代对应用于抗癌议程的 DNA 衍生产品的态度，特别是针对急性髓性白血病和视网膜母细胞瘤细胞 DNA 修复机制故障。在这项研究中，肿瘤特异性 DNA 聚合酶β被发现是引物样单链DNA 片段促进的攻击目标，随后发生细胞生长抑制现象。与 DNA 相关的抗癌药物的新概念正在讨论中。
关键词
磁同位素效应 (MIE) , DNA 修复, DNA 聚合酶, DNA-酶结合
一、简介
这项工作的背景平台源自磁同位素效应 (MIE) 对 DNApolβ 催化活性 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] 和癌细胞活力 [ 1 ] [ 2 ] 的实验数据。因此，与丰富的无旋转、非磁性、镁离子影响相比，25 Mg 2+处理的 AML/HL-60 细胞的存活能力模式急剧下降[ 1 ]。此外，随后在用具有磁性的核自旋43 Ca 2+和67 Zn处理的相同白血病细胞上获得了类似的结果 2+离子处理的相同白血病细胞上获得了类似的结果[1 ] [ 3 ] 以及对人类视网膜母细胞瘤细胞进行这些金属同位素处理 [ 2 ] [ 3 ]。
还表明，从上述所有恶性细胞中分离出的 β 样 DNA 聚合酶的持续合成能力取决于 MIE，因此随着总金属中磁性同位素含量的增加，所得 DNA 片段大小在 40n - 250n 范围内变短池 [ 2 ] [ 3 ]。例如，根据来自_ Y-79 和 WERI-1A 视网膜母细胞瘤细胞 [ 1 ]。
因此，这种对 DNA 合成的核磁控制可以得出一个明确的声明，即复制机制涉及一些由离子-自由基对形成组成的离子-自由基步骤 [1 ]。该机制的一个关键要素涉及从新生 DNA 脱氧核糖阴离子到 DNA 聚合酶催化位点内配位的二价离子的电子转移 [ 1 ] [ 4 ]（图 1）。
然而，从化学物理学的角度来看，在健康细胞和恶性细胞中处理的这些离子自由基 DNA 合成路径的分子动力学设计之间存在差异的原因仍然不清楚。值得注意的是，在 DNApolβ 催化位点纳米拓扑景观中，它提供了
图 1。电子从新生 DNA 脱氧核糖阴离子转移到二价金属离子的反应。
对于此反应的“隔间”（10 - 15 nm 或更小），所有描述正常细胞和癌细胞中观察到的增殖率分子机制的物理参数都相同或彼此非常接近 [5] - [ 10 ]。
显然，DNA 合成反应 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] 不太可能是肿瘤细胞凋亡的来源，因为它们的生存能力依赖于 MIE [ 1 ]。尽管如此，这种 MIE 生存能力依赖性可能与肿瘤中 β 样 DNA 聚合酶表达的 DNA 修复活性有关 [ 2 ] [ 3 ] [ 11 ]。
根据我们的假设，这些酶将产生超短 PDRN 序列 (≈40n)，起到 DNApolβ 抑制剂的作用。作为 DNA 修复限制/破坏因子，这些内源性抑制剂可能会促进重要的抗癌作用。在25 Mg/ 43 Ca/ 67 Zn 诱导的原位酶活性影响的情况下，这些抑制剂可能起源于对 MIE 的直接反应。
此外，由于癌症特异性修复所需的局部 DNA 损伤的随机模式，DNA 修复本身意味着与修复相关的 PDRN 物种的一级结构具有广泛的变异性。这也意味着 PDRN 抑制功能应该主要（如果不是完全）由这些序列的长度决定。这些长度本身可能不仅决定了 DNApolβ-PDRN 对接对中的分子动力学，而且同时，它们可能对特定的库仑耦合和色散耦合产生影响，因此影响内部 DNA 引物的每个核苷酸的平均氢键数量酶催化位点。
因此，如果这个假设是正确的，那么 DNApolβ 活性必须被 ≈ 40n 长的多核苷酸“抑制”，而不管它们的一级结构如何。这将使 MIE 促进治疗成为获得原位抗癌分子事件的合法途径。
