NADH-谷氨酸脱氢酶 (GDH) 在人体组织中具有活性,并且经过色谱纯化和研究,因为它参与神经递质谷氨酸的合成。但是层析分离 GDH 同工酶,后者合成基于非遗传密码的 RNA 酶,降解多余的 mRNA,从而使细胞反应与生物体的环境保持一致。目的是电泳纯化人类六聚体 GDH 同工酶,并表征它们在植物中的 RNA 酶合成活性。结果可能在化学依赖诊断和管理方面具有创新性。多基质电泳包括游离溶液等电聚焦,并通过聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶进行纯化,以纯化喉 GDH 的氧化还原循环同工酶,并测定其 RNA 酶合成活性。喉部 GDH 显示出高等生物典型的 28 种二项式同工酶。等电聚焦纯化产生纯 GDH。GDH 同工酶的氧化还原循环测定产生了降解人胃总 RNA 的 RNA 酶。在反应机制中,α-酮戊二酸和 GDH 之间的席夫碱中间体复合物是亲核试剂的目标,导致谷氨酸和 RNA 酶的合成中断。最强的亲核试剂是烟草、可卡因、罂粟、大麻烟雾中的精神活性生物碱,因为它们能够与 GDH 席夫碱中间体反应,刺激异常 RNA 酶的合成,这些酶会降解 mRNA 队列,从而改变生化途径并加剧药物过量和化学依赖。电泳纯化,
关键词
GDH 电泳酶学,色谱 GDH, 总 RNA-RNA 酶复合物,mRNA 队列,化学依赖性
一、简介
NADH-谷氨酸脱氢酶 (GDH, EC 1.4.1.2) 在包括中枢神经系统在内的人体组织中谷氨酸的转化中很重要 [ 1 ];在前外侧颞叶新皮质和海马组织中的神经传递代谢 [ 2 ];在神经元和星形胶质细胞中从头合成谷氨酸 [ 3 ];在葡萄糖稳态和胰岛素分泌期间的胰腺β细胞和肝细胞中 [ 4 ];和睾丸 [ 5 ],因为它催化 α-酮戊二酸 (α-KG) 还原胺化为谷氨酸,一种兴奋性神经递质。GDH 是人体组织中六聚体同工酶的复杂混合物 [6 ] [ 7 ]; 它作为其解离的亚基多肽 [ 7 ] [ 8 ] 进行色谱纯化,但研究了六聚体的物理化学 [ 9 ]。GDH 由两个非等位基因(GHD 1和 GDH 2)编码,其中 GDH 1编码酸性更强的多肽 (a) 和 ( α ),它们是杂合的和共显性的;和 GDH 2编码酸性较低的多肽 ( β ) 是纯合子 [ 10 ]。三种多肽的二项式分布产生了六聚体同工酶的复杂系统 [ 11 ] [ 12 ]]. 该研究项目的部分目的是了解 GDH 人类六聚体同工酶的酶学和分子化学,以扩大其在改善人类健康方面的潜在生物技术应用。尽管 GDH 六聚体同工酶已在高等植物中得到广泛研究 [ 13 ],但它们尚未在哺乳动物细胞和组织中得到广泛研究。该酶的催化机制涉及在酶活性位点的α -KG 和Lys 残基的ε -NH 2基团之间形成 GDH 连接的席夫碱中间体 [ 14 ]。质子化后,席夫碱氮是包括水分子在内的亲核试剂作用的目标位点, 氨氮+4个、异生素、三磷酸核糖核苷、重金属离子、氨基酸、碳水化合物、脂肪酸等;以及酶的异构化现象,因为异生素(生物碱、矿物离子、吡喃、胺等)与席夫碱氮的结合通过形成 GDH 连接的取代亚胺死端复合物使其失活,这些复合物降解为催化异常碎片[ 11 ][ 14 ][ 15 ]。从头翻译产生新的 GDH 多肽池,这些多肽与降解池有很大不同,从而产生六聚体异构化现象 [ 14 ]。除了α的可逆还原胺化-KG 到 L-glu,GDH 六聚体同工酶在胺化方向上参与模板非依赖性加 RNA 酶和氧化脱氨方向上的负 RNA 酶的循环合成(图 1 )[ 16 ]。