蛋白酶是重要的工业酶，由于其在食品、饲料、纺织和制药行业的大量应用，约占全球酶市场总量的60%。盐胁迫对黄曲霉和黑曲霉蛋白酶产生的影响进行了评估。通过逐步优化培养参数，特别是碳源、氮源、pH 和深层发酵过程的温度，同时使用最少的盐培养基和酪蛋白作为蛋白酶活性的底物，提高了酶的产量。发现真菌物种在 4% 盐胁迫条件下是酸性和碱性蛋白酶的良好生产者。黄曲霉产碱性蛋白酶的最适培养条件分别为 4% 蔗糖、1% 蛋白胨、40 ° C pH 8，最大酶活性为 8.85 mM/min/mg 蛋白质、5.22 mM/min/mg 蛋白质、3.75 mM/min/mg 蛋白质和 1.64 mM/min/毫克蛋白质，分别。4%乳糖、1%蛋白胨、50 ° C pH 6为黄曲霉产酸性蛋白酶的最佳培养条件，最大酶活性为4.59 mM/min/mg蛋白、2.06 mM/min/mg蛋白、1.24 mM/ min/mg 蛋白质和 1.23 mM/min/mg 蛋白质。对于黑曲霉，产生碱性蛋白酶的最佳培养条件为玉米淀粉 4%、酵母提取物 1%、pH 6 在 40 °C 的最大酶活性分别为 5.99 mM/min/mg 蛋白质、3.85 mM/min/mg 蛋白质、6.18 mM/min/mg 蛋白质和 3.72 mM/min/mg 蛋白质。而乳糖4%、酵母提取物1%、pH 6、50 ℃是黑曲霉产酸性蛋白酶的最佳培养条件，最大酶活性为4.81 mM/min/mg蛋白、0.93 mM/min/mg蛋白、5.71分别为 mM/min/mg 蛋白质和 3.34 mM/min/mg 蛋白质。
关键词
蛋白酶,盐胁迫,发酵,酶,优化
一、简介
微生物蛋白酶是降解酶，催化蛋白质的完全水解 [ 1 ]。蛋白酶是最重要的工业用酶，约占全球酶市场总量的 60%，约占全球酶销售总量的 40% [ 2 ]。它们在用于去除蛋白质污渍的洗涤剂生产中非常重要 [ 3 ][ 4]. 在乳制品工业中，蛋白酶用于凝固牛奶蛋白形成凝乳，用于制备奶酪。在食品工业中，蛋白酶对于改善蛋白质的功能、营养和风味特性至关重要，尤其是在烘焙中，它们被用来降解面粉中的蛋白质，用于制作饼干、薄脆饼干和饼干。在制药工业中，蛋白酶也有广泛的应用，例如治疗凝血障碍 [ 5 ] 以及消化的生产和炎症和毒性伤口的某些医学治疗 [ 6 ]。
根据 Oyeleke 等人的说法。(2010)，细胞外蛋白酶可以通过发酵过程从植物、动物和微生物等各种来源中分离出来 [ 7 ]。虽然大多数商业蛋白酶源自芽孢杆菌属的细菌，但真菌比细菌表现出更多种类的蛋白酶。真菌是蛋白酶的首选来源，因为它们的培养空间有限、生化多样性及其对基因操作的易感性 [ 8 ]。此外，真菌通常是 GRAS（通常被认为是安全的）菌株，它们产生胞外酶，可以很容易地从发酵液中回收 [ 9 ]。
丝状真菌有可能在不同的环境条件下生长，例如时间进程、pH 值和温度，利用各种各样的底物作为营养物 [ 1 ]。发酵培养基的环境条件在微生物种群的生长和代谢生产中起着至关重要的作用。其中最重要的是培养基、培养温度和 pH 值。据报道，发酵培养基的 pH 值对蛋白酶的产生有重大影响 [ 10]. 它可以通过影响营养物质的可用性间接地或通过对细胞表面的作用直接影响微生物的生长。另一个重要的环境因素是培养温度，这对微生物产生蛋白酶很重要。众所周知，较高的温度会影响产生蛋白水解酶的微生物的代谢活动 [ 11 ]。然而，一些微生物产生在较高温度下具有活性的热稳定蛋白酶。酶的热稳定性可能是由于某些金属离子的存在或在较高温度下进行其生物活性的适应性 [ 1 ] [ 10 ]]. 在蛋白酶的生产中，它已被证明是可诱导的，并受发酵中使用的碳源和氮源的性质影响。因此，选择合适的碳源和氮源也很重要。
本研究旨在确定黄曲霉和黑曲霉在4%盐胁迫下产胞外蛋白酶的最适pH、最适温度、最佳碳源和最佳氮源。
2。材料和方法
2.1. 使用的化学品
水合硫酸镁 (MgSO 4 ∙7H 2 O)、水合硫酸铁 (II) (Fe 2 SO 4 ∙ 7H 2 0)、氯化钠 (NaCl)、乙醇、磷酸二氢钾 (K 2 HPO 4 ) 和二氢一钾磷酸盐 (KH 2 PO 4 ) 购自 BDH 化学品公司（美国费城）。三氯乙酸（TCA）、醋酸钠（CH 3 COONa）、碳酸钠（Na 2 CO 3)、Folin-Ciolcalteau 试剂、牛血清白蛋白 (BSA) 和酪氨酸标准品购自 Sigma-Aldrich 化学公司（St. Louis, MO, USA.）。马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)、玉米淀粉、麦芽糖、乳糖、蔗糖、酵母提取物、蛋白胨和尿素为分析标准品，购自阿库尔联邦技术大学 (FUTA) 生物化学系实验室，Ondo州, 尼日利亚.
