壳聚糖酶 EAG1 是来自 Bacillus ehimensis 的经典糖苷水解酶。前人研究表明,该壳聚糖酶不仅可以将壳聚糖的b1,4-糖苷键水解成不同大小的COS,而且在有机物中保持较高的催化活性,可用于生产壳寡糖和GlcN,用于食品和药理。行业。而它在液态下不稳定。这一缺点严重制约了其工业应用。在这里,我们使用 EAG1 的建模结构和分子建模软件包来筛选免费化学数据库 ZINC。此外,还采用了包括“初始过滤器”和共识评分在内的策略来加快流程并提高虚拟筛选的成功率。最后,筛选了五种化合物,并购买或合成了它们以测试它们对 EAG1 的结合亲和力。试验结果表明,其中一种对酶有抑制作用,表观Ki为1.5 μM。该结果可为进一步筛选和设计针对EAG1的抑制剂奠定基础,筛选出的化合物也有助于提高EAG1的液体稳定性,拓展其工业应用。
关键词
壳聚糖酶,抑制剂,虚拟筛选
一、简介
壳聚糖酶属于糖苷水解酶家族 5、7、8、46、75 和 80,水解氨基葡萄糖聚合物是通过几丁质的部分或完全脱乙酰化产生的 [ 1 ]。它们在利用大量壳聚糖和几丁质底物方面具有重要的工业应用,这些底物可从海产品加工装置中获得,用于生成制药行业特别需要的特定尺寸的壳聚糖低聚物 [ 2 ]。在工业酶应用中,稳定性是一个关键因素。为了提高酶的稳定性,许多蛋白质工程技术,如随机诱变、DNA 改组、截短和环化,已被开发用于提高蛋白质的稳定性 [ 2 ]]. 然而,目前还没有任何工作着眼于通过添加抑制剂来提高壳聚糖酶的液体稳定性。该技术已用于蛋白酶。现有技术广泛涉及提高储存稳定性,例如,通过添加蛋白酶抑制剂[ 3 ][ 4 ][ 5 ]。高浓度液体酶制剂在工业上的应用将成为未来的发展方向。
VS 是一种通过应用有关蛋白质靶标(基于结构的 VS)或已知生物活性配体(基于配体的 VS)的知识,通过计算手段从大型化学库中识别新命中(即生物活性分子)的技术。基于配体的方法利用来自一组已知活性物质的结构-活性数据来识别用于实验评估的候选药物。在前期研究中,研究人员采用虚拟筛选的方法筛选了蛋白酶MP的抑制剂,得到的抑制剂显着提高了酶制剂的稳定性[ 6 ]。EAG1 是来自Bacillus ehimensis的经典糖苷水解酶, 它在 50˚C 时表现出最大活性。它不仅能将壳聚糖的b1,4-糖苷键水解成不同大小的COS,而且在含有金属离子的有机溶剂中也保持较高的催化活性[ 7 ]。在之前的研究中,其三级已被建模 [ 8 ] 并且柔性区域中的二硫键可以提高 EAG1 的热稳定性和催化效率 [ 7 ]。然而,它在液态下不稳定,这是所有酶的共同缺点。
在本研究中,我们专注于壳聚糖酶 EAG1 抑制剂的数据库筛选、生物学评价和机制阐明。我们的虚拟筛选方法基于对 ZINC [ 9 ][ 10 ]数据库中约 23,000,000 种市售化合物的库执行的初始高通量对接计算。利用Autodock4.2的重新编译软件对接产物,共识评分,以及基于已知壳聚糖酶抑制剂的实验和对接结果构建的特殊过滤策略,提高了抑制剂发现的成功率。在体外合成并测定了三种化合物。其中之一可以通过明显的K抑制 EAG1i 为 1.5 mM,可用于进一步的抑制机制检测。这一发现为进一步选择和合成更有效的壳聚糖酶EAG1抑制剂提供了依据。
二、材料与方法
对接研究和“初始过滤器”构建
EAG1 [ 7 ] 的结构在之前的工作中被建模,并阐明所有残基都在接受区。建模结构被定义为受体。使用 AutoGrid 定义活性位点,并根据口袋中关键残基的位置选择框的中心(37.286、4.2688、25.31)。网格大小设置为 60 × 60 × 60 点,网格间距为 10 Å(图 1)。网格框包括酶的整个结合位点,活性位点的残基在整个对接过程中被设置为灵活的。小分子被定义为配体,小分子被设置为柔性配体。也就是说,所有的旋转债券都被释放了。
Autodock4.2 程序已被证明是一种稳健的方法,在抑制剂 [ 11 ] [ 12 ]的对接中具有良好的对接精度和可靠性。并且使用 Autodock Tools (ADT) [ 13 ] 来制备分子,并使用 REDUCE [ 14 ] 添加所有氢气。根据均方根偏差 (RMSD),所有对接诱饵均以截止值 2 聚类。