GDH合成的基于非遗传密码的RNA酶通过降解病态的多余mRNA来整合/区分生化途径,从而使细胞、组织、整个生物体的发育和代谢需求与生物体的内外环境条件保持一致;这意味着每次细胞、组织或整个生物体的环境发生变化时,GDH 都会合成新的基于非遗传密码的 RNA 酶组,然后降解先前环境中不必要和多余的 mRNA、rRNA、转移 RNA 等 [17 ]。基于非遗传密码的 RNA 比基于遗传密码的 RNA 在静电方面更稳定 [ 18 ],因此当 mRNA 与其同源的基于非遗传密码的 RNA 酶对齐时,mRNA 会发生降解 [ 17 ]。此外,非遗传密码 RNA 酶会降解结构相关的 mRNA 群 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]。因此,本研究的一个目的是应用我们从植物系统研究计划中获得的 GDH 氧化还原循环 [ 16 ](图 1) 扩大对人体细胞和组织中 GDH 交易的理解,尤其是在糖尿病、酒精中毒和麻醉化学品依赖方面;因为包括大麻素在内的精神活性化学物质;阿片类药物、可卡因和烟草生物碱、N-亚硝胺、酒精、杂环胺等 [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] 是强亲核试剂,可能与 GDH 连接的席夫碱中间体反应产生取代的亚胺末端复合物, 注定要进行蛋白水解降解 [ 14 ]。糖尿病、酗酒和化学依赖是技术上无法解释的医学和社会现象和流行病,因为它们仍然导致超过 50 万人死亡 [ 22 ][23 ]。
图 1。NADH-谷氨酸脱氢酶同工酶的氧化还原循环:用于不可逆合成基于非遗传密码的正 RNA 酶在氨基化和脱氨方向负 RNA 酶。
但是解离的 GDH 亚基多肽不能将核糖-NTP 聚合成 RNA。纯化人 GDH 的方法已在化学中进行色谱分析 [ 8 ] [ 9 ] [ 24 ] [ 25 ]]. 有非离液层析方法可用于从哺乳动物组织中纯化未解离的 GDH 六聚体同工酶。因此,基于非遗传密码的 plus-RNA 在胺化过程中的循环氧化还原合成,但在脱氨方向上的负 RNA 需要开发温和的方法来纯化完整的六聚体同工酶。来自肝脏、大脑和心脏的粗提物通过衍生固定相/基质(纤维素、酰肼凝胶、Sepharose、羟基磷灰石等)柱进行纯化。每种色谱基质都需要一种特殊的缓冲溶液,以便 GDH 被差异洗脱,从而使 GDH 亚基多肽面临变性的风险 [ 6 ] [ 7 ] [ 26 ] [ 27 ]] [ 28 ]。因此,所有宣布谷氨酸氧化脱氨的研究项目都保留了聚丙烯酰胺凝胶上的 GDH 氧化还原循环同工酶分布模式,因为亚基多肽在色谱纯化过程中被降解。GDH 是生物化学中的一种古老酶 [ 26 ],但是基于非遗传密码的 RNA 酶对生化途径的调节才刚刚开始被理解 [ 17 ] [ 18 ]。
这些研究计划的共同目标是重置 GDH 生化故事线和前院,以便其六聚体同工酶的氧化还原循环可用于糖尿病、酒精中毒和尼古丁、阿片类药物、大麻素、可卡因滥用流行病的创新管理。在下文中,我们表明电泳可纯化人喉 GDH 六聚体同工酶;它们像在高等植物中一样合成基于非遗传密码的 RNA 酶,并且它们降解同源的多余人类总 RNA,具有从 mRNA 水平改变生化途径的潜在活性。
2。材料和方法
2.1. 游离溶液等电聚焦