2.2. 测试生物
用于这项研究的黄曲霉和黑曲霉是从 FUTA 微生物学部的培养库中收集的。纯种群在 PDA 上生长 72 小时 (h)，并反复传代培养以获得用于本研究的微生物纯培养物。将纯培养物在冰箱中的琼脂斜面上储存 72 小时，并在每 72 小时后传代培养。
2.3. 发酵
深层发酵在250ml锥形瓶中进行，含有：碳源4%，氮源1%，MgSO 4 ∙7H 2 O 0.05%，KH 2 PO 4 0.05%，Fe 2 SO 4 ∙7H 2O 0.001%、NaCl 4%、pH 6。这些在 121˚C 和 15 psi 压力下高压灭菌 20 分钟。冷却后，在无菌条件下接种黄曲霉和黑曲霉。Erlenmeyer 烧瓶在 RSB-12 Remi 实验室水浴摇床（印度马哈拉施特拉邦）中以 150 rpm 的速度搅拌 72 小时，以促进真菌的浸没生长，进而促进目标酶的产生。发酵后，将培养液在 TGL-16M 台式高容量冷冻离心机（中国上海）中于 4˚C 下以 5000 rpm 离心 20 分钟。上清液用作粗酶提取物。同时，在每种情况下研究的发酵参数是变化的，而其他发酵参数保持不变。
2.4. 蛋白质浓度的测定
每个粗制酶样品的蛋白质浓度通过 Bradford [ 12 ]的方法使用 BSA 作为标准分光光度法测定。
2.5. 蛋白酶活性测定
使用酪蛋白作为底物，通过 Anson [ 13 ]的改进方法测定蛋白酶活性。一个酶活性单位定义为在规定条件下每毫升/分钟释放一微摩尔酪氨酸的酶量。
2.6. 碳源对蛋白酶生产的影响
不同碳源对黄曲霉和黑曲霉胞外蛋白酶产生的影响是通过改变所用的碳源来确定的。玉米淀粉在正常测定培养基中被蔗糖、乳糖和麦芽糖替代，而其他条件在实验期间保持不变。
2.7. 氮源对蛋白酶生产的影响
有机氮源——酵母提取物、蛋白胨和尿素——被用作基本盐培养基中的氮源，以确定从黄曲霉和黑曲霉中生产胞外蛋白酶的最佳氮源。其他条件在实验过程中保持不变。
2.8. pH 值对蛋白酶产生的影响
最低盐培养基的 pH 值在 pH 5 到 pH 9 之间变化，以确定黄曲霉和黑曲霉产生蛋白酶的最佳 pH 值。通过使用50mM K 2 HPO 4或50mM KH 2 PO 4调节培养基的pH 。其他条件保持不变。
2.9. 温度对蛋白酶生产的影响
通过在 40˚C、50˚C、60˚C、70˚C 和 80˚C 下培养发酵瓶，确定了温度对黄曲霉和黑曲霉胞外蛋白酶产量的影响。其他条件保持不变。
2.10. 统计分析
Microsoft Excel 2016 用于分析从本研究中获得的数据。
3. 结果
3.1. 碳源对蛋白酶生产的影响
蔗糖提供最高的酶活性，8.85 mM/min/mg 蛋白质，作为从黄曲霉产生胞外碱性蛋白酶的碳源。但酶活性为 5.99 mM/min/mg 蛋白质的玉米淀粉是从黑曲霉中产生胞外碱性蛋白酶的最佳碳源（图 1 ）。然而，当乳糖用作从黄曲霉和黑曲霉生产胞外酸性蛋白酶的碳源时，乳糖的酶活性最高，分别为 4.59 mM/min/mg 蛋白质和 4.81 mM/min/mg 蛋白质（图 2 ）。
图 1。在 pH 8 的含有酪蛋白的培养基中，黄曲霉和黑曲霉产生胞外蛋白酶的碳源变化。
图 2。在 pH 4.8 的含有酪蛋白的培养基中，黄曲霉和黑曲霉产生胞外蛋白酶的碳源变化。
3.2. 氮源对蛋白酶生产的影响