以往对壳聚糖酶抑制剂的研究表明,一些化合物具有良好的壳聚糖酶抑制剂能力(表1)。因此,我们使用这些化合物来训练角色,并为虚拟筛选构建了一个“初始过滤器”。所有的角色设置都和上面提到的步骤一样。这些化合物的三级结构列于图 2中。这些结构是从 Chemspider [ 15 ] (http://www.chemspider.com/) 下载的。
化合物 | Ki ( μM) | 对接K i (μM) | 对接E i (kcal/mol) |
苯扎氯铵 | 2.36 | 8.89 | −4.16 |
2-羟基-5-硝基苄基溴 | 0.42 | 2.85 | −8.14 |
N-溴代琥珀酰亚胺 | 0.07 | 0.93 | −15.41 |
乙酸钠 | 0.48 | 2.29 | −8.62 |
对氯苯甲酸汞 | 0.20 | 1.61 | −9.54 |
对羟基苯甲酸 | 0.16 | 1.46 | −10.69 |
2-巯基乙醇 | 0.02 | 0.49 | −12.64 |
焦碳酸二乙酯 | 0.03 | 0.67 | −13.05 |
乙酰亚胺酸乙酯 | 1.40 | 8.07 | −5.03 |
乙二胺四乙酸 | 1.92 | 8.67 | −5.69 |
氨基葡萄糖 | 0.32 | 2.11 | −8.14 |
海卫 X-100 | 0.09 | 1.05 | −14.48 |
半胱氨酸 | 1.82 | 8.51 | −5.54 |
吐温20 | 0.07 | 0.97 | −14.01 |
盐酸胍 | 0.38 | 2.74 | −7.64 |
吐温80 | 0.06 | 0.89 | −13.80 |
单碘乙酸盐 | 0.91 | 5.72 | −6.08 |
表 1。训练集中化合物的实验K i和对接K i、 E i值。
图 1。对接区。EDG1 的结构以卡通形式显示,对接区以红色球显示。该图由 Discovery Studio Client 4.2 生成。
图 2。训练集中壳聚糖酶抑制剂的化学结构。
对羟基汞苯甲酸、2-巯基乙醇、焦碳酸二乙酯、N-溴代琥珀酰亚胺、葡萄糖胺、Triton X-100、2-羟基-5-硝基苄基溴、吐温 20、吐温 80 和盐酸胍,它们抑制 EAG1 的K i值来自0.02~0.48,均不是有效的抑制剂。因为他们形成的复合体并不稳定。相比之下,苯扎氯铵抑制能力强,不适合作为提高EAG1稳定性的抑制剂。我们使用 Autodock4.2 将这些化合物对接到 MP。提取最喜欢的簇的E i和K i的对接值并列于表1中。综合以上因素,对接的限制条件E i不小于-6.00 kcal/mol且不大于-5.00 kcal/mol,对接K i不小于8μM且不大于9μM被设置为EAG1抑制剂选择的“初始过滤器”。
虚拟对接筛选结合共识评分
包含约 2,300,000 种化合物的免费市售化合物数据库 ZINC 被用作对接库。对接库中包含的这些化合物的三级结构严格从 ZINC 数据库下载。那些对接能量分数和K i分数都满足选择条件(-6.000 ≤ E i ≤ -5.000,8 ≤ K i ≤ 9)的化合物被选为主要选择列表。在这次选择之后,通过对接分数从对接库中选择了大约 5000 个化合物。
X-score [ 16 ] 程序计算给定配体分子与其靶蛋白的结合亲和力,用于在“初始过滤”筛选后重新评估主要选定的分子。计算出的分数值可以在一定程度上消除单一对接造成的分值偏差,被认为更准确,更可能反映实际的结合能力。然后通过 Xcscore 计算并重新评估 5000 种化合物的多种构象,以生成最终的“命中列表”。所有计算得分高于 5.0 且在对接E i和 Xcscore 结果中排名前 500 的化合物都保留在命中列表中。最后,选择前三种化合物(表 2)并购买用于进一步分析。
壳聚糖酶测定
酶纯化
EAG1 通过超滤膜和 Ni 2+负载的 1 ml His Trap FF 粗柱(GE Healthcare)纯化,根据 Sheng等 人的方法。[ 7 ] 壳聚糖酶的活性是在 40˚C 下通过使用改良的二亚硝基水杨酸 (DNS) 方法估算糖的还原端的量来测定的,以氨基葡萄糖·HCl 作为校准标准。在含有 100 mM 醋酸盐缓冲液、0.2% 壳聚糖和适当稀释的酶的 0.2 m L 反应混合物中测量。1个壳聚糖酶单位定义为在上述条件下每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量。每次分析进行三次重复。