来自美国马里兰州 LifeLine Cell Technology 的正常人喉上皮细胞培养物(120,000 个细胞)在 80 mL 15 mM Tris-HCl 缓冲溶液(pH 7.5,含有 20 µL β-巯基乙醇、2 U DNase 1 和 1 U RNase A 以最大速度处理 1 分钟。细胞培养物按原样使用,无需进一步培养。将匀浆在室温下静置 30 分钟,使 DNA 和 RNA 降解。固体沉淀蛋白(NH 4 ) 2 SO 4通过离心(10,000 xg,30 分钟,5˚C)收集 20% 至 55% 饱和度的匀浆。将沉淀重悬于最小体积的 15 mM Tris-HCl pH 7.5 缓冲溶液中,并在 5 L 15 mM Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.5 中透析;在 36 小时内更换缓冲溶液 3 次。
透析提取物用 10 mM Tris-HCl 缓冲液 pH 7.5 补足至 50 mL,并进行 Rotofor(Bio-Rad,Hercules,CA)等电聚焦分级 [ 29 ]。Rotofor 组分在 5 L 10 mM Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.5 中透析,也在 5˚C 下;在 36 小时内更换缓冲液 3 次,以去除两性电解质和尿素。
2.2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
对透析后的 Rotofor 组分的等分试样 (100 µL) 进行 Laemmli [ 30 ] SDS 12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)(100 V,13 小时,4˚C)以去除其他蛋白质。使用 Protean II xi 电泳池(Bio-Rad,Hercules,CA)。电泳胶在 5℃下用 0.15 mM Tris 碱洗 3 次以去除 SDS。随后在室温下用 L-谷氨酸-NAD + -吩嗪硫酸甲酯-四唑蓝试剂 [ 10 ] 对凝胶进行染色。GDH 氧化还原循环同工酶分布模式被照片记录。从 70,000 到 200,000 个喉上皮细胞中提取多次 Rotofor 纯化;获得的所有 GDH 氧化还原循环同工酶在聚丙烯酰胺凝胶上显示出相同的分布模式。
透析后的 Rotofor 馏分的等分试样 (250 µL) 进行天然 7.5% PAGE(100 伏,16 小时,4˚C)以去除污染物(低分子量蛋白质和核酸)。使用 Protean II xi 电泳池(Bio-Rad,Hercules,CA)。使用全凝胶洗脱器(Bio-Rad)在零下温度下从电泳凝胶洗脱 GDH 同工酶。整个凝胶部分用于合成基于非遗传密码的 RNA。还进行了对照天然 7.5% PAGE,电泳凝胶用四唑试剂染色,以确认和定位 GDH 氧化还原循环同工酶 [ 29 ]。如上所述进行 GDH 的对照提取,但不进行 DNase 和 RNase 处理。
2.3. 制备级聚丙烯酰胺凝胶纯化
为了纯化 GDH 多肽,合并含有 GDH 氧化还原循环同工酶的 Rotofor 级分(级分 3 - 8),并用固体 (NH 4 ) 2 SO 4沉淀至 55% 饱和度。将所得沉淀悬浮在 0.5 mM Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.5 中;并在 5˚C 下彻底透析以去除盐分。浓缩的 GDH 同工酶溶液用 SDS 制成 0.05%(体积/重量),在 55˚C 下加热 5 分钟以使六聚体同工酶单体化,然后加载到 Bio-Rad 491 型的 SDS-12% PAG 上制备细胞,并在 4˚C 下进行电泳(100 伏)。馏分收集速率为每 3.5 mL 馏分 20 分钟。通过用固体 (NH 4 )将级分饱和至 55% 来沉淀级分的蛋白质含量2 SO 4,然后离心(10,000 xg,30 分钟,5˚C)。将蛋白质沉淀溶解在 0.1 mL 的 10 mM Tris 碱溶液中并透析以去除 (NH 4 ) 2 SO 4。一半的透析蛋白通过分光光度法分析 GDH 胺化活性 [ 29 ];剩余一半用于SDS 12% PAGE(Bio-Rad Protean II xi电泳槽),电泳至蓝色标记染料位于凝胶底部。电泳凝胶用 Bio-Rads(Hercules,CA,USA)银试剂染色以显示蛋白质条带 [ 31 ],并进行照片记录。