本研究的目的是检验这一假设。为此，研究了几种分子大小在 20n - 200n 区间内的合成单链多核苷酸（包括 DNA 和 RNA 样多核苷酸），以揭示 1) 它们对来自HL-60、Y-79 和 WERI-1A 癌细胞，以及 2) 它们的酶结合参数。这些特殊细胞模型的选择完全取决于肿瘤增殖率之间的明显差异，“侵袭性”高（急性髓性白血病）和相对低（视网膜母细胞瘤）[8][9][ 10 ] ，因此，由DNA 修复关键酶对癌细胞存活能力的贡献不同。
2。材料和方法
2.1. 试剂和处理材料
Aphidicolin（Fluka，瑞士）；ddTTP（勃林格-曼海姆，德国）；蛋白酶 K（Serva，德国）；HSA（Sigma，美国）；酵母 tRNA（Serva，德国）；小牛胸腺 DNA 引物（Merk，德国）；dATP、dTTP、dCTP、dGTP（Serva，德国）；用于液体 β 闪烁计数的基于二恶烷和甲苯的介质 MS460 和 MS710（德国默克）；CS20 25 毫米玻璃纤维过滤器（法国密理博）；AccuPrep DNA 提取 K2600 试剂盒（Bioneer，韩国）；[Methyl-1,2- 3 H]dTTP, 120 - 160 Ci/mmol (Amersham, UK)。
2.2. 配体
Poly(dT) 25、Poly(dT) 50、Poly(dT) 100、Poly(dT) 200（ThermoFisher，美国）；Poly(A) 49、Poly(2-thio-dC) 49、Poly(dT) 40（IBC RAS，俄罗斯）；Poly(dT) 40、Poly(dT) 80（ICBFM RAS，俄罗斯）；聚([2- 14 C]CN-dT) 40 , 20 - 38 Ci/mmol; Poly([2- 14 C]CN-dT) 80 , 20 - 32 Ci/mmol; 聚([5- 14 C]CN-dT) 40 , 18 - 24 Ci/mmol; Poly([5- 14 C]CN-dT) 80 , 16 - 22 Ci/mmol (Perkin Elmer, USA)。
2.3. 酵素
从 HL-60 急性髓性白血病细胞 [ 11 ] 和 WERI-1A、Y-79 视网膜母细胞瘤细胞 [ 2 ]的染色质中纯化的 PAGE 均质 β 样单体，66.5 kDa 和 23.5 kDa，DNA 聚合酶 (EC 2.7.7.7)受雇。因此，为了纯化这些染色质相关的 DNA 修复编程酶，使用了以下 [ 2 ] [ 11 ] 推广技术。首先，获得细胞裂解物的染色质部分。为此，含有粗核的蛋白质苯酚-氯仿提取物 [ 2 ] [ 11] 与 10 体积的冰冷丙酮混合并在 +4˚C 下保存过夜。丙酮不溶性物质在 20,000 rpm、20 分钟、+4˚C 下沉淀。使用相同的程序用丙酮广泛地重新洗涤沉淀物，然后溶解在 5-6 体积 (w/v) 的 25 mM 磷酸钾 (pH 6.30)/0.5% NaCl/1.5 mM EDTA/0.01% 谷胱甘肽/0.05 中% 肝素/1.0% 2-巯基乙醇/80 - 100 U/mL 核酸酶 S，然后在 +37˚C 下孵育 40 分钟。所有孵育后的混合物均在 80 KHz、30 分钟、+60˚C 下进行不间断剧烈摇动的超声处理。然后将这些混合物提交给达到 30% - 70% 硫酸铵饱和度的标量分馏路径，因此。以 10,000 rpm、20 分钟收集获得的沉淀物，并溶解在 15 mM 磷酸钾缓冲液 (pH 6.0)/0.2% NaCl（10 vols，w/v）中。