使用壳聚糖作为底物,在 40˚C 下研究了抑制剂对 EAG1 活性的影响。酶与抑制剂预孵育 5 分钟。测量在 200 μL 最终体积、40˚C 的 100 mM 乙酸盐中进行
化合物 | 对接能量 (kcal/mol) | 对接基_ | Xscore | Ki ( μM) |
锌00344328 | 168.04 | −5.15 | 6.87 | |
锌20476815 | 124.22 | −5.33 | 6.36 | 1.50 |
锌02961282 | 101.33 | −5.45 | 6.21 |
表 2。候选人的对接分数、X 分数和实验K i值。
缓冲液 (pH 6.0),酶浓度为 50 ng/mL。PPO 的米氏常数 (Km) 由 Lineweaver-Burk [ 17 ] 图确定,Ki 值由 Dixon 图 [ 8 ] 获得。
抑制剂
使用 Succ 在 30˚C 下研究了抑制剂对 MP 活性的影响。Ala-Ala-Pro-Arg-AMC 作为底物。酶与抑制剂预孵育 5 分钟。测量在 200 μL 最终体积、30˚C 下在酶测定缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、10 mM CaCl 2、0.1 M NaCl)中以 5 - 30 ng/mL 酶浓度进行。在 380 nm 激发波长和 460 nm 发射波长下测量荧光底物的活性 [ 18 ]。MP的米氏常数 ( K m ) 由 Lineweaver-Burk 图和K i确定值是从狄克逊图获得的。硼酸及其衍生物诱导竞争性抑制。为了描述竞争抑制机制,双倒数形式的 Lineweaver-Burk 方程可以写成:
1个ν一世=钾米V最大限度( 1 +[我]钾一世)1个[小号]+1个V最大限度(1)
次要地块可以从
钾一个p _米=钾米[我]钾一世+钾米(2)
然后,可以从上述等式导出K i、K m和V max值。表观K m与 [I] 的二次重绘是线性拟合的,假设有一个抑制位点或一类抑制位点 [ 19 ]。
3。结果与讨论
测试了从虚拟筛选中分离出的化合物对 EAG1 的抑制作用。选择并排序(或合成)来自命中列表的前三个 Xscore 化合物(表 2 )。然后,通过上述测定方法测量它们的结合亲和力。在我们的实验中,测试了这三种化合物的抑制亲和力。其中,一种选定的化合物被证明可以有效抑制 EAG1 的活性。该化合物的K i值经实验确定为 1.50 μM。它是 EAG1 的可逆抑制剂。
在本研究中采用的条件下,水解遵循 Michaelis-Menten 动力学。从Lineweaver-Burk plot(图3 ,曲线-◆-)得到该酶的动力学参数,结果表明K m和V m分别为4.97 μM和3.5772 μM/min。
使用双倒数 Lineweaver-Burk 图研究酶在抑制剂存在下的动力学。结果(图 3)显示V m的值保持不变,而K m的值随着抑制剂浓度的增加而增加,表明所选化合物诱导了竞争性抑制。使用等式(1)和(2),计算了K i。
图 3。1/ v与 1/[S] 的关系图。ZINC20476815 的浓度分别为 0 (-◆-)、0.50 (-■-)、1.00 (-▲-) 和 2.00 (-●-) μM。图中标注为绝对误差。插图是K m与 [ I ] 的关系图,以确定K i。
4。结论
按照虚拟筛选和停靠后评分程序,选择并购买了三种可能的化合物用于生物测试。其中之一被发现在毫摩尔范围内抑制 EAG1。这些活性化合物是开发 EAG1 抑制剂的基础。总的来说,我们的结果提供了另一个证据,证明具有改进的评分功能的自动化 AutoDock 程序作为从头发现抑制剂的对接程序的 有效性。本研究寻找EAG1抑制剂的方法可能进一步指导EAG1抑制剂的开发。
致谢
【基金】:枣庄市自主创新与高新技术成果转化项目(2019GH01)
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
[ 1 ] Vincent, L.、Hemalatha, GR、Elodie, D.、Coutinho, PM 和 Bernard, H.(2014 年)碳水化合物活性酶数据库 (CAZy),2013 年。核酸研究,42,D490-D495。
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