2.4. 基于非遗传密码的 RNA 合成
对于 GDH 的 RNA 合成活性,从级分 3 到 8 的微型全凝胶洗脱 GDH 氧化还原循环同工酶被组合以给出如下三组:
第 1 组:酸性同工酶:组合级分 3 和 4。
第 2 组:弱酸性同工酶:组合级分 5 和 6。
第 3 组:中性同工酶:组合分数 7 和 8。
通过添加四种核糖-NTP(每种 0.6 mmol)、NH 4 Cl(100 µmol)、α -KG(50 µmol)和 NADH(0.2 µmol)、DNase 1(1 U)、放线菌素来制备每次测定的底物混合物D (2 µg),RNase 抑制剂 (10 U),最终体积用 0.1 M Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.0 补足至 1 mL。加入 1.0 mL GDH 同工酶溶液开始反应,然后在冷循环水浴中 16˚C 孵育过夜。每组 GDH 同工酶每毫升含有约 5 µg 蛋白质。蛋白质含量测定采用福林酚试剂,以牛血清白蛋白为标准 [ 32]. 通过酶的苯酚-氯仿 (pH 5.5) 提取终止 RNA 合成。用乙醇沉淀 RNA,短暂风干,然后溶解在 40 µL 分子生物学用水中。一式两份进行测定以验证结果的再现性。
2.5. 非遗传密码 RNA 酶对总 RNA 的降解
对于总RNA的降解,将10μg正常人胃总RNA(BioChain Inc., California)加入到喉GDH氧化还原循环同工酶合成的三组RNA酶各10μL中,制成总体积使用 10 mM Tris-HCl 缓冲溶液 pH 7.5 最多 50 µL。为每种 GDH 合成的 RNA 酶设置了具有 GDH 合成的 RNA 酶但没有总 RNA 的对照。六个反应如前所述进行热循环(Bio-Rad T100 热循环仪)[ 18]; 预热(96˚C,30 秒),然后冷循环(5˚C,1 分钟)和暖循环(37˚C,2 分钟)。在热循环结束时,反应保持在 5˚C。反应产物通过电泳(70 伏)15 µL 热循环反应溶液通过 1% 琼脂糖凝胶在 1xMOPS 缓冲溶液中与甲醛可视化。热循环反应产物在琼脂糖凝胶电泳(Bio-Rad sub-cell GT cell)之前没有热变性。电泳凝胶用溴化乙锭溶液染色,并拍照记录。
3. 结果
3.1. 电泳纯化的人 GDH 氧化还原循环同工酶
人 NADH-GDH 电泳酶学首先使用含有 DNase 1 和 RNase A 的缓冲液对组织进行均质化,以确保从粗提物中去除所有基于遗传密码的 DNA 和 RNA。然而,当提取缓冲溶液含有 DNase 1 和 RNase A 时获得的 NADH-GDH 氧化还原循环同工酶分布模式与提取缓冲溶液不含 DNase 1 和 RNase A 时相同(图 2). 因此,人类细胞的内源性 DNases 和 RNases 足以在 GDH 提取过程中降解基于遗传密码的 DNA 和 RNA。在从高等植物中提取 NADH-GDH 时,有必要将 RNase A 和 DNase 1 添加到提取缓冲液中,以确保从纯化的酶中去除基于遗传密码的 RNA 和 DNA [ 13 ]。