冻干粉末首先溶解在 15 mM 磷酸钾 (pH 6.30)/5.0 mM MgCl 2 /1.5 mM EDTA/0.0001% 叠氮化钠中，并通过孔径为 0.3 - 0.4 μ 的玻璃纤维过滤器（Millipore 5R，Millipore，法国） . 透明溶液在 800 psi 下分子大小排阻极限为 5.0 kDa 的膜（Diaflo Y5.0 25 mm 膜，Amicon BV，荷兰）上进行超滤。然后用 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)/1.0% 2-巯基乙醇 (v/v) 提取膜保留的物质，每片剃刀崩解膜 5.0 mL，+30˚C，12 小时, 在转子蒸发器中具有以下浓度。
然后将 1.5 - 2.5 mL 样品上样到装有 TOYOPEARL HW 55F 凝胶的 1.5 × 50 cm (V = 98 mL) 柱上，并用由 15 mM 磷酸钾 (pH 6.30)/5.0 mM MgCl 2组成的洗脱缓冲液平衡/ 0.0001% 叠氮化钠。洗脱速率：0.8 mL/min（室温）。在每个随后洗脱的 1.5 mL 级分中，已根据 [ 2 ] [ 11 ] 测量了 DNA 聚合酶活性。
2.4. 酶活性估计
β 样催化活性值表示为在最佳条件下孵育 1 分钟后掺入新生 DNA 链的 [3H]dTTP 的量，如 [2] 中所述，每 1.0 mg 纯酶蛋白（[3H]DNAcpm/mg 蛋白）校正] [ 11 ]。在由 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)/8.0mM 二硫苏糖醇/15 mM MgCl 2 / 15 % 甘油 (v/v)/27 2 μg act DNA、小牛胸腺/ dATP、dCTP、dTTP、dGTP 各 50 μg/0.25 μmole [Methyl-1,2- 3H]dTTP（90 - 120 Ci/mmol，NET520A，NEN）/150 mM NaCl。氚标记的核苷酸购自美国 New England Nuclear。内进行预优化。2个范围。这些混合物样品首先在 +37˚C 下预孵育 60 分钟。然后将 5.0 - 7.5 μg 纯酶添加到这些运行样品中的每一个中，并将它们在 +37˚C 下孵育 60 分钟以上。将冰冷孵育样品（预孵育后 0˚C、60˚C）以及经胰蛋白酶处理的样品（20 μg/mL 胰蛋白酶，Merck GmbH，德国，+37˚C，60˚C）作为对照.
使用 AccuPrep 基因组 DNA 提取试剂盒（Bioneer Corp.，韩国）对孵育后的混合物进行 DNA 超微量的定量提取。
2.5. DNA 和蛋白质测量
根据 [ 12 ] [ 13 ]在稀释的水溶液中进行 DNA 超微量测量。蛋白质超微量的估计采用[ 12 ]中修改的方法[ 14 ] 。
2.6. 放射性测量
对于 [ 3 H] 和 [ 14 C] 放射性定量检测，使用保留 DNA 的玻璃纤维过滤器（DNApolβ 孵育后乙醇沉淀颗粒）[11]置于二恶烷或甲苯介质中 [ 2 ] [ 3]来确定 cpm 值] [ 11 ] 在 Wallac 2200LX 液体闪烁计数器（Wallac，芬兰）中进行以下处理。
2.7. 配体-酶结合测量
为了量化配体-酶结合模式，考虑了常规标准，例如 K dis (K d ) 和 A c 。
将 Baileyan 模型应用于导致配体-酶（配体-受体）解离常数估计的算法 [ 7 ] [ 15 ]。
在这种方法中，配体-受体相互作用 左+右⇄βαRL, 其中 R 是受体, L 是配体, RL 是配体-受体复合物, α是形成复杂分子的概率，并且 β是其解离的概率。如果配体-受体复合物分子的随机数是x，受体的初始数量是 R0, 自由受体的数量使得 R0- x. 假设该过程在大量配体过剩的情况下展开，使得配体分子数保持等于其初始值 大号0. 配体-受体复合物的形成由以下函数描述 F1个= α大号0(R0- x ), 以及它们的分解——通过 F− 1= βX. 贝利方程组为：