蛋白胨是从黄曲霉中产生胞外碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的最佳氮源，其酶活性分别为 5.22 mM/min/mg 蛋白质和 2.06 mM/min/mg 蛋白质（图 3 和图4 ）。然而，酵母提取物对于来自黑曲霉的细胞外碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的产生分别给出了 3.85 mM/min/mg 蛋白质和 0.93 mM/min/mg 蛋白质的最高酶活性（图 3 和图4 ）。
图 3。在 pH 8 的含有酪蛋白的培养基中，黄曲霉和黑曲霉产生胞外蛋白酶的氮源变化。
图 4。在 pH 4.8 的含有酪蛋白的培养基中，黄曲霉和黑曲霉产生胞外蛋白酶的氮源变化。
3.3. pH 值对蛋白酶产生的影响
当生产 pH 为 8（图 5）时，黄曲霉胞外碱性蛋白酶的最佳产量为 3.75 mM/min/mg 蛋白质，而 pH 6 的胞外蛋白酶产量最高，为 1.24 mM/min/mg 蛋白质来自黄曲霉的酸性蛋白酶（图 6）。对于黑曲霉，最佳
图 5。在 pH 值为 8 的含有酪蛋白的培养基中，黄曲霉和黑曲霉产生胞外蛋白酶的 pH 值变化。
图 6。在 pH 4.8 的含有酪蛋白的培养基中，黄曲霉和黑曲霉产生胞外蛋白酶的 pH 值变化。
用于生产胞外碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的pH为pH 6，最佳产量分别为6.18 mM/min/mg蛋白质和5.71 mM/min/mg蛋白质（图5和图6 ）。
3.4. 温度对蛋白酶生产的影响
来自黄曲霉和黑曲霉的胞外碱性蛋白酶的生产在 40˚C 下进行了优化，酶活性分别为 1.64 mM/min/mg 蛋白质和 3.72 mM/min/mg 蛋白质（图 7 ）。然而，黄曲霉和黑曲霉胞外酸性蛋白酶的生产在 50˚C 下进行了优化，酶活性分别为 1.23 mM/min/mg 蛋白质和 3.34 mM/min/mg 蛋白质（图 8 ）。
图 7。在 pH 8 的含有酪蛋白的培养基中，黄曲霉和黑曲霉产生胞外蛋白酶的温度变化。
图 8。在 pH 4.8 的含有酪蛋白的培养基中，黄曲霉和黑曲霉产生胞外蛋白酶的温度变化。
4。讨论
在本研究的初步阶段，对于黄曲霉和黑曲霉产生的碱性和酸性蛋白酶，基本盐培养基中的 NaCl 浓度以 2% 的间隔从 0% 到 6% 变化（图 S1 ）。结果表明，当曲霉菌属时，产生了最大的细胞外碱性和酸性蛋白酶。4%盐胁迫。4% 的盐胁迫能够为真菌物种创造等渗环境，这反过来又支持细胞生长和蛋白酶生产。
据报道，不同微生物产生的胞外蛋白酶会受到发酵条件的强烈影响。有几篇报道表明，不同的碳源对不同微生物的胞外蛋白酶产生有不同的影响[ 14 ]。其他使用不同糖（如乳糖、麦芽糖、蔗糖和果糖）的工作人员已报告碱性蛋白酶产量增加 [ 15 ] [ 16 ]]，虽然没有受到盐胁迫。我们的研究证实了这些报告。乳糖是黄曲霉和黑曲霉产生胞外酸性蛋白酶的最佳碳源；而蔗糖和玉米淀粉分别是黄曲霉和黑曲霉胞外碱性蛋白酶的最佳碳源。
库马拉等。(2012) 表明有机氮源有利于微生物蛋白酶的生产。他们报道称，蛋白胨和酵母提取物是从微生物中产生胞外蛋白酶的理想氮源 [ 17 ]。在这项研究中，蛋白胨是黄曲霉的最佳氮源，而酵母提取物是黑曲霉在真菌中产生碱性胞外蛋白酶和酸性胞外蛋白酶的最佳氮源。这与 Kumara 等人的研究结果一致。(2012)。