喉上皮细胞的 28 种 NADH-GDH 氧化还原循环同工酶的二项式分布模式(图 2)不包含任何基于遗传密码的 RNA 或 DNA。人类 NADH-GDH 酶学(图 2)与哺乳动物和高等植物的 GDH 遗传结构完美协调 [ 12 ] [ 13 ] [ 29 ]]. GDH 由两个非等位基因(GDH 1和 GDH 2)组成,其中 GDH 1编码酸性更强的多肽 (a) 和 ( α ) 是杂合的和共显性的;和 GDH 2编码酸性较低的多肽 ( β ) 是纯合子 [ 10 ]。这三种多肽的二项式组合产生了复杂的六聚体同工酶系统 [ 13 ]。色谱物理化学并未将复杂的同工酶系统优雅地解析为具有生物化学活性的六聚体同工酶 [ 2 ] [ 6 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 28 ]]. 喉部 GDH 同工酶集中的 Rotofor 室 3、4、5、6、7 和 8 的 pI 值分别为 3.5、3.8、4.6、5.6、6.8 和 7.2,因此将同工酶大致分为酸性、温和适用于分子化学实验的酸性和中性基团。酸性同工酶的氧化还原同工酶组成与
图 2。从人喉上皮细胞电泳纯化(游离溶液等电聚焦)的谷氨酸脱氢酶氧化还原循环同工酶。提取缓冲溶液不含 RNase A 和 DNase 1。Rotofor 室 3、4、5、6、7 和 8 中喉 GDH 同工酶集中的 pI 值为 3.5、3.8、4.6、5.6、6.8 和 7.2分别。
弱酸性同工酶,这又不同于中性同工酶(图 2)。Rotofor 细胞的其他室含有可忽略不计的 NADH-GDH 六聚体同工酶活性。因此,游离溶液等电聚焦纯化产生了高度纯化和最佳产量的 NADH-GDH 氧化还原循环同工酶,这些同工酶被浓缩并聚焦到几个 Rotofor 室中。每个六聚体同工酶的紧凑性(图 2)证明 NADH-GDH 亚基多肽在纯化过程中没有发生降解断裂。12% PAG 景观上的 NADH-GDH 六聚体同工酶(图 2)没有发生解离,因为它们在 12% PAGE(在 5˚C 下进行)之前没有经过热处理。
可卡因、烟草、鸦片或大麻烟雾冷凝物的药代动力学中的第一个转运是在烟雾到达肺、胃和血流的过程中的喉上皮衬里 [ 19 ]。因此, 喉部 NADH-GDH 是精神活性化学物质作用的第一个部位, 使其成为分析化学依赖生化顺序的重要实验组织势在必行。
从 Rotofor 纯化的氧化还原循环同工酶中纯化 GDH 多肽表明,除了 Prep Cell 的空隙体积外,这些组分在α -KG 的还原胺化中具有活性;这意味着 Rotofor 分数 3 到 8 包含喉部 NADH-GDH。分子量约为 46 kDa的双酸性多肽 (a) 和 ( α ) 在 60 - 75 级分中从 Prep Cell 中洗脱(图 3)。分子量约为 66 kDa的酸性较低的多肽 ( β ) 在第 105 - 126 部分被洗脱,之后 Prep Cell 中不再存在其他多肽(图 3)。因此,与层析 GDH 相比,电泳得到了更纯的未降解 NADH-GDH [ 6 ]] [ 8 ]。
图 3。Prep Cell 纯化的人喉上皮 GDH 的蛋白质图谱。将含有 GDH 氧化还原循环同工酶的 Rotofor 级分合并,并通过 Bio-Rad 的 491 型 Prep Cell 的 SDS-12% PAG 进行纯化。制备来自 Prep Cell 的级分,并对 Bio-Rad 的 Protean II 细胞进行 SDS 12% PAG 电泳。电泳凝胶用 Bio-Rad 的银试剂进行银染。分数 1 - 20 是空隙体积;级分 21 - 57 含有 GDH 的降解多肽;级分 60 - 75 包含 (a) 和 ( α ) 多肽;级分 105 - 124 含有 GDH 的 ( β ) 多肽。分子量标记为磷酸化酶 b (97 KDa)、BSA (69 KDa)、卵清蛋白 (45 KDa)、碳酸酐酶 (30 KDa)、溶菌酶 (14 KDa)。