∂米( θ , t )∂吨=大号0R0α (电子θ− 1 )米( θ , t ) -大号0α (电子θ− 1 )∂米( θ , t )∂ θ + β(电子- θ− 1 )∂米( θ , t )∂ θ
dk1个（吨）dt _=大号0R0α -大号0αk1个( t ) - βk1个（吨），
dk2个（吨）dt _=大号0R0α -大号0αk1个( t ) - 2大号0αk2个( t ) - βk1个( t ) + 2 βk2个（吨），
k1个( t ) = m ( t ) =β升_β升+ α( 1 -实验[ - ( βl + α ) t]),
k2个( t ) =σ2个( t ) =α β升_( β升+ α )2个( 1 − exp [ − ( βl + α ) t]) +β2个升2个r( β升+ α )2个exp [ - ( βl + α ) t](1−exp [ − ( βl + α ) t]])
按照该算法，使用 LQ170 SigmaLab 处理通过 [ 7 ] [ 15 ] 中描述并在 [ 16 ]中修改的技术获得的配体-酶复合物在水溶液中稳定性的实验数据，这些数据受温度/超声波/离子强度的影响HP9000 分析系统（惠普，美国）中的软件。
对于非特异性结合对照，HSA 和变性-复性错误折叠酵母 tRNA 被用作假配体 [ 17 ] [ 18 ]。
在所有酶-配体偶联试验中，酶所需的最佳催化参数 [ 2 ] [ 11 ] 在 +37˚C 下保持 40 分钟，而以下配体浓度保持在 0.1 μM、0.5 μM、10.0 μM、20.0 μM、 50.0 μM，如 [ 15 ] [ 17 ] 中所推荐。
紫外分光光度法（Lambda 1050 扫描分光光度计，Perkin Elmer，美国）使用 Spectra Manager II 跨平台软件（JASCO，美国）进行自动化数据处理，目的是获得表示多核苷酸释放程度的Ac指数由于 A 210、 A 254、 A 280值的某种同意，从水溶液中的配体酶， AC= [A254/ (A280−A254) ]/A210[ 16 ]。
2.8. 统计数据
Dunnett 的非参数 (n ≤ 6) 技术用于阐明数据的可重复性以及对照实验比较中差异的显着性 [ 19 ]。
3. 结果
使用来自急性髓性白血病 (HL-60) 和视网膜母细胞瘤 (WERI-1A, Y-79) 的类 DNA 聚合酶种类测试了一组可变的多核苷酸配体（见方法）的抑制作用和配体-酶结合特性细胞。
从图 2和图 3中显示的数据可以看出，无论测试的配体浓度如何以及偶联的酶样品如何，合成多核苷酸的分子大小都是唯一的、关键的、产生影响的因素。应该强调的是，在 50n - 100n 长的多核苷酸（图 2（C）和图 2 （D）），图 3（A）-（E））的情况下观察到最大抑制作用，而后变性错误折叠的 tRNA 测试显示没有抑制作用
图 2。(A) 来自 HL-60、WERI-1A 和 Y-79 癌细胞的 β 样 DNA 聚合酶在最佳和改良孵育条件下的催化活性。(B) 来自 HL-60、WERI-1A 和 Y-79 癌细胞的 β 样 DNA 聚合酶在 Poly(dT) 25存在下的催化活性。(C) 来自 HL-60、WERI-1A 和 Y-79 癌细胞的 β 样 DNA 聚合酶在 Poly(dT) 50 存在下的催化活性。(D) 来自 HL-60、WERI-1A 和 Y-79 癌细胞的 β 样 DNA 聚合酶在 Poly(dT) 100存在下的催化活性。(E) 来自 HL-60、WERI-1A 和 Y-79 癌细胞的 β 样 DNA 聚合酶在 Poly(dT) 200存在下的催化活性。