微生物菌株的蛋白酶生产强烈依赖于细胞外 pH 值，因为培养物 pH 值强烈影响许多酶促过程和各种成分跨细胞膜的运输，这反过来又支持细胞生长和产物生产 [18 ]。在这项研究中，黄曲霉和黑曲霉的胞外碱性和酸性蛋白酶的生产在 6 - 8 的 pH 范围内进行了优化。在低于或高于该范围的 pH 值下，蛋白酶的蛋白质结构可能会发生变化，从而导致酶活性明显下降。
温度是影响酶的重要因素。Paranthaman 等人。(2009) 报道说，在 35˚C 下进行的发酵最适合真菌蛋白酶的生产 [ 6 ]。据报道，较高的温度会对微生物的代谢活动产生一些不利影响，还会抑制真菌的生长 [ 11]]. 在这项研究中，黄曲霉和黑曲霉的胞外碱性和酸性蛋白酶的生产在 40˚C - 50˚C 的温度范围内进行了优化。高于此温度范围，黄曲霉和黑曲霉的代谢活动将受到不利影响，其细胞生长将受到抑制。此外，它们的酶会变性，因为在更高的温度下，酶结构中的弱氢键会被破坏。据我们所知，这项研究首次优化了在盐胁迫下从黄曲霉和黑曲霉中产生胞外酸性和碱性蛋白酶的培养条件。
工业上有用的生物催化剂的持续采购和生产对于生物技术过程的进步总是很重要的。总之，本研究中采用的盐胁迫条件有利于增强黄曲霉和黑曲霉中酸性和碱性蛋白酶的细胞外产生，这在工业过程中具有相当大的重要性。
作者的贡献
所有作者都对方法论的发展做出了贡献。MOO 和 OSB 进行了实验。所有作者都分析并解释了数据。MOO 写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终手稿，并同意对工作的各个方面负责。
补充
图S1。在 pH 7.0 的含有酪蛋白的培养基中，黄曲霉和黑曲霉产生胞外蛋白酶的盐浓度百分比变化。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
[ 1 ] Ikram-Ul-Haq、Mukhtah, H. 和 Umber, H. (2006) 通过优化环境条件用产黄青霉生产蛋白酶。农业与社会科学杂志，2, 23-25。
[ 2 ] Chouyyok, N.、Wongmongkol, W.、Siwarungson, N. 和 Prichnont, S. (2005) 使用水性两相系统从无细胞枯草芽孢杆菌 TISTR 25 发酵液中提取碱性蛋白酶。过程生物化学，40， 3514-3518。
[ 3 ] Sana, B.、Ghosh, D.、Saha, M. 和 Mukherjee, J. (2006) 从孙德尔本斯海洋环境中分离出的一种新型伽玛变形杆菌中耐盐、溶剂、去污剂和漂白剂的蛋白酶的纯化和表征. 过程生物化学，41, 208-215。
[ 4 ] Kumar, D.、Savitri, N.、Verma, TR 和 Bhalla, TC (2008) 微生物蛋白酶及其作为洗衣粉添加剂的应用。微生物学研究杂志，3， 661-672。
[ 5 ] Sumantha, A.、Larroche, C. 和 Pandey, A. (2006) 食品级蛋白酶的微生物学和工业生物技术：一个视角。食品技术和生物技术，44，211-220。
[ 6 ] Paranthaman, R.、Alagusundaram, K. 和 Indhumathi, J. (2009) 通过黑曲霉在固态发酵中从碾米废料中生产蛋白酶。世界农业科学杂志，5， 308-312。
[ 7 ] Oyeleke, SB、Egwim, EC 和 Auta, SH (2010) 用于胞外蛋白酶生产的黄曲霉和烟曲霉菌株的筛选。微生物学和抗菌药物杂志，2， 83-87。