NADH-GDH 多肽在与强亲核药物分子、异生素等形成稳定的 GDH 连接的取代亚胺末端复合物后,在体内会定期降解[ 14 ]。这种 GDH 连接的取代亚胺末端复合物缺乏氧化还原循环活性。在制备细胞级分 25 - 57 中检测到的许多异常表观米氏胺化常数(K m和V max)归因于 GDH 的片段化多肽。在分数 25-57 中检测到的 GDH 多肽的片段化不是由电泳纯化过程引起的。在高等植物中,如体内使用抗GDH抗体通过蛋白质分析特异性检测到降解的GDH多肽,它们是比GDH多肽[ 14 ][ 33 ][ 34 ]低分子量的多肽。
3.2. GDH 合成 RNA 酶对人总 RNA 的降解
人胃总 RNA(底物)被喉表皮细胞 GDH 氧化还原循环同工酶合成的基于非遗传密码的 RNA 酶完全降解(图 4),类似于 RNA 酶对高等植物总 RNA 的降解 [ 17 ] [ 18 ]。喉部 GDH 合成的 RNA 酶的分子量范围很广,从 25 个碱基到 20,000 个碱基(图 4)。在化学反应机理中 [ 17],GDH合成的基于非遗传密码的RNA酶在侧翼非同源序列的引导下结合其靶标同源基于遗传密码的RNA(rRNA、microRNA、转移RNA、mRNA)作为底物,随后遗传密码被电磁降解基于 RNA 的 RNA,是两种不同电磁类型 RNA 中稳定性较差的一种 [ 18 ]。酶产物(总 RNA-非遗传密码 RNA 酶的转化)复合物在其解离之前通过 MOPS-琼脂糖凝胶上的简短电泳实时捕获(图 4)。酶产物复合物的条带暂时以比总 RNA(底物)和 GDH 合成的非遗传密码 RNA 酶条带更慢的速率迁移(图 4). 由于遗传密码对其施加的结构限制,总 RNA 的电热稳定性不如 GDH 氧化还原同工酶合成的基于非遗传密码的 RNA 酶 [ 18 ]。GDH 合成的 RNA 酶不是双链的,GDH 合成的 RNA 与总 RNA 之间的相互作用不是通过碱基配对,绝大多数 GDH 合成的 RNA 酶长于 25 个核苷酸,非遗传密码 RNA 酶的合成由GDH 不由任何类型的引物启动或终止,因此 GDH 合成的 RNA 酶降解总 RNA 的化学机制不是通过 RNAi 双链 ATP 依赖性切割 [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ]]. 此外,基于非遗传密码的 RNA 酶对基于遗传密码的 RNA 的降解不是通过脱嘌呤或脱嘧啶作用 [ 17 ]。基于遗传密码的 RNA 丰度在转录后由 NADH-GDH 合成的基于非遗传密码的 RNA 酶调节(图 4)。
图 4. 总 RNA-RNA 酶复合物。人类 GDH 氧化还原循环同工酶合成的基于非遗传密码的 RNA 酶对人类总 RNA 的降解。微管中的喉 GDH 氧化还原循环同工酶 (1) 酸性 (pI 3.5 - 3.8);(3) 弱酸性 (pI 4.6 - 5.6); (5)中性(pI 6.8 - 7.2)电泳纯化后制成合成RNA酶。将作为底物的胃总RNA加入含有由酸性GDH同工酶合成的RNA酶的微管(2)中;(4)含有弱酸性GDH同工酶合成的RNA酶;(6)含有中性GDH同工酶合成的RNA酶;用 0.05 M Tris-HCl 缓冲溶液 pH 8.0 将最终体积配制成 50 µL。将不含基于非遗传密码的 RNA 酶的总 RNA 设置为对照。七根管子进行了热循环。