图 3。(A) AML/HL-60 β 样 DNA 聚合酶在 Poly(dT) 49和复性酵母 tRNA存在下的催化活性(B) AML/HL-60 β 样 DNA 聚合酶在 Poly(A) 49和复性酵母 tRNA存在下的催化活性(C) AML/HL-60 β 样 DNA 聚合酶在 Poly(thio-dC) 49和复性酵母 tRNA 存在下的催化活性。(D) AML/HL-60 β 样 DNA 聚合酶在 Poly(dT) 40存在下的催化活性。(E) AML/HL-60 β 样 DNA 聚合酶在 Poly(dT) 80存在下的催化活性。
完全没有效果（图 3 (A) 和图 3 (B)）。根据 Aphidicolin 和 ddTTP 对照，它们只是证明了所测试酶的真正 β 特异性 [ 2 ] [ 3 ] [ 11 ]（图 2 (A)）。
与聚脱氧核糖核苷酸 (PDRN) 不同，发现聚核糖核苷酸对 DNApolβ 持续合成能力呈惰性，无论这些配体分子的长度如何（图 3 (A) 和图 3 (B)）。
亲和等温线清楚地显示了配体-酶复合物稳定性模式 Kd 和 Ac（参见方法）之间的本质区别，这些模式是针对这些对的众多组合物估计的（图 4和图 5）。因此，与Poly(dT) 200 -DNApolβ 对相比，发现 Poly(dT) 50 -DNApolβ 的解离常数Kd小 2.5 倍（图 5）。
在所有研究的案例中，除了含有 RNA 样 Poly(A) 49的对（图 5），当配体长度接近 50n 时， K d和 A c值最小（图 6）。对于所有 RNA 样配体，发现Kd和Ac的高值实际上等于 Poly(dT) 200的估计值（图 5）。
图 2和图 3中显示的数据毫无疑问地表明超短、长度为 40n - 50n 的氰基-聚脱氧核糖苷衍生物提供的最大抑制效率。这些试剂将显示出高达近 6.5 倍的酶抑制程度。然而，这并不意味着
图 4。HL-60-DNApolβ/Poly(dT) 50 (1) 和 HL-60-DNApolβ/Poly(dT) 200 (2) 配体-受体复合物的亲和等温线。有关技术细节，请参阅方法。
图 5。对来自三种癌细胞系（HL-60、WERI-1A、Y-79）的 β 样 DNA 聚合酶种类进行估计的多核苷酸-酶结合模式（K dis、 A c ）。有关技术细节，请参阅方法。
这种特殊类型的“伪引物”是唯一能够发挥强大 DNApolβ 抑制剂作用的一种。揭示潜在药效团标志的真正关键参数与完全与其分子大小相关的 DNA 片段结构无关（图 2和图 3）。
因此，观察到的结果看起来不值得指出任何发现的特定和完美的药效团，而是作为一个新平台进行详细分析，以升级当前 DNA 衍生物的整个方法
图 6。(A) 超声处理影响 HL-60 类 DNA 聚合酶和14 C 标记的聚 (CN-dT) 40对的稳定性，通过检测游离配体释放进行评估。有关技术细节，请参阅方法。(B) 超声处理影响 HL-60 类 DNA 聚合酶和14 C 标记的聚 (CN-dT) 80对的稳定性，通过检测游离配体释放进行评估。有关技术细节，请参阅方法。(C) HL-60 类 DNA 聚合酶和14 C 标记的 Poly(CN-dT) 40之间不稳定复合物的盐引起衰变通过检测游离配体释放进行评估。有关技术细节，请参阅方法。(D) HL-60 β 样 DNA 聚合酶和14 C 标记的聚 (CN-dT) 80之间不稳定复合物的盐引起衰变，通过检测游离配体释放进行评估。有关技术细节，请参阅方法。
抗癌议程。这是关于我们工作的讨论。
4。讨论
广泛多样的研究合成同源多核苷酸及其单调硫代和氰基衍生物本身证明了我们描述的 DNApolβ 抑制作用的普遍、不分青红皂白的模式。这有利于我们的假设，即这种现象中的关键作用完全属于小 DNA 片段的分子大小，而不管它们的一级结构特性如何。
所提到的配体多样性无法仅通过常规对接（“互补”）范式来解释配体-酶复合物的形成。这种 DNA-蛋白质结合行为可能涉及一些随机出现的氢键、库仑超精细耦合以及分散相互作用，最后同样重要的是疏水连接，也可能是这种情况下的情况。该模型的一个关键点来自同源多核苷酸相关数据，并揭示了这些“弱”相互作用的平均能量取决于配体的长度而不是其结构。
只要先出现随机出现的局部 DNA 损伤，DNA 修复过程中就会发生类似的事件。在这种情况下，配体-酶偶联的明显不分青红皂白的模式是适合修复目的的 DNA 片段一级结构不可预测的可变性的结果。
因此，单独的多核苷酸长度是对 DNApolβ 催化功能产生影响的因素。该因素可能决定了上述“弱”非共价相互作用的形成，因此可以控制 DNA 聚合酶催化位点内每个 DNA 引物（配体）核苷酸的平均氢键数量。这对于原位酶抑制确实至关重要。
呈现的所有亲和等温线和可变的配体-酶结合数据（图 4-6）揭示了配体大小 50n - 100n 的短间隔内这种奇特的分子间相互作用的最大强度。这是为了确认我们观察到的酶抑制（图 2(B)-(E)，图 3）确实是稳定配体-酶对形成的结果，与溶液性质变化或酶无关周围的分散相位调制。
与 (a) DNApolβ 和 (b) HSA 结合的配体量之间的比较表明，配体-酶复合物包含每个酶分子两个配体分子，而配体-HSA（对照）对每个 HSA 仅包含一个配体分子（图 4、图 7、图 8）。这有利于β 和 β 样 DNA 聚合酶中存在两个独立的 Mg 2+配位催化位点这一事实 [ 8 ] [ 10 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]。
让我们根据图 4和图 8中列出的数据评估配体-酶复合物解离的活化能值。显然，一个
图 7。在 DNApolβ-HL60/Poly(dT) 50对形成 中受温度影响的配体-酶结合的活化能在钾d≅在钾0- E/ R吨0+ EΔT _/ R吨2个0. 见讨论。
图 8。DNApolβ-HL60/Poly(dT) 50对中的温度依赖性配体结合。L'——DNApolβ，受体；L*—HAS，受体（对照）。有关技术细节，请参阅方法。
K d对温度的依赖性具有明显的 Ahrrenius 模式：
钾d=钾0exp ( - E/ RT _)(1)
其中 R——通用气体常数和 T 酶功能温度。
考虑到与初始 T 0 = 298K 相比测试的温度间隔水平较低，我们将进一步使用线性衰减作为 (1) 中的 T。要估计 E，必须将线性正则性视为：
在钾d≅在钾0- E/ (右吨0) + EΔT _/ R吨2个0(2)
在哪里 ΔT _是实验中的温度变化（图7和图8）。
等式 (2) 显示，在整个测试温度范围内，Poly(dT) 200配体的活化能值 E 为 15 kJ ，而 Poly(dT) 50的相同依赖性包括在 40 附近相互交叉的两个线性分支°C 点，最有可能开始轻微的蛋白质变性（图 7）。一旦温度接近酶功能所需的最佳水平 (25˚C - 35˚C)，方程式 (2) 显示 E 50 = 70 kJ/mole，而在 40˚C 下估计的该值低至 15 kJ/痣（图7). 这里值得注意的一点是，在酶变性启动点 (40˚C) 测得的 E 值与在“惰性”、非抑制性、多聚脱氧核糖核苷酸配体的情况下发现的 E 值完全相同。这支持关于从 40˚C 加热点开始的酶失活蛋白质结构动力学的声明。缺乏两室，“破角”， 钾d= f(吨)对长配体的依赖及其低水平的 E 值与在我们的测试条件下此类序列的 3D 紧凑化的高概率非常一致 [ 7 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 23 ]。