喉GDH的酸性、弱酸性和中性同工酶合成的RNA酶降解全部胃总RNA(图4 )。由于总 RNA 是转录组的非常复杂的混合物,由 GDH 氧化还原循环同工酶合成的 RNA 酶必须在一级和二级结构、多样性、拷贝数和空间/时间群体分布模式方面同样复杂,以便它们降解整个转录组。与总 RNA 形成鲜明对比的是,琼脂糖凝胶中缺乏明确的条带模式,证明了 GDH 合成的 RNA 酶在结构和群体分布方面前所未有的多样性(图 4)。
4。讨论
所有基于遗传密码的 RNA(tRNA、rRNA、siRNA、microRNA、包括编码转录因子的 mRNA 等)都是由 GDH 氧化还原循环同工酶合成的基于非遗传密码的 RNA 酶的底物 [ 16 ]]. GDH 合成的 RNA 酶与环境条件与生化途径的对齐有关,因此细胞、组织和整个生物体在程序化的发育、分化、生长、繁殖和衰老转变过程中根据可用的环境资源调整它们的能量需求。因此,非遗传密码RNA酶在遗传密码调控的生化等级中处于第四位;第一、第二和第三顺序分别在染色体 DNA(复制、转录)、RNA(翻译和双链 RNA 沉默)和蛋白质(酶)水平(图 5)。
图 5。物质依赖性分子化学的扩展性:GDH 合成的基于非遗传密码的 RNA 酶(第 4 阶)立足点的图形表示;在依赖性预后的等级序列中的其他生化顺序中:蛋白酶(第 3顺序)、总 RNA(第 2顺序)和染色体 DNA(第 1顺序)。
强亲核试剂对α -KG 与 GDH 活性位点之间形成的席夫碱复合物的质子化 N 的攻击是 GDH 多肽降解的关键步骤,对于从头开始GDH多肽的合成。新的多肽可能与降解的多肽不完全相同,从而产生新的 GDH 氧化还原循环同工酶库,具有合成新的基于非遗传密码的 RNA 酶库的特性,这些酶将识别一些预先存在的 mRNA、rRNA、转移 RNA、siRNA 等不必要的和多余的,从而降解它们。与新化学环境相一致的新生化途径将出现在细胞、组织和器官中,从而产生生物体的新生化变体。这些是吸食烟草(尼古丁作为亲核试剂)、罂粟(异喹啉生物碱作为亲核试剂)、大麻(四氢大麻酚作为亲核试剂)、可卡因(神经卡因作为亲核试剂)或酗酒者(乙醇作为亲核试剂)的人发生的部分生化变化.13 ] [ 16 ]。
因此,物质/化学品依赖患者是不同的生化/代谢变体。这就是为什么他们很难戒掉毒瘾。有化学依赖的人继续使用麻醉药品或酒精,即使知道继续使用会对他们的身体、家庭、财务和生活的所有其他方面造成损害。药物依赖是一种原发性疾病,其中一个人对麻醉药品上瘾。他们的身体在化学上依赖于麻醉剂,因为他们的生化途径已经改变。化学依赖是一种全球性的医学和社会流行病,但其研究主要集中在大脑和中枢神经系统 [ 23 ] 以及计算基因组学 [ 38 ]]. 烟草中有超过 7000 种不同的化学物质,其中大部分是亲核试剂和危险物质。因此,每年有超过 440,000 人死于吸烟和吸入麻醉烟雾 [ 19 ]。吸食罂粟、大麻、可卡因等会导致类似大流行病的化学/物质依赖性和死亡率。
与 GDH 合成的 RNA 酶同源的 mRNA 队列的降解可能表明该机制 [ 17 ] [ 18 ] 也参与了化学依赖和糖尿病的生化进程。在花生中,尽管环境条件恶劣 [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] ,但描述作物物种产生最高种子、氨基酸和脂肪酸产量能力的 mRNA 组群高达 800个。在黑眼豆中,描述作物物种产生最高干粮产量能力的 mRNA 队列超过 60,尽管环境条件恶劣 [ 16 ]]. 