很容易发现，促进抑制的聚 (dNTP) 物种为与 DNApolβ-HL60 的解离提供了相当低的活化能值，ε = 1.40 kJ/mole。这意味着，互补氢键不会促进这些特定聚 (dNTP)-酶复合物的形成，这证明这些对中不存在亲和力特异性、真正的对接链接。最有可能的是，这个显着的 1.40 kJ/mole 值是由 U d色散相关的弱范德华相互作用以及 U q库仑超精细耦合决定的。由于两者 üd~ 1 /r6个在小于 0.4 nm 的距离内，库仑力的电位和有效的屏幕状分离发生 [ 15 ] [ 17 ] [ 23 ] [ 24 ]。这当然也考虑了表面疏水边界，它只不过是所有上述指定力的合作（累积）行为的结果 [ 23 ] [ 24 ]。
因此，Poly(dNTP)/DNApolβ 复合物形成的关键作用属于范德瓦尔斯界，其能量直接对应于 1) 配体-酶对的有效表面或 2) 酶结合配体的长度。
此外，由于 U d分散模式的平均值几乎不依赖于元素组成，并且只要 U q中带电基团的数量- 决定聚（dNTP）配体测试大致相同，非常相似的参数然后应该预期它们的抑制活性。这很好地解释了这些配体的抑制能力对其核苷酸组成缺乏依赖性（图 2(B)-(E)，图 3）。
一次 ε ~ R T，我们可能假设短配体（50n - 100n 或更短）将在整个线性链中与酶分子结合，即通过 Poly(dNTP) 序列的几乎每个核苷酸。
使用 Ahrrenius 方程，我们可以分别评估 Poly(dNTP) 20和 Poly(dNTP) 50的配体-酶结合时间值 τ 之间的比率：
τ20/τ50= exp ( − Δ n ε / R T) ≅10− 7(3)
在哪里 Δ = 30（50n 和 20n 之间的长度差异）。表明结合时间短 τ20不允许n 20 -配体促进酶活性的急剧抑制。配体“邻近”酶催化位点的时间越短，表达的抑制作用越小。
另一方面，测试的最长配体也被发现是一种相当差的抑制剂（图 2 (E)、图 4），因为它们的紧凑化导致酶-配体有效相互作用的小方块 [ 23 ] [ 25 ] 作为从等式（3）也可以看出。
根据测试的 RNA 样配体显示的零抑制作用（图 3 (A) 和图 3 (B)），它们显着的重折叠能力 [ 18 ] [ 25 ] 和 [– O-----Mg 2+ ]协调输入 [ 26 ] [ 27 ] 大概超出了这种现象。
寡核苷酸和聚脱氧核糖核苷酸的明显药理学潜力是自 1990 年代初以来进行的大量实验和临床研究的主题 [ 18 ] [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]。然而，它们的应用医学意义主要通过关注适体特性来处理，即寻找特定目标分子（如信号蛋白、膜受体、染色质结构元素等）的能力 [17] [26 ] [ 28 ] [ 30 ] ] [ 31] 。因此，与我们目前的工作不同，这些研究都是关于真正的对接参与者。我们发现的聚 (dNTP) 物种的抑制能力与其结构和组成无关，完全取决于分子大小（图 2(B)-(E)、图 3(A)、图 3 ( C )、图3 (D)，图 3 (E)）。这允许通过关注关于如何关闭恶性细胞中的 DNA 修复的 Poly(dNTP) 运动，在多核苷酸医学应用的长期记录中“翻页”。重要的 DNA 修复酶 DNApolβ 在高频率的 DNA 损伤和癌症相关细胞增殖率增加后过度表达，这很有意义 [ 2 [3 ][ 10 ][ 11 ][ 20 ]。关于这一说法，已经强调该酶家族的成员是细胞抑制抑制剂（如 dNTP 抗代谢物 [8][9][10][28][32 ]和磁性金属同位素的“合法目标” [ 1 ][ 2 ][ 3 ][ 24 ]。
除了抑制由二价金属的磁性同位素——25 Mg、43 Ca 和67 Zn [ 1 ][ 2 ][ 3 ][ 9 ][ 24 ]提供的癌症过度表达的 DNApolβ 物种外，人们对分子机制有了足够的了解。. 特别是，这些机制正在处理起源“太短”、DNA 修复不足、DNA 片段 [ 1 ][ 2 ][ 3 ]。这种效应导致大量释放与 DNA 修复相关的 40n - 100n DNA 序列，这些序列具有不可预测的独特结构 [ 1 ][ 2]，即这会激发磁性同位素诱导 DNApolβ 内源性抑制剂的形成。这看起来像是对磁性金属同位素在几种癌细胞中显示的细胞生长抑制活性的一个很好的解释 [ 1 ] [ 24 ]。
我们对各种基于 DNA 的药物和药效团的药代动力学了解表明，它们的生物利用度远非完美，主要是因为不可避免的核酸酶攻击 [18] [27] [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]。因此，这是管理将聚 (dNTP) 序列定向递送至 DNApolβ 原位操作区室的最艰巨任务，为此需要某些特定的纳米载体 [7] [18 ] [ 30 ] [ 33 ]。至于磁性金属离子，它们可以在 [ 1 ] [ 24 ] 甚至没有 [ 2] [3 ] nanocationite administration 这将使磁性同位素效应成为获得肿瘤中 DNA 修复机制故障的有前途的工具。
知道25 Mg的丰度相对较高 (≈10%) 并考虑到镁在酶促磷酸化过程中的显着作用 [ 1 ] [ 24 ] [ 34 ] ，假设存在所谓的“隐藏”是合乎逻辑的镁 25 对许多代谢途径的影响。在这种情况下，活生物体细胞和组织中高含量的内源性Fe 2+成为抑制体内磁性同位素效应任何表达的天然限制因素。这与线粒体中受25 Mg 2+影响的 ATP 合成水平与 Fe 2+之间相关性的数据一致从不同的大鼠组织中分离出的这些线粒体的含量 [ 34 ] 以及结果表明，在几种类型的癌症（卵巢癌、肾腺癌、成纤维细胞肺癌、肝细胞癌、骨肉瘤、甲状腺滤泡性腺癌）中 Fe/Mg 比率增加) 与相应的正常非恶性组织相比 [ 9 ] [ 20 ] [ 26 ] [ 32 ] 。
各种临床病例报告显示肿瘤患者血浆中出现短 (100n - 300n) 单链 DNA 片段 [ 26 ][ 35 ] 现在也可以根据可能的 DNA 修复相关的观点进行治疗这些肿瘤释放的 Poly(dNTP) 序列的来源。
最后同样重要的是，臭名昭著的群体感应现象 [ 36 ] 可以用于揭示我们在测试不同聚 (dNTP) 物种影响某些肿瘤特异性 DNA 修复关键酶的能力时发现的生物学意义。
5。结论
发现超短 (40n - 100n) 多聚脱氧核糖核苷酸是来自几种癌细胞染色质的 DNA 聚合酶 β 的有效非特异性抑制剂：HL-60、WERI-1A、Y-79。
这些抑制能力与酶-配体对中的亲和力强度呈正相关，这种聚 (dNTP) 物种促进了酶催化的急剧抑制，无论其一级结构如何。只有分子大小很重要。
所提供的数据表明，一旦某些短 ssDNA 实体即将与关键的 DNA 修复酶相互作用，它们就具有明显的监管潜力。
这可能为进一步研究提供一个有前途的平台，旨在关闭恶性肿瘤中的 DNA 修复机制。
致谢
这项工作是在俄罗斯联邦科学和大学教育部支持的 2014-2020 年科学和技术趋势重点专业计划的目标和范围内进行的。RF 政府预算超出。
缩略语
ssDNA，单链 DNA；
DNApolβ，DNA聚合酶β；
MIE，磁同位素效应；
AML，急性髓性白血病。
利益冲突
作者声明本文的发表不存在利益冲突。
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