人类 GDH 合成的 RNA 酶在植物中降解人类总 RNA(图 4)的能力表明 RNA 酶将降解编码不同生化途径中不同酶的同源 mRNA 群。描述植物物种在环境条件下生存能力的 mRNA 队列类似于描述人类死于化学依赖性疾病条件的能力的 mRNA 队列。这些是 GDH 合成的非遗传 RNA 酶引入分子化学的一些差异,用于研究 mRNA 引起的疾病队列中的基因组以及 mRNA 的核苷酸序列。而 mRNA、转移 RNA、rRNA 等(图 5) 是基因组的电磁反射;蛋白质也是 mRNA 的电磁镜像;GDH 合成的 RNA 酶是不同的,因为它们与染色体 DNA 编码模板无关。疾病状况并不总是由单个基因的故障引起的。使人酗酒或导致化学依赖的原因可能不是单个基因的故障,而可能包括在 GDH 氧化还原循环同工酶控制下的一组 mRNA 的故障。通过同源 GDH 合成的 RNA 酶降解 mRNA 是一种统计化学反应,它取决于底物和酶分子的结构、相对浓度和时间分布 [ 40 ] [ 41 ]]. 酒精中毒和药物滥用的病因和预后很复杂,因为除了麻醉剂 [ 1 ] - [ 6 ] [ 19 ] [ 20 ]对神经系统中神经传递的抑制,以及与酒精中毒相关的生化途径的潜在改变GDH 合成基于非遗传密码的 RNA 酶,新兴的计算基因组学研究结果表明,染色体 DNA 的非编码部分参与进食障碍的加重 [ 38 ]。这使本已无法解释的药物滥用现象更加复杂。基于非遗传密码的 RNA 酶(第 4阶)、蛋白质酶(第 3阶)、总 RNA(第2顺序)和染色体 DNA(第一顺序)因此是不可或缺的参与者,在物质依赖的分级进展、调节和管理中被麻醉药物加重的风险很高(图 5)。
因此,分子化学在生物现象研究中应用的创新优势在于,被基于同源非遗传密码的 RNA 酶降解的 mRNA 队列不同于通过计算和数学研究的转录和蛋白质网络。建模 [ 42 ] [ 43 ] 因为 mRNA 队列是研究生化途径整合/区分调节的实验数据;它们基于化学,这是一门没有假阳性和假阴性结果的精确科学。多余 mRNA 的降解(图 4) 由 NADH-GDH 合成的基于非遗传密码的 RNA 酶随后协调几种生化途径首先被描述为基于 GDH 的胺化米氏常数的信号辨别/整合功能 [ 14 ]。α -KG 到 L-glu 的看家循环氧化还原转化是激活 NADH-GDH 的六聚体同工酶在胺化方向合成 plus-RNA,但在脱氨方向合成 minus-RNA的稳态环境 [ 16 ]图1). 新的非遗传密码 RNA 酶池的合成,以及随着 NADH-GDH 的亲核化学环境变化而导致的同源多余 mRNA 的降解,为准确模拟生化途径对化学/物质超过剂量的反应创造了差异化参数和成瘾疾病状况。
上述情况表明,物质依赖的干预和治疗方法必须复杂、详尽,并包括医学、分子化学、生物技术、计算、社会学和教育投入,以便取得积极成果。
5.结论
通过电泳纯化获得的人GDH氧化还原循环同工酶种群分布模式与GDH 1和GDH 2酶的基因结构一致,GDH合成的RNA酶跨越宽范围(25个碱基 - 20K个碱基)分子量。Prep Cell 聚丙烯酰胺凝胶纯化证实 Rotofor 等电聚焦产生纯 GDH 氧化还原循环同工酶,该过程可能成为尼古丁、大麻素、阿片类药物、可卡因过量和成瘾的生化诊断的创新方法和范式转变。疾病状况的准确诊断导致用于疾病状况管理的适当程序。
致谢
谷氨酸脱氢酶研究项目由 USAD/NIFA 提供给大学的赠款赞助。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
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